CN103087981B - 一种诱导成熟细胞去分化的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种诱导成熟细胞去分化的方法。本发明提供的诱导成熟细胞去分化的方法，包括如下步骤：将成熟细胞在固体培养基中进行培养，得到球状细胞，所述球状细胞具有胚胎干细胞全能性；所述固体培养基为将2×DMEM基础培养基与凝固剂混合，得到固体培养基。本发明的实验证明，本发明将具有分化功能的HEK293细胞通过低贴附表面的培养方法，人胚胎肾上皮细胞系HEK293以三维立体球状生长，实验结果表明三维球状培养的HEK293细胞发生了去分化，获得了胚胎干细胞和肾脏前体细胞的特性。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种诱导成熟细胞去分化的方法。
背景技术
去分化是指将已分化的细胞类型转化为另一较原始的具备更多分化潜能的细胞类型，如类似胚胎干细胞或前体细胞的状态。去分化的研究对于细胞生物学的科学研究和干细胞的临床应用方面都具有重要意义。目前去分化研究主要采取转基因的方法，但是由于基因组的改变，细胞面临癌变的风险。细胞命运不仅受内部基因的调控，外部环境的影响也是很关键的，如能通过物理手段调控细胞微环境实现细胞去分化将避免转基因去分化所带来的细胞癌变风险。
发明内容
本发明的目的是提供一种诱导成熟细胞去分化的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：将成熟细胞在哺乳动物细胞固体培养基中进行培养，得到球状细胞，实现诱导成熟细胞去分化；
所述哺乳动物细胞固体培养基为将哺乳动物细胞液体培养基与凝固剂混合，得到固体培养基。
上述方法中，所述哺乳动物细胞液体培养基可以根据培养的细胞不同进行选择，本发明培养HEK293细胞，因此选用的哺乳动物细胞液体培养基为2×DMEM基础液体培养基；
所述凝固剂为琼脂糖；凝固剂的加入量只要凝固即可，本发明的实施例为等体积的2×DMEM基础培养基和1%琼脂糖溶液混匀。
所述琼脂糖为质量百分含量为1%琼脂糖水溶液；
所述2×DMEM基础液体培养基与质量百分含量为1%琼脂糖水溶液混合体积比为1:1。
上述方法中，所述培养为将所述成熟细胞接种到装有所述哺乳动物细胞固体培养基的培养容器上进行培养；
所述培养的条件如下：在37℃、5%CO2培养。
上述方法中，所述培养的时间为5-10天；
所述培养容器为培养皿；
所述成熟细胞与所述固体培养基的配比为106-6×106个/5ml。
上述方法中，所述成熟细胞为HEK293细胞。
上述方法中，所述球状细胞具有胚胎干细胞全能性，但不是人胚胎干细胞；所述胚胎干细胞全能性具体体现在如下1)-5)中至少一种：
1）提高iPS重编程转录因子的相对表达量；
所述iPS重编程转录因子具体为OCT4、NANOG、SOX2、KLF4和/或LIN28；
2）提高胚胎干细胞标志物的相对表达量；
所述胚胎干细胞标志物具体为REX1、TDGF1、LEFTB、EBAF、GRB7、PODXL和/或FGF4；
3）提高三胚层标志物的相对表达量；
所述三胚层标志物为内胚层标志物FoxA2、Afp、Sox17和Pdx-1中的至少一种、中胚层标志物Brachyury、Msx1中的至少一种和/或外胚层标志物Nestin、Otx2和Tp63中的至少一种；
4）提高细胞成瘤能力；
5）提高肾脏组织前体标志物相对表达量。
所述肾脏组织前体标志物为PAX2、WT1、INTEGRINa8、SALL1、LIM1、NCAMl、SIX2、FRIZZLED 2、FRIZZLED 7、ACVR2b/或NTRK2。
由上述方法得到的球状细胞也是本发明保护的范围。上述球状细胞具有胚胎干细胞全能性，但不是人胚胎干细胞；所述胚胎干细胞全能性具体体现在如下1)-5)中至少一种：
1）提高iPS重编程转录因子的相对表达量；
2）提高胚胎干细胞标志物的相对表达量；
3）提高三胚层标志物的相对表达量；
4）提高细胞成瘤能力；
5）提高肾脏组织前体标志物相对表达量。
本发明的实验证明，本发明将具有分化功能的HEK293细胞通过低贴附表面的培养方法，人胚胎肾上皮细胞系HEK293以三维立体球状生长，实验结果表明三维球状培养的HEK293细胞发生了去分化，获得了胚胎干细胞和肾脏前体细胞的特性。
附图说明
图1为细胞在二维贴壁培养皿和在低贴附培养皿上培养结果
图2为细胞在二维培养和低贴附培养后iPS重编程转录因子和胚胎干细胞标志物的相对表达量
图3为细胞在二维培养和低贴附培养后内胚层标志物、中胚层标志物和外胚层标志物的相对表达量
图4为细胞在二维培养和低贴附培养后致瘤能力
图5为细胞在二维培养和低贴附培养后肾组织前体细胞标志物的相对表达量
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、诱导成熟细胞发生去分化形成具有干细胞功能细胞
一、诱导成熟细胞发生去分化形成具有干细胞功能细胞方法
1、低贴附培养皿的制备
配制2×DMEM基础液体培养基：将13.4g高糖培养基粉末(Gibco)和3.7g碳酸氢钠用500ml去离子水溶解，0.22μ滤膜过滤除菌，得到2×DMEM基础培养基。
上述高糖培养基粉末购自Gibco。
2×DMEM基础液体培养基也可以按照如下配置：用水将下述物质溶解成如下浓度，并补足体积为1L：无水氯化钙（2H2O）265.00mg/L、L-丝氨酸42.00mg/L、硝酸铁（9H2O）0.10mg/L、L-苏氨酸95.00mg/L、氯化钾400.00mg/L、20L-色氨酸16.00mg/L、无水硫酸镁97.67mg/L、L-酪氨酸72.00mg/L、氯化钠6400.00mg/L、L-缬氨酸94.00mg/L、无水磷酸二氢钠109.00mg/L、D-泛酸钙4.00mg/L、丁二酸75.00mg/L、酒石酸胆碱7.20mg/L、丁二酸钠100.00mg/L、叶酸4.00mg/L、L-盐酸精氨酸84.00mg/L、肌醇7.20mg/L、L-盐酸胱氨酸63.00mg/L、烟酰胺4.00mg/L、甘氨酸30.00mg/L、核黄素0.40mg/L、L-盐酸组氨酸42.00mg/L、盐酸硫胺4.00mg/L、L-异亮氨酸105.00mg/L、盐酸吡哆辛4.00mg/L、L-亮氨酸105.00mg/L、葡萄糖1000.00mg/L、L-盐酸赖氨酸146.00mg/L、丙酮酸钠110.00mg/L、L-甲硫氨酸30.00mg/L、酚红9.30.00mg/L、L-苯丙氨酸66.00mg/L和碳酸氢钠7.4g/L。
低贴附培养基皿的制备：将2×DMEM基础培养基预热至37°C，然后配制1%琼脂糖溶液。将等体积的2×DMEM基础培养基和1%琼脂糖溶液混匀，倒入60mm petri dish,5ml/dish。随着温度下降，2×DMEM基础液体培养基和1%琼脂糖溶液混合物会凝成胶状，附着在培养皿底部，形成低贴附的表面，得到装有低贴附固体培养基的低贴附培养基皿。
二维贴壁培养皿的制备：将含有10%（质量百分含量）血清(Gibco)的DMEM培养基(Gibco)预热至37°C，然后配制1%琼脂糖溶液。将等体积的含有10%（质量百分含量）血清(Gibco)的DMEM培养基(Gibco)和1%琼脂糖溶液混匀，倒入60mm petri dish,5ml/dish。随着温度下降，含有10%（质量百分含量）血清(Gibco)的DMEM培养基(Gibco)和1%琼脂糖溶液混合物会凝成胶状，附着在培养皿底部，形成二维贴壁培养皿。
2、诱导成熟细胞发生去分化形成具有干细胞功能细胞
成熟细胞为HEK293细胞，购自北京协和细胞中心，HEK293细胞源自人胚胎肾上皮，认为是终端分化的细胞，不具有干细胞的分化能力。
将诱导成熟细胞发生去分化形成具有干细胞功能细胞采用成球培养，并以常规的单层细胞培养为对照。
成球培养组：采用如下的低贴附的培养：
将HEK293细胞按照每6×106个细胞接种到低贴附培养皿上，37℃，5%CO2培养箱中培养；细胞每隔一天使用含有1mM EDTA的0.25%胰蛋白酶消化进行1：3传代；培养5天后，得到三维球状结构HEK293细胞。
单层培养组：将HEK293细胞按照每6×106个细胞接种到二维贴壁培养皿上，37℃,5%CO2培养箱中培养；细胞每隔一天使用含有1mM EDTA的0.25%胰蛋白酶消化进行1：3传代；培养5天后，得到二维贴壁培养HEK293细胞。
上述去成球培养组和单层培养组培养5天后，电子显微镜观察（标尺为200μm）细胞生长状态，结果如图1所示，图1A为细胞在二维贴壁培养皿上培养结果（去分化组），图1B为细胞在低贴附培养皿上培养结果（常规培养对照组），图1A中可以看出，细胞在二维贴壁培养皿上成单层上皮样生长；图1B可以看出，在低贴附的培养下形成三维球状结构。
二、检测三维球状结构细胞为具有干细胞功能细胞
1、iPS重编程转录因子和胚胎干细胞标志物的定量PCR检测
iPS重编程转录因子在细胞重编程的过程中发挥重要的作用，许多成体干细胞也有不同程度的这些因子的表达，因此这些转录因子在一定程度上可以反应细胞干细胞特性。
使用Trizol(Invitrogen)分别提取单层培养组（二维培养）得到的二维贴壁培养HEK293细胞和成球培养组（三维球状培养）得到的三维球状结构HEK293细胞的mRNA，残余的DNA使用DnaseI(Invitrogen)消化，采用SuperScript III First-StrandSynthesis System进行反转录(Invitrogen)，得到cDNA。
以上述各组cDNA为模板，采用Power SYBR Green RT-PCR Kit(Applied Biosystems)进行荧光定量PCR反应，检测iPS重编程转录因子OCT4、NANOG、SOX2、KLF4和LIN28的相对表达量。
转录因子OCT4的荧光定量PCR引物为：
上游CCCCTGGTGCCGTGAAG
下游GCAAATTGCTCGAGTTCTTTCTG
转录因子NANOG的荧光定量PCR引物为：
上游CCAAAGGCAAACAACCCACTT
下游CGGGACCTTGTCTTCCTTTTT
转录因子SOX2的荧光定量PCR引物为：
上游CCCCTTTATTTTCCGTAGTTGTATTT
下游GATTCTCGGCAGACTGATTCAA
转录因子KLF4的荧光定量PCR引物为：
上游CATCTTGTGAGTGGATAATCAGGAA
下游GACCCCATCTGTTCTTTGATTTTT
转录因子LIN28的荧光定量PCR引物为:
上游AGCCCAAGAAGTGCCACTTCT
下游GGGCCTTCAGCGGACAT
内参基因为GAPDH的荧光定量PCR引物为
上游ATGGAAATCCCATCACCATCTT
下游CGCCCCACTTGATTTTGG
结果如图2A（以二维组相对表达量为1；相对表达量为相对于内参的表达量；其他基因的倍数为相对于二维组相对表达量的倍数）所示，与二维贴壁培养HEK293细胞相比，三维球状结构HEK293细胞中的iPS重编程转录因子OCT4、NANOG、SOX2、KLF4和LIN28的相对表达量显著上调了，说明该细胞具有了一定干细胞特性。
以上述各组cDNA为模板，采用Power SYBR Green RT-PCR Kit(Applied Biosystems)进行荧光定量PCR反应，检测胚胎干细胞标志物REX1、TDGF1、LEFTB、EBAF、GRB7、PODXL和FGF4的相对表达量。
胚胎干细胞标志物REX1的荧光定量PCR引物为：
上游TCCAAGACTACCACCACCATCAT
下游TTCTTTAAACTCTGTAAGGATGGACTGT
胚胎干细胞标志物TDGF1的荧光定量PCR引物为：
上游ACGATGTGCGCAAAGAGAACT
下游TGGGCAGCCAGGTGTCA
胚胎干细胞标志物LEFTB的荧光定量PCR引物为：
上游GAGCTGGCGATGACTGAACTG
下游GCAAATTCAGGGCTCACTAGAGA
胚胎干细胞标志物EBAF的荧光定量PCR引物为：
上游CATTTTCAGCTGGGAGTTTCTGT
下游GGGTATTATTGTTCCAGACTCAGTGA
胚胎干细胞标志物GRB7的荧光定量PCR引物为：
上游TCTACGGGATGCCCACTGA
下游GGCCATTTCGAAGCTTGTTG
胚胎干细胞标志物PODXL的荧光定量PCR引物为：
上游CTTTTATGGGCTCGGCAGTTA
下游TCACCATGCCCACTGCTTAG
胚胎干细胞标志物FGF4的荧光定量PCR引物为：
上游AGTACCCCGGCATGTTCATC
下游CGGTTCCCCTTCTTGGTCTT
内参基因为GAPDH，序列同上。
结果如图2B所示（以二维组相对表达量为1；相对表达量为相对于内参的表达量；其他基因的倍数为相对于二维组相对表达量的倍数），与二维贴壁培养HEK293细胞相比，三维球状结构HEK293细胞中的胚胎干细胞标志物REX1、TDGF1、LEFTB、EBAF、GRB7、PODXL和FGF4有显著上调。
从上述可以看出，HEK293细胞在三维成球条件下发生了细胞重编程并获得了类似胚胎干细胞的特性。
2、三胚层标志物的定量PCR检测
胚胎干细胞的一个重要特性是可以发育为三个胚层各个谱系的细胞。鉴于HEK293在三维培养条件下获得了类似胚胎干细胞的特性，检测其是否也具有向三个胚层发育的能力和趋势。
提取二维贴壁培养HEK293细胞（单层培养HEK293细胞）和三维球状结构HEK293细胞（成球培养HEK293细胞）的mRNA，反转录得到cDNA。分别以上述cDNA为模板，采用Power SYBR Green RT-PCR Kit(Appl ied Biosystems)进行荧光定量PCR反应，检测内胚层标志物FoxA2、Afp、Sox17和Pdx-1、中胚层标志物Brachyury和Msx1、外胚层标志物Nestin,Otx2和Tp63的相对表达量。
内胚层标志物FoxA2的荧光定量PCR引物为
上游CTGAAGCCGGAACACCACTAC
下游CGAGGACATGAGGTTGTTGATG
内胚层标志物Afp的荧光定量PCR引物为
上游CCAACAGGAGGCCATGCTT
下游GAGAATGCAGGAGGGACATATGT
内胚层标志物Sox17的荧光定量PCR引物为
上游TGGCGCAGCAGAATCCA
下游CGACTTGCCCAGCATCTTG
内胚层标志物Pdx-1的荧光定量PCR引物为
上游TGCCTTTCCCATGGATGAA
下游TGCCCACTGGCCTTTCC
中胚层标志物Brachyury的荧光定量PCR引物为
上游GCTGTGGCTGCGCTTCA
下游TCCTCCTGCCGTTCTTGGT
中胚层标志物Msx1的荧光定量PCR引物为
上游CTCGCTCAGCCTCACTGAGA
下游GGCGGCCATCTTCAGCTT
外胚层标志物Nestin的荧光定量PCR引物为
上游AGCCCTGACCACTCCAGTTTAG
下游CCCTCTATGGCTGTTTCTTTCTCT
外胚层标志物Otx2的荧光定量PCR引物为
上游TCGGGCGCAGCTAGATGT
下游TGTCTGGGTACCGGGTCTTG
外胚层标志物Tp63的荧光定量PCR引物为
上游TTTCCCACCCCGAGATGA
下游TGCGGCGAGCATCCAT
内参基因为GAPDH，引物序列同上。
结果如图3所示（以二维组相对表达量为1；相对表达量为相对于内参的表达量；其他基因的倍数为相对于二维组相对表达量的倍数），与二维贴壁培养HEK293细胞相比，三维球状结构HEK293细胞中的显示早期胚胎发育过程中内胚层标志物FoxA2、Afp、Sox17和Pdx-1、中胚层标志物Brachyury和Msx1、外胚层标志物Nestin、Otx2和Tp63均有显著上调。
3、裸鼠成瘤能力的检测
胚胎干细胞注射到裸鼠体内可以形成畸胎瘤。
检测了三维球状结构HEK293细胞（成球培养HEK293细胞）的裸鼠成瘤能力，以二维贴壁培养HEK293细胞（单层培养HEK293细胞）为对照。
具体实验如下：
实验选用了Balb/c裸鼠（购自维通利华，品系名称401），实验分三组：1、二维贴壁培养HEK293细胞；2、三维球状结构HEK293细胞；3、三维球状结构HEK293细胞经胰酶消化后的单细胞。每只老鼠的注射量均为5×105个细胞，每个实验组的样本容量均为7只老鼠。注射后8周成瘤。
结果如图4所示，二维贴壁培养HEK293细胞没有致瘤能力（图4A）；三维球状结构HEK293细胞成功诱导3只裸鼠成瘤（图4B）；消化为单个细胞的三维球状结构HEK293细胞诱导1只裸鼠形成肿瘤。
统计实验结果如下表1所示，可见三维球状结构HEK293细胞具备了裸鼠成瘤能力，说明成球培养可以促进HEK293细胞形成具有干细胞功能的细胞。
表1为形成肿瘤小鼠数目占实验组数目的比例
4、肾脏组织前体标志物检测
由于HEK293细胞来源于肾脏组织，通过检测三维成球培养细胞的肾脏组织前体标志物，检测是否有向肾脏组织前体细胞分化的能力。
提取二维贴壁培养HEK293细胞（单层培养HEK293细胞）和三维球状结构HEK293细胞（成球培养HEK293细胞）的mRNA，反转录得到cDNA。分别以上述cDNA为模板，采用Power SYBR Green RT-PCR Kit(Appl ied Biosystems)进行荧光定量PCR反应，检测肾组织前体细胞标志物PAX2、WT1、INTEGRIN a8、SALL1、LIM1、NCAM1、SIX2、FRIZZLED 2、FRIZZLED 7、ACVR2b和NTRK2的相对表达量。
肾组织前体细胞标志物PAX2的荧光定量PCR引物为：
上游CGTCTCTTCCATCAACAGAATCAT
下游GGCGTTGGGTGGAAAGG
肾组织前体细胞标志物WT1荧光定量PCR引物为：
上游CCACACAACGCCCATCCT
下游GAAGACACCGTGCGTGTGTATT
肾组织前体细胞标志物INTEGRIN a8的荧光定量PCR引物为：
上游AGCCAGCAAAACTCCCAGAA
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肾组织前体细胞标志物SALL1的荧光定量PCR引物为：
上游GGTGGCATCCCTCCAATTC
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肾组织前体细胞标志物LIMl的荧光定量PCR引物为：
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肾组织前体细胞标志物NCAM1的荧光定量PCR引物为：
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肾组织前体细胞标志物SIX2的荧光定量PCR引物为：
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肾组织前体细胞标志物FRIZZLED 2的荧光定量PCR引物为：
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肾组织前体细胞标志物FRIZZLED 7的荧光定量PCR引物为：
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肾组织前体细胞标志物ACVR2b的荧光定量PCR引物为：
上游CAGCATATTGCTCTACTGTATCACAAAC
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肾组织前体细胞标志物NTRK2的荧光定量PCR引物为：
上游GGTCTTCGTCGATTAATACCTTGTG
下游CTGCTCTACCTATCAGGGAAACG
内参基因为GAPDH，引物序列同上。
结果如图5所示，与二维贴壁培养HEK293细胞相比，三维球状结构HEK293细胞中的肾组织前体细胞标志物PAX2、WTl、INTEGRIN a8、SALL1、LIM1、NCAM1、SIX2、FRIZZLED 2、FRIZZLED 7、ACVR2b和NTRK2的相对表达量显著上调。
可以看出，通过三维培养，HEK293发生了肾脏组织特异性的去分化（通过肾组织前体细胞标志物的上调体现）。
Claims (4)
1.一种诱导成熟细胞去分化的方法，包括如下步骤：将成熟细胞在哺乳动物细胞固体培养基中进行培养，得到球状细胞，实现诱导成熟细胞去分化；
所述哺乳动物细胞固体培养基为将哺乳动物细胞液体培养基与凝固剂混合，得到固体培养基；所述培养为将所述成熟细胞接种到装有所述固体培养基的培养容器上进行培养；
所述培养的条件如下：在37℃、5%CO2培养；所述培养的时间为5-10天；所述培养容器为培养皿；
所述成熟细胞为HEK293细胞；所述成熟细胞与所述哺乳动物细胞固体培养基的配比为106-6×106个/5ml；
哺乳动物细胞液体培养基为2×DMEM基础液体培养基；所述凝固剂为琼脂糖。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述球状细胞具有胚胎干细胞全能性；所述胚胎干细胞全能性体现在如下1)-5)中至少一种：
1）提高iPS重编程转录因子的相对表达量；
2）提高胚胎干细胞标志物的相对表达量；
3）提高三胚层标志物的相对表达量；
4）提高细胞成瘤能力；
5）提高肾脏组织前体标志物相对表达量。
3.由权利要求1或2所述方法得到的球状细胞。
4.根据权利要求3所述的球状细胞，其特征在于：所述球状细胞具有胚胎干细胞全能性；所述胚胎干细胞全能性具体体现在如下1)-5)中至少一种：
1）提高iPS重编程转录因子的相对表达量；
2）提高胚胎干细胞标志物的相对表达量；
3）提高三胚层标志物的相对表达量；
4）提高细胞成瘤能力；
5）提高肾脏组织前体标志物相对表达量。
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