CN103081868A - hSCARB2基因转殖鼠的制造及其做为肠病毒感染动物模式的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明是关于EV71接受体SCARB2基因转殖鼠的制造，本发明所制得的SCARB2基因转殖鼠可做为手足口病，例如肠病毒71型或克沙奇病毒16型(Coxsackie A16)感染的动物模式，以供评估肠病毒疫苗免疫保护功效，及肠病毒感染的病理研究上的应用。
Description
技术领域
本发明是关于肠病毒感染动物模式的制备，更特别地是关于SCARB2基因转殖鼠的制造，以及其做为手足口病的动物模式上的应用。
背景技术
肠病毒71型(EV71)已被证实会引起手足口病(HFMD)、疱疹性咽峡炎，和神经系统的病变如无菌性脑膜炎、脑炎及类小儿麻痹症候群，甚至在婴幼儿造成致死疾病，并且在全世界爆发严重的疫情(AbuBakar et al.，1999，Virus Res 61(1)，1-9；Chang，Huang，and Lin，1998，Lancet 352(9125)，367-8；Bible et al.，2007，RevMed Virol 17(6)，371-9)。及至今日，透过公共卫生对肠病毒71型疫情的控制与医疗照护仍显不足。目前并没有疫苗可供临床适用。因此，研究肠病毒71型感染的机制，以供开发有效的治疗药物或预防性疫苗实属重要。
现已知有多种动物模式被发展，欲应用于研究EV71感染的致病原因(参见，例如Chen et al.，2004，J Gen Virol 85(Pt 1)，69-77；Nagata et al.，2004，J Gen Virol85(Pt 10)，2981-9；Ong et al.，2008，J Neuropathol Exp Neurol 67(6)，532-42；Wenget al.，2010，Infect 12(7)，505-10)。而目前使用的肠病毒动物模式，是利用新生一天大的ICR小鼠，以EV71感染进行人为发展而得，新生的ICR小鼠在EV71感染后会出现后肢麻痹，并且最后在受感染2周内死亡(Wu et al.，2001，Vaccine20(5-6)，895-904)。然而，由于该ICR小鼠仅适用于，评估小鼠对于肠病毒感染或疫苗引起的免疫反应，无法真正模拟在人类受到感染后所引发的免疫反应。同时，由于该小鼠模式并未呈现肠病毒感染后的HFMD症状，故利用其所进行的研究观察只局限于，肠病毒感染后小鼠的存活率及神经性毒性，无法确实应用在评估药物或疫苗，对于肠病毒感染的治疗及/或预防功效。此外，目前使用的ICR小鼠因为免疫系统发育不全，可能无法充分反应肠病毒EV71的毒性，及了解其对于神经系统的影响。
再者，目前使用的ICR小鼠是利用小鼠适应过的肠病毒株(mouse-adaptedEV71 strain，参见Wang et al.，2004，J Virol 78(15)，7916-24)进行感染试验，但由于该病毒并没有存在于自然界，故无法使受感染的ICR小鼠表现出真正的，天然流行肠病毒株感染后应有的HFMD症状及神经性毒性(Perez-Velez et al.，2007，Clin Infect Dis 45(8)，950-7)。且经研究发现，以自然界流行的肠病毒株感染已知的成年ICR、Balb/c、CH3、C57BL/6等实验用小鼠(这些皆不表现EV71接受体)后，都完全不会引起HFMD症状及神经性毒性(Wang，2004，如前述；Chen et al.，2004，J Gen Virol 85(Pt 1)，69-77)。
近来研究发现，人类清道夫接受体B类，膜蛋白质2型(human scavengerreceptor class B，member 2；hSCARB2)是肠病毒71型及克沙其病毒16型(Coxsackie A16)进入细胞的接受器(Yamayoshi et al.Nat Med 15(7)：798-801，2009)，虽然小鼠SCARB2与人类SCARB2(hSCARB2)具有85.8％同源性，但显示其不作为EV71的受体。本发明遂建立hSCARB2基因转殖鼠作为肠病毒实验动物感染模式，以期仿真肠病毒的感染途径，研究其引起手足口病和神经系统病变的致病机转，并藉以评估肠病毒疫苗在此动物模式中的免疫保护效力，以及候选治疗性药物或疫苗对于肠病毒感染的防治功效，以增进对肠病毒感染致病机制的了解，以及应用于有效肠病毒疫苗的研发。
发明内容
本发明是基于发现，人类清道夫接受体B类，膜蛋白质2型(以下简称SCARB2)为肠病毒进入细胞的接受器，遂建立SCARB2基因转殖鼠作为肠病毒71型实验动物感染模式，应用于研究EV71引起的神经系统病变机转，及分析EV71疫苗的保护作用，以开发有效的治疗药物或是预防肠病毒感染相关疾病的疫苗。
于是，本发明一方面是关于，一种制造SCARB2基因转殖鼠的方法，其包含：将经由微注射入受Elongation factor-1启动子(EF-1αpromoter)驱动的人类SCARB2蛋白基因(SEQ ID NO.1)的小鼠胚胎，转殖到同品系母鼠中使其发育成鼠；利用PCR分析筛检出带有SCARB2蛋白基因型的阳性小鼠，与原生型同品系小鼠互相交配，生成F0小鼠；再次以PCR分析筛选出其基因型为异核型(heterozygous)的阳性F0小鼠，并使呈阳性F0小鼠互相交配生成F1小鼠；利用PCR分析筛选得其基因型为同核型(homozygous)的阳性F1小鼠，而得SCARB2基因转殖鼠；以及利用RT-PCR分析确认F1基因转殖鼠在主要器官表达SCARB2蛋白。
于本发明的一具体实施例，用于基因转殖的小鼠是C57BL/6小鼠。于本发明的另一具体实施例，用于基因转殖的小鼠是FVB小鼠。
本发明的SCARB2基因转殖鼠于自然界流行的肠病毒株感染后，会呈现手足口病(HFMD)的症状和神经系统的病变。因此，该SCARB2基因转殖鼠可应用做为手足口病的动物模式。于本发明的一具体实施例，其是用做为肠病毒71型的感染动物模式。于本发明的另一具体实施例，其是用做为克沙奇病毒16型(Coxsackie A16)的感染动物模式。
于另一方面，本发明是关于一种检测肠病毒疫苗保护效力的方法，利用上述制造SCARB2基因转殖鼠的方法所制得的hSCARB2基因转殖鼠为动物模式，评估候选肠病毒疫苗在疫苗接种后施予肠病毒攻毒时，对于已受免疫的hSCARB2基因转殖鼠所产生的抗病毒保护效力。
于另一方面，本发明是关于一种筛选出可有效预防或治疗因肠病毒感染所引起的手足口病的疫苗或药物的方法。于本发明的一具体实施例，该药物为一种预防性疫苗。于本发明的另一具体实施例，该药物为一种抗-肠病毒71型的中和抗体。
附图说明
图1为用于本发明方法的携带有人类基因的表现载体pEF-1α-hSCARB2的图谱。
图2显示藉由使用SCARB2-专一性引子进行PCR反应，筛选出带有人类基因的founder小鼠(A)，及所获得F1、F2 Tg小鼠(B)的结果。图2(C)显示人类SCARB2在SCARB2-转殖基因鼠的主要器官中的表现。
图3为藉由使用VP1-专一性引子进行RT-PCR反应，测定于肠病毒EV71/E59感染后第1至4天，病毒在SCARB2-Tg B6小鼠中的分布情形。
图4为于施予接种后4至6天，在仅接种培养基(A)、非转殖基因小鼠(C)及以107 pfu EV71/E59感染的hSCARB2-Tg转殖基因鼠(B)所观察的类手足口病(HFMD)，包括掉毛与皮屑产生情形。
图5为感染后第8天至12天期间，所观察到的行动困难与后肢麻痹的计分图。
图6为以VP-1专一性RT-PCR侦测病毒感染后期(感染后12天)，于小鼠中枢神经系统及主要器官的EV-71病毒分布。
图7显示以同型抗体(□)及以抗EV-71抗体处理(■)的hSCARB2-Tg转殖基因鼠，在对抗病毒感染EV715746-TW98的存活率。
具体实施方式
本发明的其他特色及优点将于下列实施范例中被进一步举例与说明，而该实施范例仅作为辅助说明，并非用于限制本发明的范围。
根据本发明所呈现的各种实施例，下述各种仪器、装置、方法和其相关结果者，实施例中为了方便读者阅读所使用的标题或副标题，并不被限制在本发明的范围之内。此外，在此所提出和披露的某些理论，但无论他们是对还是错，只要该创作是根据本发明所实施的，而不需考虑任何特定的理论或行动的计划，都应被限制在本发明的范围之内。
实施例
实施例一：SCARB2基因转殖鼠的制备
将所合成得具有密码子最适化的人类SCARB2基因(SEQ ID NO.1)片段使用EcoRI与BamHI限制酶，插入pEF-1α质体(该质体是以pcDNA3.1(-)载体(Invitrogen)为背景经修改后而得的载体，其中原有的巨细胞病毒增效子/启动子以增长因子1α(EF-1α)的启动子取代)中，位于启动子与牛生长激素(BGH)聚A尾端间的多重选殖部位(multiple cloning site)，而得到pEF-1α-hSCARB2构体(图1)。
基因转殖动物的产生是依照Brinster等人(Brinster et al.，1985)所述的操作步骤来进行。所使用的C57BL/6小鼠购自国家应用研究实验室-实验动物中心(National Applied Research Laboratories-Laboratory Animal Center，台湾)。进行显微注射前先将质体以限制酵素线形化，并使用凝胶萃取套组(Qiagen，德国)将其从琼脂糖凝胶(Thermo Fisher Scientific，IL，USA)中回收得。
将1ng线形pEF-1α-hSCARB2构体经由显微注射，导入处于单细胞阶段的已受精的C57BL/6小鼠胚胎中，接着将该胚胎植入到同品系假怀孕的母鼠内使其发育成鼠。利用PCR分析筛检出带有hSCARB2蛋白基因型的阳性小鼠，与原生型同品系小鼠互相交配，生成F0小鼠。
PCR分析方法简述如下：使用组织与细胞基因组DNA萃取套组(Tissue &Cell genomic DNA extraction kit，Favorgen，台湾)从基因转殖鼠尾部萃取出基因组DNA。藉由使用前向引子：5’-TGGACCAGAGCATCGAGAA-3’(SEQ IDNO.2)与反向引子：5’-TAGGTGTAGGGGCCCACTT-3’(SEQ ID NO.3)于72℃下2分钟进行的PCR反应扩增一段长度为175bp的片段(SEQ ID NO.1的98-272bp)，以侦测hSCARB2基因是否存在基因组DNA中。用于进行PCR反应的条件设定如下：于95℃下2分钟；随后进行40次包括于95℃下30秒、于50℃下30秒与于72℃下10秒的循环周期；之后再于72℃下反应2分钟。
结果筛检出六只带有转殖基因的小鼠-No.2(雄性，m)、No.9(雌性，f)、No.18(m)、No.27(f)、No.54(m)及No.62(f)(参见图2A)。再次以PCR分析筛选出其基因型为异核型(heterozygous)的阳性F0小鼠，并使呈阳性F0小鼠互相交配生成F1小鼠；利用PCR分析筛选得其基因型为同核型(homozygous)的阳性F1小鼠，而得hSCARB2基因转殖鼠(结果参见图2B)。藉由将所得的hSCARB2基因转殖鼠个体彼此进行交配，获得F1近亲交配种小鼠，以维持该基因转殖纯系。
进一步以前述的hSCARB2特异性引子对及购自Roche Universal ProbeLibrary Assay Design Center(Roche，Switzerland)的探针组，进行RT-PCR分析(The
480 Real-Time PCR system)，来确认及定量人类SCARB2蛋白在F1基因转殖鼠的主要器官中的表达。PCR产物大小为97bp。使用不同浓度(5、0.5及0.05pg/ml)的pEF-1α-hSCARB2质体为标准物。比较用以从各器官扩增hSCARB2基因所需要的循环次数。
结果显示，在取自基因转殖小鼠的包括脑干、大脑皮质、延脑与脊髓等中枢神经组织，以及肺、肝、脾、肾、十二指肠、小肠等主要器官及皮肤中，皆发现有表现hSCARB2转殖基因(图2C)。
实施例二：SCARB2基因转殖鼠受肠病毒感染后的病毒血症及手足口病(HFMD)和神经系统病变的症状分析
将1-天或4-天大的小鼠经皮下注射，接种入肠病毒EV71E59或5746-tw98分离株(每只小鼠施予1x106或1x107pfu，存在10μL RPMI培养基中)，以模拟观察新生小鼠受病毒感染后，肠病毒于小鼠主要器官中的分部情形，及外在所发生的病症。对照组施给VP-SFM培养基。对于肠病毒EV71的侦测，为将经感染的小鼠于特定天数后将其牺牲，采取血液或器官组织样本，并针对VP1基因进行专一性的即时(real-time)RT-PCR。
将自血液样本或组织均质化产物萃取得的总体RNA，进行反转录反应转变成cDNA。再将所得的cDNA使用EV71 VP1专一性引子对，前向引子：5’-AGAGAGTCACTTGCTTGGCAGACA-3’(SEQ ID NO.4)与反向引子：5’-ACGACTAGTGCCGGTCGGTTTAAT-3’(SEQ ID NO.5)，进行定量PCR分析来侦测EV71的存在量。
由图3的结果显示，于肠病毒EV71感染后1至6天，在SCARB2-Tg B6转殖基因鼠的中枢神经(脑与脊髓)及肝脏、肺脏、小肠、肾脏、脾脏、皮肤等，侦测到有病毒存在。此外，相对于SCARB2-转殖基因鼠，于非转殖基因鼠的神经器官(脑，脊髓)和主要器官(肝、肺、肾、皮肤等)皆侦测不到病毒量分布，表示hSCARB2的表现对于EV71在小鼠中的可感染力而言很重要。
除了测定病毒量分布，亦于施予病毒感染后，每天观察于对照组和实验组小鼠产生的手足口病(HFMD)及神经性毒性(CNS)症状。病理分析发现，以肠病毒71型E59B型病毒株感染一天大的SCARB2基因转殖鼠，会使受感染小鼠产生类似出现在人类受肠病毒EV71-感染幼儿的红疹，且有严重毛发掉落伴随皮屑(scurf)产生，这些症状皆为典型的类手足口病症状(HFMD-like syndrome)(参见图4)。而且，在施予感染的转殖基因鼠亦出现包括前后足麻痹，而导致行走困难的神经系统病症(CNS-like syndrome)。在感染后7天开始，转殖基因鼠即出现后肢麻痹伴随行动困难的现象，而非转殖基因鼠在感染后并未呈现此类似病症，关于在感染后第8天至12天期间，所观察到的行动困难与后肢麻痹的计分结果列示于图5。
而且由图6的病毒分布侦测结果显示，在施予病毒感染后第12天，于已发生后肢麻痹的小鼠的脊髓中可侦测到，但是在没有呈现任何行走困难的非转殖基因鼠，则没有侦测到病毒，表示所观察到的CNS病症，是由于脊随受到肠病毒感染所致。
前述的观察结果均显示，以肠病毒71型感染新生SCARB2基因转殖鼠，确实会产生类似于肠病毒感染在人类婴儿所引起的症状。亦即，本发明的SCARB2基因转殖鼠可有效做为，天然存在的肠病毒感染的动物模式。
实施例三：以SCARB2基因转殖鼠检测抗EV-71抗体对于肠病毒感染的防治功效
本实施例藉由将已知具有肠病毒中和活性的抗EV-71单株抗体，投药予预先经天然EV71 5746-TW98肠病分离毒株感染的SCARB2基因转殖鼠，并检测该单株抗体对于保护小鼠对抗肠病毒感染的功效，以评估及证明本发明的SCARB2基因转殖鼠，做为抗肠病毒药物筛选平台的实用性。
实验方法简述如下：将7天大的SCARB2基因转殖鼠以皮下方式，注射入剂量为3x104 pfu的EV71 5746-TW98肠病毒株进行感染。接着在注射病毒4小时后进行投药，将该经过肠病毒株感染的SCARB2基因转殖鼠以腹膜内注射方式，投药以200μg的同型小鼠IgG1抗体(做为对照组)，或抗EV-71单株抗体(已被鉴定具有中和活性，参见Chang，HW et al.，Journal of Virological Methods7(1)：62，2011)。
图7列示于同型抗体处理组(口，对照组，总数10只小鼠)，及抗EV-71抗体处理组(■，实验组，总数12只小鼠)所得的存活率观察结果。于hSCARB2基因转殖鼠可明显区分，EV-71抗体与对照组抗体在抑制受感染小鼠的致死性上的功效差异，显示本发明的hSCARB2基因转殖鼠可用于评估已知或研发中药物的抗肠病毒感染功效，或用于评估EV71疫苗在此动物模式中的免疫保护效力。
其他具体态样
本说明书中所揭示的全部特征可以任何组合方式组合。于是，本说明书中所揭示的各别特征可由依相同、相等或类似目的的替代特征取代。因此，除非另行清楚地指示，所揭示的各特征仅为一系列同等物或类似特征的实例。
从前述的说明，习于该项技艺人士可容易地确定本发明的基本特征，且在未偏离其范围下，可进行本发明的各种改变与修饰，以使其适于各种不同用途与状况。因此，于申请专利范围内亦包含其他具体态样。
Claims (11)
1.一种制造hSCARB2基因转殖鼠的方法，其特征在于，包含下列步骤：
a.将经由微注射入受Elongation factor-1启动子(EF-1αpromoter)驱动的人类SCARB2蛋白(hSCARB2)基因(SEQ ID NO.1)的小鼠胚胎，转殖到同品系母鼠中使其发育成鼠；
b.利用PCR分析筛检出带有hSCARB2蛋白基因型的阳性小鼠，与原生型同品系小鼠互相交配，生成F0小鼠；
c.再次以PCR分析筛选出其基因型为异核型(heterozygous)的阳性F0小鼠，并使呈阳性F0小鼠互相交配生成F1小鼠；
d.利用PCR分析筛选得其基因型为同核型(homozygous)的阳性F1小鼠，而得hSCARB2基因转殖鼠；及
e.利用RT-PCR分析确认F1基因转殖鼠在主要器官表达hSCARB2蛋白。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，该基因转殖鼠于自然界流行的肠病毒株感染后，会呈现手足口病(HFMD)的症状和神经系统的病变。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，该用于基因转殖的小鼠是C57BL/6小鼠。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，该用于基因转殖的小鼠是FVB小鼠。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，该制得的hSCARB2基因转殖鼠用做为手足口病的动物模式。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，该制得的hSCARB2基因转殖鼠用做为肠病毒71型的感染动物模式。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，该制得的hSCARB2基因转殖鼠用做为克沙奇病毒16型(Coxsackie A16)的感染动物模式。
8.一种检测肠病毒疫苗保护效力的方法，其特征在于，利用根据权利要求1所述的方法所制得的hSCARB2基因转殖鼠为动物模式，评估候选肠病毒疫苗在疫苗接种后施予肠病毒攻毒时，对于已受免疫的hSCARB2基因转殖鼠所产生的抗病毒保护效力。
9.一种用于筛检出有效治疗肠病毒所引起的手足口病的治疗性疫苗或药物的方法，其特征在于，包含：
(1)将根据权利要求1所述的方法所制得的hSCARB2基因转殖鼠以自然界流行的肠病毒株感染，使其呈现手足口病(HFMD)的症状；
(2)将呈现病症的hSCARB2基因转殖鼠施予候选疫苗或药物；
(3)于一段治疗时间后，与未施予候选疫苗或药物的动物进行比较，以评估该候选疫苗或药物在疗肠病毒所引起的手足口病的功效。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，用于筛选出用于治疗肠病毒71型感染的药物。
11.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，用于筛选出用于治疗克沙奇病毒16型感染的药物。
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