CN103080326A - 用于从蔗糖产生甘油和甘油衍生产物的重组细菌 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了能从蔗糖产生甘油和甘油衍生产物的重组细菌，所述重组细菌在其基因组中或在至少一个重组构建体上包含：编码具有蔗糖转运蛋白活性的多肽的核苷酸序列；编码具有果糖激酶活性的多肽的核苷酸序列；编码具有蔗糖水解酶活性的多肽的核苷酸序列。这些核苷酸序列各自可操作地连接至相同的或不同的启动子。这些重组细菌能代谢蔗糖以产生甘油和/或甘油衍生产物，例如1，3-丙二醇和3-羟基丙酸。

Description

用于从蔗糖产生甘油和甘油衍生产物的重组细菌
发明领域
本发明涉及微生物学和分子生物学领域。更具体地讲，本发明提供了具有利用蔗糖作为碳源来产生甘油和甘油衍生产物的能力的重组细菌和利用这种重组细菌的方法。
背景技术
许多在商业上有用的微生物可利用葡萄糖作为其主要碳水化合物来源。然而，所开发的用于产生商业上所需的产物的微生物利用葡萄糖的缺点是葡萄糖的高费用。使用蔗糖和含有蔗糖和其他糖类的混合原料作为微生物生产系统的碳水化物来源将会是在商业上可取的，因为这些材料可容易以较低成本获得。
当生产微生物可利用混合原料中存在的任何蔗糖时，其可更高效地运行。因而，当生产微生物不具有高效利用蔗糖作为主要碳源的能力时，其不能如此有效地工作。例如，细菌细胞通常显示出偏好的糖利用，以葡萄糖为最优选的。在含有的糖混合物的人造培养基中，葡萄糖通常先于其他糖类被完全代谢。此外，许多细菌缺少利用蔗糖的能力。例如，不到50％的大肠杆菌(Escherichia coli)菌株具有利用蔗糖的能力。因而，当生产微生物不能利用蔗糖作为碳水化合物来源时，希望对该微生物进行工程改造而使得其可利用蔗糖。
已通过整合利用蔗糖的基因来工程改造而可利用蔗糖的重组细菌已有报道。例如，Livshits等人(美国专利6,960,455)描述了利用大肠杆菌菌株来产生氨基酸，所述菌株含有编码利用蔗糖的代谢途径的基因。此外，Olson等人(Appl.Microbiol.Biotechnol.74：1031-1040，2007)描述了携带负责蔗糖降解的基因的大肠杆菌菌株，其可利用蔗糖作为碳源来产生L-酪氨酸或L-苯丙氨酸。然而，存在着对能利用蔗糖作为碳源来产生甘油和甘油衍生产物的细菌菌株的需要。
发明概述
在一个实施方案中，本发明提供了重组细菌，所述重组细菌在基因组中或在至少一个重组构建体上包含：
(a)一种或多种编码具有蔗糖转运蛋白活性的多肽或多肽复合物的核苷酸序列；
(b)编码具有果糖激酶活性的多肽的核苷酸序列；和
(c)编码具有蔗糖水解酶活性的多肽的核苷酸序列；
其中(a)、(b)和(c)各自可操作地连接至相同的或不同的启动子，另外其中所述重组细菌能够代谢蔗糖来产生选自甘油、1，3-丙二醇和3-羟基丙酸的产物。
在第二个实施方案中，本发明提供用于从蔗糖制备甘油、1，3-丙二醇和/或3-羟基丙酸的方法，所述方法包括：
a)在存在蔗糖的情况下培养本文所公开的重组细菌；以及
b)任选地，回收所产生的甘油、1，3-丙二醇和/或3-羟基丙酸。
简单的序列说明
下列序列符合37C.F.R.1.8211.825(“对含有核酸序列和/或氨基酸序列公开的专利申请的要求-序列规则”)，并且与世界知识产权组织(WIPO)标准ST.25(1998)和EPO和PCT的序列列表要求(规则5.2和49.5(a bis)，以及行政指导的208节和附录C)相一致。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循在37C.F.R.§1.822中所列出的规则。
表A
基因和蛋白质SEQ ID号汇总
Figure BPA00001308832300021
Figure BPA00001308832300031
Figure BPA00001308832300041
SEQ ID NO：71是来自肺炎克雷伯氏菌的dhaX基因的编码区的核苷酸序列。
SEQ ID NO：72是质粒pSYCO101的核苷酸序列。
SEQ ID NO：73是质粒pSYCO103的核苷酸序列。
SEQ ID NO：74是质粒pSYCO106的核苷酸序列。
SEQ ID NO：75是质粒pSYCO109的核苷酸序列。
SEQ ID NO：76是质粒pSYCO400/AGRO的核苷酸序列。
SEQ ID NO：77是本文实施例1中所述的质粒pScr1的核苷酸序列。
SEQ ID NO：78是本文实施例1中所述的质粒pBHRcscBKA的核苷酸序列。
SEQ ID NO：79是本文实施例1中所述的质粒pBHRcscBKAmutB的核苷酸序列。
SEQ ID NO：80-83是用于构建本文实施例2-4中所述的菌株TTab的引物的核苷酸序列。
具体实施方式
本文中所列出的每篇参考文献的公开内容的全文以引用的方式并入本文。
本文以及所附权利要求书中所用的单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指代，除非上下文中清楚地另有指明。因此，例如提及“细胞”包括一个或多个细胞及其本领域技术人员已知的等同物，等等。
在本公开的上下文中，使用了多个术语和缩写。给出了如下定义。
“开放阅读框”缩写为ORF。
“聚合酶链反应”缩写为“PCR”。
“美国典型培养物保藏中心”缩写为“ATCC”。
术语“产重组甘油细菌”指已经遗传工程改造而能产生甘油和/或甘油衍生产物例如1，3-丙二醇和3-羟基丙酸的细菌。
术语“具有蔗糖转运蛋白活性的多肽或多肽复合物”指能够介导蔗糖转运进微生物细胞内的多肽或多肽复合物。具有蔗糖转运蛋白活性的多肽的实例包括但不限于蔗糖-质子共运输蛋白。具有蔗糖转运蛋白活性的多肽复合物的实例包括但不限于ABC型转运蛋白。蔗糖-质子共运输蛋白由，例如cscB基因编码，该基因存在于大肠杆菌菌株例如EC3132(Jahreis等人，J.Bacteriol.184：5307-5316，2002)或ATCC 13281(Olson等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.74：1031-1040，2007)中，以及存在于乳双歧杆菌菌株DSM 10140T(Ehrmann等人，Curr.Microbiol.46(6)：391-397，2003)中。具有针对蔗糖的活性的ABC型转运蛋白的实例是由肺炎链球菌菌株TIGR4中的基因susT1、susT2和susX编码的复合物(Iyer和Camilli，Molecular Microbiology 66：1-13，2007)。具有蔗糖转运蛋白活性的多肽或多肽复合物也具有针对其他糖类的活性。一个实例是由malEFGK编码的变形链球菌的麦芽糖转运复合物(Kilic等人，FEMS Microbiol Lett.266：218，2007)。
术语“具有果糖激酶活性的多肽”指具有催化D-果糖+ATP转化成磷酸果糖+ADP的能力的多肽。代表性的果糖激酶是EC 2.7.1.4。具有一定的使果糖磷酸化的能力的酶，无论该活性是否为其主要活性，均可称为果糖激酶。用于编码果糖激酶和具有果糖激酶活性的蛋白质的基因的缩写包括，例如“Frk”、“scrK”、“cscK”、“FK”和“KHK”。果糖激酶由根癌土壤杆菌和变形链球菌中的scrK基因以及由某些大肠杆菌菌株中的cscK基因编码。
术语“具有蔗糖水解酶活性的多肽”指具有催化蔗糖水解产生葡萄糖和果糖的能力的多肽。这种多肽通常称为“转化酶”或“β-呋喃果糖苷酶”。典型的这些酶为EC 3.2.1.26。编码具有蔗糖水解酶活性的多肽的基因的实例为存在于大肠杆菌菌株EC3132(Jahreis等人，同上)或菌株ATCC 13281(Olson等人，同上)的cscA基因、来自乳双歧杆菌菌株DSM 10140T的bfrA基因和来自酿酒酵母的SUC2基因(Carlson和Botstein，Cell 28：145，1982)。具有蔗糖水解酶活性的多肽也可具有磷酸蔗糖水解酶活性。这种多肽的实例由谷氨酸棒状杆菌中的scrB编码(Engels等人，FEMS Microbiol Lett.289：80-89，2008)。具有蔗糖水解酶活性的多肽还可具有蔗糖磷酸化酶活性。典型的这种酶是EC 2.4.1.7。编码具有蔗糖水解酶活性的蔗糖磷酸化酶的基因的实例存在于肠膜状明串珠菌DSM 20193(Goedl等人，Journal ofBiotechnology 129：77-86，2007)和青春双岐杆菌DSM 20083(van denBroek等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.65：219-227，2004)等中。
术语“甘油衍生物”和“甘油衍生产物”在本文中可互换使用，指从甘油合成的化合物和在包括甘油的途径中合成的化合物。这种产物的实例包括3-羟基丙酸、甲基乙二醛、1，2-丙二醇和1，3-丙二醇。
术语“微生物产物”指由微生物产生的产物，即微生物代谢物质的结果。该产物可由微生物天然产生，或可对微生物进行遗传改造以产生所述产物。
术语“磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统”、“PTS系统”和“PTS”在本文中可互换使用，指磷酸烯醇式丙酮酸依赖性糖摄取系统。
术语“磷酸载体蛋白HPr”和“PtsH”指由大肠杆菌中的ptsH编码的磷酸载体蛋白。术语“磷酸烯醇式丙酮酸-蛋白质磷酸转移酶”和“PtsI”指由大肠杆菌中的ptsI编码的磷酸转移酶EC 2.7.3.9。术语“葡萄糖特异性IIA组分”和“Crr”指命名为EC 2.7.1.69的酶，其由大肠杆菌中的crr编码。PtsH、PtsI和Crr包含PTS系统。
术语“PTS-”指其天然状态下不含PTS系统的微生物或其中已通过PTS基因失活而使PTS系统失活的微生物。
术语“3-磷酸甘油脱氢酶”和“G3PDH”指负责催化磷酸二羟基丙酮(DHAP)转化为3-磷酸甘油(G3P)的酶活性的多肽。体内G3PDH可以是NAD依赖性或NADP依赖性的。当具体提及辅因子特异性3-磷酸甘油脱氢酶时，将使用术语“NAD依赖性3-磷酸甘油脱氢酶”和“NADP依赖性3-磷酸甘油脱氢酶”。因为通常情况是NAD依赖性和NADP依赖性3-磷酸甘油脱氢酶能够互换利用NAD和NADP(例如通过由gpsA编码的酶)，所以术语NAD依赖性和NADP依赖性3-磷酸甘油脱氢酶将互换使用。例如，NAD依赖性酶(EC 1.1.1.8)由数种基因编码，所述基因包括GPD1，在本文中也称为DAR1(SEQ IDNO：1中示出的编码序列；SEQ ID NO：2中示出的所编码的蛋白质序列)，或GPD2(SEQ ID NO：3中示出的编码序列；SEQ ID NO：4中示出的所编码的蛋白质序列)，或GPD3。NADP依赖性酶(EC 1.1.1.94)，例如由gpsA编码。
术语“甘油3-磷酸酶”、“sn-甘油3-磷酸酶”、“D，L-甘油磷酸酶”和“G3P磷酸酶”指具有能催化3-磷酸甘油和水转化为甘油和无机磷酸的酶活性的多肽。G3P磷酸酶，例如由GPP1(SEQ ID NO：5中示出的编码序列；SEQ ID NO：6中示出的所编码的蛋白质序列)或GPP2(SEQ ID NO：7中示出的编码序列；SEQ ID NO：8中示出的所编码的蛋白质序列)编码。
术语“甘油脱水酶”或“脱水酶”指具有能催化甘油分子转化为产物3-羟基丙醛(3-HPA)的酶活性的多肽。
为了本发明的目的，脱水酶包括分别具有优选的底物甘油和1，2-丙二醇的甘油脱水酶(E.C.4.2.1.30)和二醇脱水酶(E.C.4.2.1.28)。脱水酶的基因已经在肺炎克雷伯氏菌、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacterfreundii)、巴氏梭状芽孢杆菌(C lostridium pasteurianum)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)和罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)等中得以鉴定。在每种情况下，脱水酶均由三个亚基组成：大亚基或“α亚基”、中等亚基或“β亚基”和小亚基或“γ亚基”。所述基因也在，例如如下文献中有所描述：Daniel等人(FEMS Microbiol.Rev.22，553(1999))以及Toraya和Mori(J.Biol.Chem.274，3372(1999))。编码甘油脱水酶的大亚基或“α亚基”的基因包括dhaB1(SEQ ID NO：9中示出的编码序列，SEQ ID NO：10中示出的所编码的蛋白质序列)、gldA和dhaB；编码中等亚基或“β亚基”的基因包括dhaB2(SEQ ID NO：11中示出的编码序列，SEQ IDNO：12中示出的所编码的蛋白质序列)、gldB和dhaC；编码小亚基或“γ亚基”的基因包括dhaB3(SEQ ID NO：13中示出的编码序列，SEQ ID NO：14中示出的所编码的蛋白质序列)、gldC和dhaE。其他编码二醇脱水酶的大亚基或“α亚基”的基因包括pduC和pddA；其他编码中等亚基或“β亚基”的基因包括pduD和pddB；其他编码小亚基或“γ亚基”的基因包括pduE和pddC。
甘油脱水酶和二醇脱水酶受甘油和其他底物的基于机制的自杀式失活影响(Daniel等人，FEMS Microbiol.Rev.22，553(1999))。术语“脱水酶复活因子”指负责使脱水酶活性复活的那些蛋白质。术语“脱水酶复活活性”或“使脱水酶活性复活”以及“使脱水酶活性再生”可互换使用，指将不能催化反应的脱水酶转化为能催化反应的脱水酶的现象或者抑制脱水酶失活的现象或延长体内脱水酶的可用半衰期的现象。两种蛋白质已经被鉴定为涉及作为脱水酶复活因子(参见例如美国专利6,013,494和其中的参考文献；Daniel等人，同上；Toraya和Mori，J.Biol.Chem.274，3372(1999)；以及Tobimatsu等人，J.Bacteriol.181，4110(1999))。编码其中一种蛋白质的基因包括，例如orfZ、dhaB4、gdrA、pduG和ddrA。编码这两种蛋白质中的第二种的基因包括，例如orfX、orf2b、gdrB、pduH和ddrB。
术语“1，3-丙二醇氧化还原酶”、“1，3-丙二醇脱氢酶”和“DhaT”在本文中可互换使用，指具有能催化3-HPA和1，3-丙二醇互变的酶活性的多肽，前提条件是编码这种活性的基因在其天然(即野生型)环境下以在物理上或在转录方面连接至脱水酶的情形存在；例如，该基因存在于dha调节子中，来自肺炎克雷伯氏菌的dhaT也是如此。编码1，3-丙二醇氧化还原酶的基因包括但不限于来自肺炎克雷伯氏菌、弗氏柠檬酸杆菌和巴氏梭状芽孢杆菌的dhaT。这些基因每一者编码属于III型醇脱氢酶家族的多肽，该多肽显示具有保守的铁结合基序，并且具有对NAD+/NADH偶联的3-HPA与1，3-丙二醇互变的偏好(Johnson和Lin，J.Bacteriol.169，2050(1987)；Daniel等人，J.Bacteriol.177，2151(1995)；以及Leurs等人，FEMS Microbiol.Lett.154，337(1997))。已从短乳杆菌(Lactobacillus brevis)和布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)分离出了具有类似物理特性的酶(Veiga daDunha和Foster，Appl.Environ.Microbiol.58，2005(1992))。
术语“dha调节子”指一组编码具有多种生物学活性的多肽(包括但不限于脱水酶活性、复活活性和1，3-丙二醇氧化还原酶活性)的相关联的多核苷酸或开放阅读框。通常，dha调节子包含开放阅读框dhaR、orfY、dhaT、orfX、orfW、dhaB1、dhaB2、dhaB3和orfZ，如美国专利7,371,558中所述。
术语“醛脱氢酶”和“Ald”指催化醛转化为羧酸的多肽。醛脱氢酶可利用氧化还原辅因子例如NAD、NADP、FAD或PQQ。典型的醛脱氢酶是EC 1.2.1.3(NAD依赖性)；EC 1.2.1.4(NADP依赖性)；EC 1.2.99.3(PQQ依赖性)；或EC 1.2.99.7(FAD依赖性)。NADP依赖性醛脱氢酶的一个实例是由大肠杆菌基因aldB(SEQ ID NO：15中示出的编码序列)编码的AldB(SEQ ID NO：16)。NAD依赖性醛脱氢酶的实例包括由大肠杆菌基因aldA(SEQ ID NO：17中示出的编码序列)编码的AldA(SEQ ID NO：18)；和由大肠杆菌基因aldH(SEQ IDNO：19中示出的编码序列)编码的AldH(SEQ ID NO：20)。
术语“葡萄糖激酶”和“Glk”在本文中互换使用，指催化D-葡萄糖+ATP转化为6-磷酸葡萄糖+ADP的蛋白质。典型的葡萄糖激酶是EC 2.7.1.2。葡萄糖激酶由大肠杆菌中的glk编码。
术语“磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶”和“Ppc”在本文中可互换使用，指催化磷酸烯醇式丙酮酸+H2O+CO2转化为磷酸+草酰乙酸的蛋白质。典型的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶是EC 4.1.1.31。磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶由大肠杆菌中的ppc编码。
术语“3-磷酸甘油醛脱氢酶”和“GapA”在本文中可互换使用，指具有能催化3-磷酸甘油醛+磷酸+NAD+转化为3-磷酸-D-甘油酰-磷酸+NADH+H+的酶活性的蛋白质。典型的3-磷酸甘油醛脱氢酶是EC 1.2.1.12。3-磷酸甘油醛脱氢酶由大肠杆菌中的gapA编码。
术语“有氧呼吸控制蛋白”和“ArcA”在本文中可互换使用，指全局调控蛋白。有氧呼吸控制蛋白由大肠杆菌中的arcA编码。
术语“甲基乙二醛合酶”和“MgsA”在本文中可互换使用，指具有能催化磷酸二羟丙酮转化为甲基乙二醛+磷酸的酶活性的蛋白质。典型的甲基乙二醛合酶是EC 4.2.3.3。甲基乙二醛合酶由大肠杆菌中的mgsA编码。
术语“磷酸葡萄糖酸脱水酶”和“Edd”在本文中可互换使用，指具有能催化6-磷酸-葡萄糖酸转化为2-酮-3-脱氧-6-磷酸-葡糖酸+H2O的酶活性的蛋白质。典型的磷酸葡萄糖酸脱水酶是EC 4.2.1.12。磷酸葡萄糖酸脱水酶由大肠杆菌中的edd编码。
术语“YciK”指由yciK编码的推定酶，yciK在翻译方面偶联至btuR基因，后者为大肠杆菌中编码钴胺素腺苷转移酶的基因。
术语“钴胺素腺苷转移酶”指能将脱氧腺苷基部分从ATP转移至还原类咕啉的酶。典型的钴胺素腺苷转移酶是EC 2.5.1.17。钴胺素腺苷转移酶由大肠杆菌中的基因“btuR”、鼠伤寒沙门氏菌中的“cobA”和脱氮假单孢杆菌(Pseudomonas denitrificans)中的“cobO”编码。
术语“半乳糖-质子共运输蛋白”和“GalP”在本文中可互换使用，指具有将糖和质子从周质运输至胞质的酶活性的蛋白质。D-葡萄糖是GalP的优选底物。半乳糖-质子共运输蛋白由大肠杆菌中的galP(SEQID NO：21中示出的编码序列，SEQ ID NO：22中示出的所编码的蛋白质序列)编码。
术语“非特异性催化活性”指具有能催化3-HPA与1，3-丙二醇互变的酶活性的多肽，并且特别是排除1，3-丙二醇氧化还原酶。通常，这些酶是醇脱氢酶。这类酶可利用除NAD+/NADH之外的辅因子，包括但不限于诸如FAD或FMN之类的黄素。非特异性醇脱氢酶的基因(yqhD)，例如据发现在大肠杆菌K-12菌株内源性编码并功能性表达。
术语“1.6长GI启动子”、“1.20短/长GI启动子”和“1.5长GI启动子”指含有来自如美国专利7,132,527所述的变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)葡萄糖异构酶基因的启动子的多核苷酸或片段。这些启动子片段包括与野性型变铅青链霉菌葡萄糖异构酶基因启动子相比降低其活性的突变。
术语“功能”和“酶功能”在本文中可互换使用，指酶在其未被反应消耗的情况下改变特定化学反应发生的速率的催化活性。应该理解，这种活性可应用于处于产物或底物的产生可在合适的条件下完成的平衡的反应。
术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用。
术语“碳底物”和“碳源”在本文中可互换使用，指能由本文所公开的重组细菌代谢的碳源，具体来讲指包含果糖和葡萄糖的碳源。碳源还可包含其他单糖；二糖，例如蔗糖；低聚糖；或多糖。
术语“宿主细胞”和“宿主细菌”在本文中可互换使用，指能接受外源或异源基因并且能表达这些基因以产生活性基因产物的细菌。
本文所用的术语“生产微生物”指微生物，包括但不限于重组、用于制备特定产物例如1，3-丙二醇、甘油、3-羟基丙酸、多不饱和的脂肪酸等的那些微生物。
本文所用的“核酸”意指多核苷酸，包括单链或双链的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基聚合物。核酸也可包括片段和经修饰的核苷酸。因此，术语“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”或“核酸片段”在本文中可互换使用，指作为单链或双链的RNA或DNA聚合物，任选含有合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。核苷酸(通常以它们的5′-单磷酸形式存在)通过它们的单字母命名指代如下：“A”指腺苷酸或脱氧腺苷酸(分别用于RNA或DNA)，“C”指胞苷酸或脱氧胞苷酸，“G”指鸟苷酸或脱氧鸟苷酸，“U”指尿苷酸，“T”指脱氧胸苷酸，“R”指嘌呤(A或G)，“Y”指嘧啶(C或T)，“K”指G或T，“H”指A或C或T，“I”指肌苷，“N”指任何核苷酸。
多核苷酸可以是RNA或DNA的聚合物，它们可以是单链或双链，任选含有合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。DNA聚合物形式的多核苷酸可由cDNA、基因组DNA、合成DNA或它们的混合物的一个或多个片段构成。
“基因”指可表达特定蛋白质的核酸片段，并且其可以指单独的编码区或可包括在编码序列之前的调控序列(5′非编码序列)和在编码序列之后的调控序列(3′非编码序列)。“天然基因”指自然状态下与其自身的调控序列一起的基因。“嵌合基因”指为非天然基因的任何基因，包含天然状态下不一起存在的调控序列和编码序列。因此，嵌合基因可包含源自不同来源的调控序列和编码序列，或者源自相同来源、但排列方式与天然存在的排列方式不同的调控序列和编码序列。“内源性基因”指在生物体基因组中处于其天然位置的天然基因。“外来”基因指通过基因转移导入至宿主生物内的基因。外来基因可包含插入到非天然生物体内的基因、导入到天然宿主内的新位置的基因，或嵌合基因。
术语“天然核苷酸序列”指正常存在于宿主微生物中的核苷酸序列。
术语“非天然核苷酸序列”指非正常存在于宿主微生物中的核苷酸序列。
术语“天然多肽”指正常存在于宿主微生物中的多肽。
术语“非天然多肽”指非正常存在于宿主微生物中的多肽。
术语“编码”和“译码”在本文中可互换使用，指基因通过转录和翻译机制产生氨基酸序列的过程。
术语“编码序列”指编码特定氨基酸序列的核苷酸序列。
“合适的调控序列”指位于编码序列的上游(5′非编码序列)、中间或下游(3′非编码序列)的核苷酸序列，其可影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性或翻译。调控序列可包括启动子、增强子、沉默子、5′非翻译前导序列(例如在转录起始位点和翻译起始密码子之间的序列)、内含子、多腺苷酸化识别序列、RNA加工位点、效应子结合位点和茎-环结构。
术语“表达盒”指DNA片段，所述DNA片段包含：所选基因的编码序列和所选基因产物表达所需的位于该编码序列之前(5′非编码序列)和之后(3′非编码序列)的调控序列。因而，表达盒通常由如下序列构成：1)启动子序列；2)编码序列(即ORF)和3)3′非翻译区(如终止子)，在真核生物中其通常含有多腺苷酸化位点。表达盒通常包含于载体中，以有利于克隆和转化。可用不同表达盒转化包括细菌、酵母和真菌在内的不同生物体，只要针对各宿主使用正确的调控序列。
“转化”指将核酸分子转移进宿主生物体中，从而导致在遗传上稳定的遗传。例如，核酸分子可以是自主复制的质粒，或者其可以整合进宿主生物体的基因组中。用核酸片段转化的宿主生物体称为“重组的”或“转化的”生物体或“转化体”。“稳定转化”指核酸片段转移进宿主生物的基因组(包括核基因组和细胞器基因组)中，从而导致遗传上稳定的遗传。相反“瞬时转化”指核酸片段转移进宿主生物体的胞核中或含DNA的细胞器中，从而导致基因表达而不整合或不稳定遗传。
“密码子简并性”指允许核苷酸序列在不影响所编码的多肽的氨基酸序列的情况下发生变化的遗传密码的性质。技术人员非常了解具体宿主细胞在使用核苷酸密码子来确定给定氨基酸时所表现出的“密码子偏倚性”。因此，当合成基因用以改善在宿主细胞中的表达时，希望对基因进行设计，使得其密码子使用频率接近该宿主细胞优选的密码子使用频率。
术语“在功能上相当的子片段”和“功能相当的子片段”在本文中可互换使用。这些术语指分离的核酸片段的一个部分或子序列，其中无论所述片段或子片段是否编码活性酶，其都保留着改变基因表达或导致某种表型的能力。可通过将核酸片段或子片段(无论其是否编码活性酶)以相对于启动子序列的有义或反义方向与所述启动子序列连接来设计出用于抑制的嵌合基因。
术语“保守结构域”或“基序”意指进化上相关的蛋白质的比对序列中在特定位置处保守的一组氨基酸。虽然同源蛋白质之间在其他位置的氨基酸可以发生变化，但在特定位置高度保守的氨基酸表明对蛋白质的结构、稳定性或活性来说是必需的氨基酸。
术语“基本相似”和“基本对应”在本文中可互换使用。它们指这样的核酸片段，即其中一个或多个核苷酸碱基改变并不会影响该核酸片段介导基因表达或产生某种表型的能力。这些术语也指本发明的核酸片段的修饰(例如缺失或插入一个或多个核苷酸)，相对于初始的未经修饰的核酸片段，该修饰基本上不会改变所得核酸片段的功能特性。因此，正如本领域的技术人员应当理解的，本发明涵盖的不仅仅是具体的示例性序列。此外，技术人员认识到，本发明所涵盖的基本相似的核苷酸序列也通过它们(在中等严格条件如0.5X SSC(标准柠檬酸钠)，0.1％SDS，60℃下)与本文所示例的序列杂交的能力，或杂交至本文所公开的核苷酸序列的任何部分以及杂交至与本文所公开的任何核苷酸序列功能相当的序列的能力所限定。可调节严格性条件以筛选中度相似的片段(例如来自远缘生物体的同源序列)，到筛选高度相似的片段(例如从近缘生物复制功能性酶的基因)。杂交后的洗涤可确定严格性条件。
术语“选择性杂交”包括指在严格杂交条件下，核酸序列与特定核酸靶序列以比其与非靶核酸序列的杂交更高的可检测程度(例如至少两倍于背景)杂交，并指基本排除了非靶核酸。选择性杂交序列是其中所述核苷酸序列之一的互补序列通常与另一所述核苷酸具有约至少80％的序列同一性或90％的序列同一性，最高至并且包括100％的序列同一性(即完全互补)。
术语“严格条件”或“严格杂交条件”包括指探针将会选择性杂交至其靶序列的条件。探针通常是与待检测核酸序列互补的单链核酸序列。探针与待检测的核酸序列是“可杂交的”。通常，探针的长度少于约1000个核苷酸，任选长度少于500个核苷酸。
杂交方法是非常确实的。通常探针和样本在允许核酸杂交的条件下混合。这涉及在正确浓度和温度条件下在存在无机或有机盐时使探针和样品接触。任选地，可以加入离液剂。核酸杂交可适用于多种测定形式。最合适的形式之一是夹心测定形式。夹心型测定的主要组分是固体支持体。固体支持体具有吸附或共价连接至其上的固定化核酸探针，该探针未经标记并且与序列的一部分互补。
严格条件是序列依赖性的并将因不同的环境而异。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可鉴定与探针100％互补的靶序列(同源探测)。或者，可调节严格条件以允许序列中的一些错配，以便检测到较低程度的相似性(异源探测)。
通常，严格条件将是如下那些条件：在pH 7.0至8.3下盐浓度低于约1.5M钠离子，通常约0.01至1.0M钠离子浓度(或其他盐)，并且对于短探针(例如10至50个核苷酸)温度为至少约30℃，而对于长的探针(例如多于50个核苷酸)温度为至少约60℃。严格条件也可通过加入诸如甲酰胺之类的去稳定剂来实现。示例性的低严格条件包括在37℃于含有30至35％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS(十二烷基硫酸钠)的缓冲液中杂交，以及在50至55℃用1X至2X SSC(20XSSC＝3.0M NaCl/0.3M柠檬酸三钠)洗涤。示例性的中等严格条件包括在37℃下于40至45％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中杂交，以及在55至60℃下用0.5X至1X SSC洗涤。示例性的高严格条件包括在37℃下于50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中杂交，以及在60至65℃下用0.1X SSC洗涤。
特异性通常取决于杂交后洗涤，最后的洗涤溶液的离子强度和温度是关键因素。对于DNA-DNA杂交物，热解链温度(Tm)可用Meinkoth等人，Anal.Biochem.138：267-284(1984)的公式来估计：Tm＝81.5℃+16.6(log M)+0.41(％GC)-0.61(％form)-500/L；其中M是单价阳离子的摩尔浓度，％GC是DNA中鸟苷和胞嘧啶核苷酸的百分比，％form是杂交溶液中甲酰胺的百分比，而L是以碱基对表示的杂交体的长度。Tm指(在确定的离子强度和pH下)50％的互补靶序列与完全匹配的探针杂交时的温度。每出现1％的错配，Tm降低约1℃；因此，可调节Tm杂交和/或洗涤条件以与具有期望同一性的序列杂交。例如，如果要寻求具有≥90％同一性的序列，则可将Tm降低10℃。通常，在确定的离子强度和pH下，严格条件选择为比特定序列及其互补序列的Tm低约5℃。然而，极严格条件可采用在Tm低1、2、3或4℃的温度下的杂交和/或洗涤；中等严格条件可采用在比Tm低6、7、8、9或10℃的温度下的杂交和/或洗涤；低严格条件可采用在比Tm低11、12、13、14、15或20℃的温度下的杂交和/或洗涤。利用上述等式、杂交和洗涤组合物以及所需的Tm，一般技术人员将会理解，杂交和/或洗涤溶液的严格性的变化已经在本质上得以描述。如果所需的错配程度导致Tm低于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)，则优选增加SSC的浓度以便能使用更高的温度。对核酸杂交的详尽指导可在以下文献中找到：Tii ssen，Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology--Hybridization with NucleicAcid Probes，第I部分，第2章“Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acidprobe assays”，Elsevier，New York(1993)；以及Current Protocols inMolecular Biology，第2章，Ausubel等人编辑，Greene Publishing andWiley-Interscience，New York(1995)。杂交和/或洗涤条件可进行至少10、30、60、90、120或240分钟。
在核酸序列或多肽序列中的上下文中的“序列同一性”或“同一性”指在特定比较窗口上进行比对以寻求最大对应时两个序列中相同的核酸碱基或氨基酸残基。
因此，“序列同一性百分比”指通过在比较窗口上比较两个最佳对齐的序列而测得的值，其中在与参考序列(其不包括添加或缺失)进行比较时，比较窗口中的多核苷酸或多肽序列部分可包括添加或缺失(即缺口)以实现两个序列的最佳比对。该百分比通过如下计算：测定相同核酸碱基或氨基酸残基在两个序列中出现的位置的数目，以获得匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗口中的总位置数目并将所得结果乘以100而获得序列同一性百分比。序列一致性百分比的可用的实例包括但不限于50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％和95％，或者50％至100％的任意整数百分比。上述一致性可以利用本文所述的任何程序来确定。
序列比对和百分比同一性或相似度计算可用设计用于检测同源序列的多种比较方法来确定，这些方法包括但不限于LASARGENE生物信息计算包(DNASTAR Inc.，Madison，WI)的MegalignTM程序。在本专利申请的上下文中应当理解，使用序列分析软件进行分析时，分析结果将基于所参考程序的“默认值”，除非另外指明。在此所用的“默认值”将指在首次初始化软件时软件最初加载的任何值或参数集。
“Clustal V比对方法”对应于标为Clustal V的比对方法(Higgins和Sharp，CABIOS.5：151-153(1989)；Higgins，D.G.等人，Comput.App l.Biosci.8：189-191(1992)进行了描述)并且存在于LASARGENE生物信息计算包(DNASTAR Inc.，Madison，WI)的MegalignTM程序。就多重比对而言，默认值对应于空位罚分(GAP PENALTY)＝10以及空位长度罚分(GAP LENGTH PENALTY)＝10。成对比对和使用Clustal V方法的蛋白序列百分比同一性计算的默认参数为KTUPLE＝1，空位罚分＝3，窗口(WINDOW)＝5，DIAGONALS SAVED＝5。就核酸而言，这些参数为KTUPLE＝2，空位罚分＝5，窗口＝4，DIAGONALS SAVED＝4。在使用Clustal V程序进行序列比对后，通过查看相同程序中的“序列距离”表获得“百分比同一性”是可能的。
“Clustal W序列比对方法”对应于标记Clustal W的比对方法(Higgins和Sharp(同上)；Higgins，D.G.等人(同上)进行了描述)，并且存在于LASERGENE生物信息学计算软件包(DNASTAR Inc.，Madison，WI)的MegAlignTM v6.1程序中。用于多重比对的默认参数对应于空位罚分＝10，空位长度罚分＝0.2，延迟发散序列(Delay DivergenSeqs)(％)＝30，DNA转换权重(DNA Transition Weight)＝0.5，蛋白质权重矩阵(Protein Weight Matrix)＝Gonnet系列，DNA权重矩阵(DNAWeight Matrix)＝IUB。在使用Clustal W程序对序列进行比对之后，可通过查看同一程序中的“序列距离”表来获得“百分比同一性”。
“BLASTN比对方法”是由国家生物技术信息中心(NationalCenter for Biotechnology Information，NCBI)提供的用以采用默认参数比较核苷酸序列的算法。
本领域的技术人员非常清楚，多种程度的序列同一性可用于从其他物种中鉴定多肽，其中这类多肽具有相同或相似的功能或活性。同一性百分比的可用的实例包括但不限于50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％，或50％至100％的任何整数百分比。实际上，50％至100％的任何整数氨基酸同一性可用于描述本发明，例如51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。而且，所关注的是这种分离核苷酸片段的任何全长的或部分的互补序列。
因而，本发明不仅仅涵盖本文所公开的具体示例性核苷酸序列。例如，考虑反映遗传密码的简并性的基因序列改变。而且，本领域所熟知的是，导致在给定位点产生化学等价的氨基酸，但不影响所编码的蛋白质的功能特性的基因改变是常见的。针对本文论述将置换定义为如下五个组中任一者内的交换：
1.小的脂族非极性残基或稍微极性的残基：Ala、Ser、Thr(Pro、Gly)；
2.极性的、带负电荷的残基和它们的酰胺：Asp、Asn、Glu、Gln；
3.极性的、带正电荷的残基：His、Arg、Lys；
4.大的脂族非极性残基：Met、Leu、Ile、Val(Cys)；以及
5.大的芳族残基：Phe、Tyr、Trp。
因此，氨基酸丙氨酸(疏水性氨基酸)的密码子可被编码另一种疏水性较弱的残基(例如甘氨酸)或疏水性较强的残基(例如缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸)的密码子置换。类似地，导致一个带负电荷的残基置换为另一个带负电荷的残基(例如，天冬氨酸替代谷氨酸)或者一个带正电荷的残基置换为另一个带正电荷的残基(例如，赖氨酸替换精氨酸)的改变也可以预期产生功能上等价的产物。导致蛋白质分子的N末端和C末端部分改变的核苷酸变化也将预计不会改变该蛋白质的活性。
所提出的修饰中的每一者均完全在本领域常规技术内，由所编码的产物的生物活性的保留决定。此外，技术人员认识到，本发明所涵盖的基本相似的序列也由它们在上面所定义的严格条件下杂交的能力限定。
本发明优选的基本相似的核酸片段是这样的核酸片段：其核苷酸序列与本文所报道的核酸片段的核苷酸序列具有至少70％的同一性。更优选的核苷酸序列与本文所报道的核酸片段的核苷酸序列具有至少90％的同一性。最优选的核苷酸序列与本文所报道的核酸片段的核苷酸序列具有至少95％的同一性。
氨基酸或核苷酸序列的“基本部分”指这样的部分，该部分包括的多肽的氨基酸序列或基因的核苷酸序列足以推定鉴定所述多肽或基因，所述鉴定或者可以由本领域技术人员通过对序列进行人工评价来完成，或者可利用诸如BLAST(Basic Local Alignment Search Tool；Altschul，S.F.等人，J.Mol.Biol.，215：403-410(1993))之类的算法通过计算机自动化的序列比较和鉴定来完成。一般来讲，为了推测鉴定多肽或核酸序列是否与已知的蛋白质或基因同源，需要有10个或更多邻接的氨基酸或30个或更多核苷酸的序列。此外，对于核苷酸序列，包含20-30个邻接核苷酸的基因特异性寡核苷酸探针可用于序列依赖性的基因鉴定方法(如DNA杂交)和基因分离方法(如细菌菌落的原位杂交或噬菌体噬斑)中。此外，12至15个碱基的短寡核苷酸可在PCR中用作扩增引物，以便获得包含该引物的特定核酸片段。因此，核苷酸序列的“基本部分”所包含的序列应足以特异性地鉴定和/或分离包含该序列的核酸片段。本说明书教导了编码特定蛋白质的完整氨基酸和核苷酸序列。受益于本文所报道的序列，技术人员现在可使用全部公布序列或它们的基本部分用于本领域技术人员已知的目的。
术语“互补”描述了在以反向平行取向对齐时能以Watson-Crick法则进行碱基配对的两条核苷酸碱基序列之间的关系。例如，就DNA而言，腺苷能与胸腺嘧啶碱基配对，胞嘧啶能与鸟嘌呤碱基配对。因此，本发明可利用与所附序列表以及说明书中报道的完整序列互补的分离的核酸分子，以及那些基本相似的核酸序列。
术语“分离的”指从至少一种与其天然相关联的组分移出的多肽核苷酸序列。
“启动子”指能够控制编码序列或功能性RNA表达的DNA序列。启动子序列由近侧和较远端上游元件组成，后一种元件经常指增强子。因此，“增强子”是能刺激启动子活性的DNA序列，并且可以是启动子的固有的元件或插入的异源元件，用以增强启动子的水平或组织特异性。启动子可整个源于天然基因，或者由源于天然存在的不同启动子的不同元件构成，或者甚至包含合成的DNA片段。本领域内的技术人员应当理解，不同的启动子可在不同的组织或细胞类型中，或者在不同的发育阶段，或者响应不同的环境条件而引导基因的表达。还应认识到，由于在大多数情况下还不能完全测定调控序列的确切范围，一些变型的DNA片段可能具有相同的启动子活性。在多数情况下引起基因在大多数细胞型中表达的启动子通常称为“组成型启动子”。
“3′非编码序列”、“转录终止子”和“终止序列”在本文中可互换使用，指位于编码序列下游，包括能够影响mRNA加工或基因表达的多腺苷酸化识别序列和编码调节信号的其他序列的DNA序列。多腺苷酸化信号通常表征为影响多腺苷酸束添加到mRNA前体的3′末端。
术语“有效连接”指单个核酸片段上的核酸序列的关联，使得其中一个核酸序列的功能受到另一个核酸序列的影响。例如，当启动子能够影响编码序列的表达(即，该编码序列受到该启动子的转录控制)时，则该启动子与该编码序列有效连接。编码序列可以有义或反义的取向优选有效连接至调控序列。在另一个实例中，本发明的互补RNA区域均可有效连接(直接连接或间接连接)，在5′端连接至目标mRNA或在3′端连接至目标mRNA，或者连接于目标mRNA内，或者第一互补区域位于目标mRNA的5′端而其互补序列位于目标mRNA的3′端。
本文使用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域所熟知的并且在如下文献中有更全面的描述：Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.Molecular Cloning：A Laboratory Manual；Cold Spring HarborLaboratory：Cold Spring Harbor，NY(1989)。转化方法是本领域技术人员熟知的并且在下文中有描述。
“PCR”或“聚合酶链反应”是用于合成大量的特定DNA片段的技术，并且由一系列重复的循环构成(Perkin Elmer Cetus Instruments，Norwalk，CT)。通常，使双链DNA热变性，两种与目标片段的3′端边界区互补的引物在较低温度下与之退火，然后在中间温度下延伸。一组上述三个连续步骤被称为一个“循环”。
“质粒”或“载体”是通常携带有不属于细胞中心代谢的部分的基因的染色体外元件，并且常常是环状双链DNA片段的形式。这类元件可以是源自任何来源的自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或单链或双链DNA或RNA的核苷酸序列(线性或环状的)，其中多个核苷酸序列已连接或重组为独特构造，该构造能够将表达盒导入细胞中。
术语“遗传改变的”指通过遗传工程改造、转化和/或突变来改变遗传物质的过程。
术语“重组”指两个原本分离的序列片段的人工组合，例如通过化学合成或通过以遗传工程技术操纵分离的核酸片段实现人工合成。“重组体”也包括指已通过导入异源核酸进行改变的细胞或载体，或来源于经如此改变的细胞的细胞，但不涵盖由自然发生事件(例如自发突变、自然转化、自然转导、自然转座)对细胞或载体的改变，例如那些无蓄意的人为干预产生的细胞或载体。
术语“重组构建体”、“表达构建体”、“嵌合构建体”、“构建体”和“重组DNA构建体”在本文可互换使用。重组构建体包括人造的核酸片段组合，例如天然条件下不一起存在的调控序列和编码序列。例如，重组构建体可包含源于不同来源的调控序列和编码序列，或者源于相同来源但以不同于天然存在的方式排列的调控序列和编码序列。此类构建体可独自使用或与载体结合使用。如果使用载体，则载体的选择取决于本领域技术人员熟知的将用于转化宿主细胞的方法。例如可使用质粒载体。技术人员十分了解必须存在于载体上以成功转化、选择和繁殖包含本发明任何分离的核酸片段的宿主细胞的遗传元件。技术人员还将认识到，不同的独立转化事件将导致不同水平和模式的表达(Jones等人，EMBO J.4：2411-2418(1985)；De Almeida等人，Mol.Gen.Genetics 218：78-86(1989))，因此，可能需要对多个事件进行筛选以获得显示期望表达水平和模式的品系。这种筛选可通过DNA的DNA印迹分析、mRNA表达的RNA印迹分析、蛋白表达的免疫印迹分析或表型分析等完成。
本文所用的术语“表达”指产生功能性的终产物(例如mRNA或蛋白质[前体或成熟体])。
术语“导入”指将核酸(例如表达构建体)或蛋白质提供至细胞中的手段。导入包括指将核酸整合进真核或原核细胞中，在该细胞中核酸可整合进细胞的基因组内，并且包括指将核酸或蛋白质暂时提供给细胞。导入包括指稳定的或瞬时的转化方法以及有性杂交。因此，将核酸片段(例如重组DNA构建体/表达构建体)插入细胞内的情况下的“导入”意指“转染”或“转化”或“转导”，并且包括指将核酸片段整合进真核或原核细胞中，在该细胞中核酸片段可以整合进细胞的基因组(如染色体、质粒、质体或线粒体DNA)内、转变成自主复制子或瞬时表达(例如转染的mRNA)。
术语“同源”指具有相似催化功能的共同进化起源的蛋白质或多肽。本发明可包括通过重组技术而产生同源蛋白质的细菌。
本文所公开的是重组细菌，所述重组细菌在其基因组中或在至少一个重组构建体上包含：一种或多种编码具有蔗糖转运蛋白活性的多肽或多肽复合物的核苷酸序列；编码具有果糖激酶活性的多肽的核苷酸序列；编码具有蔗糖水解酶活性的多肽的核苷酸序列；这些核苷酸序列各自可操作地连接至相同的或不同的启动子。这些重组细菌能代谢蔗糖而产生甘油和/或甘油衍生产物例如1，3-丙二醇和3-羟基丙酸。能够产生甘油和/或甘油衍生产物的细菌菌株是高度工程化的菌株，如下面本文描述的。
适用于构建本文所公开的重组细菌的宿主细菌包括但不限于：埃希氏菌属(Escherichia)、Streptococcus(链球菌属)、农杆菌属(Agrobacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、棒状杆菌(Corynebacterium)、乳杆菌属(Lactobacillus)、梭菌属(Clostridium)、葡萄糖杆菌属(Gluconobacter)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、肠杆菌属(Enterobacter)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、气杆菌属(Aerobacter)、甲基杆菌属(Methylobacter)、沙门氏菌属(Salmonella)、链霉菌属(Streptomyces)和假单胞菌属(Pseudomonas)。
在一个实施方案中，宿主细菌选自如下属：埃希氏菌属、克雷伯氏菌属、柠檬酸杆菌属和气杆菌属。
在另一个实施方案中，宿主细菌是大肠杆菌。
在一些实施方案中，宿主细菌是PTS-。在这些实施方案中，宿主细菌在其天然状态下是PTS-，或可如下所述通过使PTS基因失活而实现PTS-
在生产微生物中，有时候期望使糖的转运和磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)用于使被转运的糖磷酸化去偶联。
术语“下调”指与野生型蛋白质相比较，活性蛋白质的活性降低或消失。可通过使一种或多种编码该类型转运所需的蛋白质的内源基因下调而使PTS失活(导致“PTS-”生物体)。下调通常在这些基因中的一种或多种具有“破坏”(指所述基因的一部分内的插入、缺失或靶向沉默)时发生，该破坏导致完全基因敲除使得所述基因从基因组缺失并且没有蛋白质被翻译，或者导致蛋白质已经被翻译使得其具有插入、缺失、氨基酸置换或其他靶向沉默。蛋白质中的破坏位置可以是在，例如蛋白质的N-末端部分内或在蛋白质的C-末端部分内。相对于未受破坏的蛋白质，受破坏的蛋白质将具有削弱的活性，并且可能是无功能的。导致蛋白质表达降低或缺失的下调也可通过如下方式引起：操纵调控序列、转录和翻译因子和/或信号转导途径，或通过使用有义、反义或RNAi技术等。
蔗糖转运多肽或多肽复合物为能够介导蔗糖转运进微生物细胞中的多肽或多肽复合物。蔗糖转运多肽和多肽复合物是已知的，如上所述。具有蔗糖转运蛋白活性的多肽的实例包括但不限于：来自大肠杆菌野生型菌株EC3132的CscB(在SEQ ID NO：24中示出)，其由基因cscB(SEQ ID NO：23中示出的编码序列)编码；来自大肠杆菌ATCC 13281的CscB(在SEQ ID NO：26中示出)，其由基因cscB(SEQID NO：25中示出的编码序列)编码；和来自乳双歧杆菌的CscB(在SEQ ID NO：28中示出)，其由基因cscB(SEQ ID NO：27中示出的编码序列)编码。具有蔗糖转运蛋白活性的多肽复合物的实例包括但不限于：来自肺炎链球菌菌株TIGR4的蔗糖ABC型转运复合物，其包含SEQ ID NO：30、32和34中示出的三个多肽亚基，SEQ ID NO：30、32和34分别由基因susT1(SEQ ID NO：29中示出的编码序列)、susT2(SEQ ID NO：31中示出的编码序列)和susX(SEQ ID NO：33中示出的编码序列)编码；和来自变形链球菌的麦芽糖转运复合物，其包含SEQ ID NO：36、38、40和42中示出的四个多肽亚基，SEQ IDNO：36、38、40和42由分别基因malE(SEQ ID NO：35中示出的编码序列)、malF(SEQ ID NO：37中示出的编码序列)、malG(SEQ IDNO：39中示出的编码序列)和malK(SEQ ID NO：41中示出的编码序列)编码。
在一个实施方案中，根据Clustal V比对方法，具有蔗糖转运蛋白活性的多肽与SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：28所列氨基酸序列具有至少95％的序列同一性。
在另一个实施方案中，具有蔗糖转运蛋白活性的多肽复合物包含：第一亚基，根据Clustal V比对方法，当与SEQ ID NO：30所列氨基酸序列比较时，具有至少95％的序列同一性；第二亚基，根据ClustalV比对方法，当与SEQ ID NO：32所列氨基酸序列比较时，具有至少95％的序列同一性；和第三亚基，根据Clustal V比对方法，当与SEQID NO：34所列氨基酸序列比较时，具有至少95％的序列同一性。
在另一个实施方案中，具有蔗糖转运蛋白活性的多肽复合物包含：第一亚基，根据Clustal V比对方法，当与SEQ ID NO：36所列氨基酸序列比较时，具有至少95％的序列同一性；第二亚基，根据ClustalV比对方法，当与SEQ ID NO：38所列氨基酸序列比较时，具有至少95％的序列同一性；第三亚基，根据Clustal V比对方法，当与SEQ IDNO：40所列氨基酸序列比较时，具有至少95％的序列同一性；第四亚基，根据Clustal V比对方法，当与SEQ ID NO：42所列氨基酸序列比较时，具有至少95％的序列同一性。
在另一个实施方案中，具有蔗糖转运蛋白活性的多肽基本上对应于SEQ ID NO：26中所示的氨基酸序列。
具有果糖激酶活性的多肽包括果糖激酶(命名为EC 2.7.1.4)和多种具有果糖磷酸化活性的己糖激酶(EC 2.7.1.3和EC 2.7.1.1)。果糖磷酸化活性可由己糖激酶和已酮糖激酶展示。表1列出了可用于构建本文所公开的重组细菌的、来自多种微生物的编码多肽的代表性基因。本领域技术人员将认识到，可使用基本类似于能使果糖磷酸化的蛋白质(例如由表1所列基因编码的蛋白质)的蛋白质。
表1
编码具有果糖激酶活性的酶的序列
Figure BPA00001308832300241
在一个实施方案中，根据Clustal V比对方法，具有果糖激酶活性的多肽与SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：48、SEQ IDNO：50、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：85或SEQ ID NO：87中所示的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性。
在另一个实施方案中，具有果糖激酶活性的多肽基本上对应于SEQ ID NO：48中所示的氨基酸序列。
具有蔗糖水解酶活性的多肽具有催化蔗糖水解而产生果糖和葡萄糖的能力。具有蔗糖水解酶活性的多肽是已知的，如上所述，并且包括但不限于：来自大肠杆菌野生型菌株EC3132的CscA(在SEQ IDNO：56中示出)，其由基因cscA(SEQ ID NO：55中示出的编码序列)编码；来自大肠杆菌ATCC 13821的CscA(在SEQ ID NO：58中示出)，其由基因cscA(SEQ ID NO：57中示出的编码序列)编码；来自乳双歧杆菌菌株DSM 10140T的BfrA(在SEQ ID NO：60中示出)，其由基因bfrA(SEQ ID NO：59中示出的编码序列)编码；来自酿酒酵母的Suc2p(在SEQ ID NO：62中示出)，其由基因SUC2(SEQ ID NO：61中示出的编码序列)编码；来自谷氨酸棒状杆菌的ScrB(在SEQ IDNO：64中示出)，其由基因scrB(SEQ ID NO：63中示出的编码序列)编码；来自肠膜状明串珠菌DSM 20193的蔗糖磷酸化酶(在SEQ IDNO：66中示出)，其为SEQ ID NO：65中示出的编码基因的编码的序列；以及来自青春双岐杆菌DSM 20083的蔗糖磷酸化酶(在SEQ IDNO：68中示出)，其由基因sucP(SEQ ID NO：67中示出的编码序列)编码。
在一个实施方案中，根据Clustal V比对方法，具有蔗糖水解酶活性的多肽与SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：60、SEQ IDNO：62、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：66或SEQ ID NO：68中所示的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性。
在另一个实施方案中，具有蔗糖水解酶活性的多肽基本上对应于SEQ ID NO：58中所示的氨基酸序列。
编码具有蔗糖转运蛋白活性的多肽或多肽复合物、具有果糖激酶活性的多肽以及具有蔗糖水解酶活性的多肽可用于从相同或其它微生物物种分离编码同源多肽的核苷酸序列。例如，所述基因的同系物可用序列分析软件，例如BLASTN来搜索可公开获得的核酸序列数据库来鉴定。此外，使用序列依赖性方法来分离同源基因是本领域熟知的。序列依赖性方法的实例包括但不限于核酸杂交方法，以及DNA和RNA扩增的方法，核酸扩增技术的多种用法可以举例说明(如聚合酶链反应(PCR)，Mullis等人，美国专利4,683,202；连接酶链式反应(LCR)，Tabor，S.等人，Proc.Acad.Sci.USA 82,1074，1985；或链置换扩增技术(SDA)，Walker等人，Proc.Natl.Acad.Sci.US.A.，89：392，(1992))。例如，可采用编码上述多肽的核苷酸序列作为用于同系物鉴定的杂交探针。
本领域普通技术人员将理解，分离自其他来源的编码这些多肽的基因也可用于本文所公开的重组细菌。另外，由于密码子简并性可对编码所述多肽的核苷酸序列作出改变而不影响所编码的多肽的氨基酸序列，并且产生基本相似的蛋白质的氨基酸置换、缺失或添加可包括在所编码的蛋白质内。
编码具有蔗糖转运蛋白活性的多肽或多肽复合物、具有果糖激酶活性的多肽和具有蔗糖水解酶活性的多肽的核苷酸序列可用PCR(参见例如美国专利4,683,202)和设计用于结合所需序列(如果该序列已知的话)的引物来分离。其他的基因分离方法是本领域技术人员所熟知的，例如通过使用简并引物或异源探针杂交来分离。核苷酸序列也可以化学方法合成或购自供应商例如DNA2.0Inc.(Menlo Park，CA)。此外，整个csc操纵子可分离自大肠杆菌菌株ATCC 13281的基因组DNA，如本文实施例1中详细描述的。
可用本领域技术人员已知的许多方法之一来实现多肽的表达。例如，可将编码上述多肽的核苷酸序列导入细菌的至少一个多拷贝质粒上，或通过将一个或多个拷贝的编码序列整合进宿主基因组来导入细菌。可将编码所述多肽的核苷酸序列独立地导入宿主细菌中(如导入在独立的质粒上)或以任何组合导入(如导入在单个质粒上，如本文实施例中所述)。如果宿主细菌含有编码所述多核苷酸其中之一的基因，则仅需要导入其余的核苷酸序列至该细菌中。例如，如果宿主细菌含有编码具有果糖激酶活性的多肽的核苷酸序列，则仅需要将编码具有蔗糖转运蛋白活性的多肽的核苷酸序列和编码具有蔗糖水解酶活性的多肽的核苷酸序列导入该细菌以使得能利用蔗糖。在质粒上或在基因组中的所导入的编码区可从至少一个高活性启动子表达。整合的编码区可作为具有其自身启动子的嵌合基因的一部分导入，或者其可以整合邻近基因组内源性的高活性启动子或整合进高度表达的操纵子中。合适的启动子包括但不限于：CYC1、HIS3、GAL1、GAL10、ADH1、PGK、PHO5、GAPDH、ADC1、TRP1、URA3、LEU2、ENO及lac、ara、tet、trp、lPL、lPR、T7、tac和trc(可用于在大肠杆菌中表达)以及amy、apr、npr启动子和可用于在芽孢杆菌属中表达的多种噬菌体启动子。启动子也可以为变铅青链霉菌葡萄糖异构酶启动子或其变体，该变体由Payne等人(美国专利7,132,527)描述。
在一个实施方案中，本文所公开的重组细菌能够产生甘油。利用碳水化合物或糖类制备甘油的生物学过程在酵母以及在某些细菌、其他真菌和藻类中是已知的。细菌和酵母两者均在糖酵解中通过1，6-二磷酸果糖途径转化葡萄糖或其它碳水化物来产生甘油。在本文所公开的产生甘油的方法中，可使用天然产生甘油的宿主细菌。此外，可对细菌进行工程改造以产生甘油和甘油衍生物。从多种底物产生甘油的能力可通过表达酶活性3-磷酸甘油脱氢酶(G3PDH)和/或甘油-3-磷酸酶来提供，如美国专利7,005,291中所述。美国专利7,005,291中描述了可用于在宿主细菌中表达所述酶活性的编码这些蛋白质的基因。编码具有3-磷酸甘油脱氢酶活性的多肽的基因的合适实例包括但不限于：来自酿酒酵母的GPDl(SEQ ID NO：1中示出的编码序列，SEQ IDNO：2中示出的所编码的蛋白质序列)和来自酿酒酵母的GPD2(SEQID NO：3中示出的编码序列，SEQ ID NO：4中示出的所编码的蛋白质序列)。编码具有甘油3-磷酸酶活性的多肽的基因的合适实例包括但不限于：来自酿酒酵母的GPP1(SEQ ID NO：5中示出的编码序列，SEQ ID NO：6中示出的所编码的蛋白质序列)和来自酿酒酵母的GPP2(SEQ ID NO：7中示出的编码序列，SEQ ID NO：8中示出的所编码的蛋白质序列)。
可通过减少靶内源基因的表达而达到甘油产生增加。编码甘油激酶和甘油脱氢酶活性的内源性基因的下调可进一步增强甘油产生，如美国专利7,005,291中所述。可通过减少编码3-磷酸甘油醛脱氢酶的内源性基因的表达来实现碳导向至甘油增加，如美国专利7,371,558所述。可使用本领域已知的任何方法(例如上述用于下调PTS系统的基因的方法)来完成下调。
甘油提供了微生物产生有用产物的底物。这种产物(即甘油衍生物)的实例包括但不限于3-羟基丙酸、甲基乙二醛、1,2-丙二醇和1，3-丙二醇。
在另一个实施方案中，本文所公开的重组细菌能够产生1，3-丙二醇。甘油衍生物1，3-丙二醇是在聚酯纤维的制备及聚氨酯和环状化合物的制造中具有潜在用途的单体。1，3-丙二醇可由单种微生物通过对除甘油或二羟基丙酮之外的碳底物进行生物转化来产生，如美国专利5,686,276中所述。在该生物转化中，从如上所述的碳底物产生甘油。甘油通过脱水酶转化为中间体3-羟基丙醛，该脱水酶可由宿主细菌编码或可通过重组导入宿主中。该脱水酶可以是甘油脱水酶(E.C.4.2.1.30)、二醇脱水酶(E.C.4.2.1.28)或能催化该转化的任何其他酶。编码甘油脱水酶的“α”、“β”和“γ”亚基的基因的合适实例包括但不限于分别来自肺炎克雷伯氏菌的dhaBl(SEQ ID NO：9中示出的编码序列)、dhaB2(SEQ ID NO：11中示出的编码序列)和dhaB3(SEQ ID NO：13中示出的编码序列)。3-羟基丙醛进一步转化为1，3-丙二醇可由1，3-丙二醇脱氢酶(E.C.1.1.1.202)或其他醇脱氢酶催化。编码1，3-丙二醇脱氢酶的基因的合适实例是来自肺炎克雷伯氏菌的dhaT(SEQ ID NO：69中示出的编码序列、SEQ ID NO：70中示出的所编码的蛋白质序列)。
可通过重组方法对细菌进行工程改造以更有效地产生甘油或甘油衍生物1，3-丙二醇。例如，美国专利7,005,291公开了用于产生甘油和1，3-丙二醇的转化微生物和方法，其优势来自于表达3-磷酸甘油脱氢酶和3-磷酸甘油磷酸酶其中之一或两者的外源活性同时破坏内源活性甘油激酶和甘油脱氢酶其中之一或两者。
美国专利6,013,494描述了使用单种微生物来产生1，3-丙二醇的方法，所述单种微生物包含外源3-磷酸甘油脱氢酶、3-磷酸甘油磷酸酶、脱水酶和1，3-丙二醇氧化还原酶(如，dhaT)。美国专利6,136,576公开了用于产生1，3-丙二醇的方法，所述方法包括重组微生物，所述重组微生物还包含脱水酶和蛋白X(后者鉴定为脱水酶复活因子肽)。
美国专利6,514,733描述了对该方法的改进，其中依靠非特异性催化活性(区别于由dhaT编码的1，3-丙二醇氧化还原酶)将3-羟基丙醛转化为1，3-丙二醇而获得滴定度(每升的产物毫克数)的显著提高。另外，美国专利7,132,527公开了可用于产生1，3-丙二醇的载体和质粒。
1，3-丙二醇产生的增加可通过对宿主细菌进行进一步修饰来实现，包括下调某些靶基因的表达和上调某些靶基因的表达，如美国专利7,371,558所述。为了在PTS-宿主中将葡萄糖作为碳源利用，可增加葡萄糖激酶活性的表达。
其增加或上调的表达可增加1，3-丙二醇产生的其他基因包括编码如下酶的基因：
●磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶，通常称为EC 4.1.1.31
●钴胺素腺苷转移酶，通常称为EC 2.5.1.17
●足以催化3-HPA和1，3-丙二醇互变的非特异性催化活性，特别是排除1，3-丙二醇氧化还原酶，通常这些酶为醇脱氢酶
其降低或下调的表达可增加1，3-丙二醇产生的基因包括编码如下蛋白或酶的基因：
●有氧呼吸控制蛋白
●甲基乙二醛合酶
●乙酸激酶
●磷酸转乙酰酶
●醛脱氢酶A
●醛脱氢酶B
●磷酸丙糖异构酶
●磷酸葡糖酸脱水酶
在另一个实施方案中，本文所公开的重组细菌能够产生3-羟基丙酸。3-羟基丙酸具有在特殊合成方面的用途，并且可通过化学工业中已知的技术转化成商业上重要的中间体，例如通过脱水转化为丙烯酸、通过氧化转化为丙二酸、通过与醇的酯化反应转化为酯以及通过还原转化为1，3-丙二醇。3-羟基丙酸可由单种微生物从发酵性碳源生物制备，如共同未决且共同拥有的美国专利申请No.61/187476中所述。在一个代表性的生物合成途径中，可将碳底物转化为3-羟基丙醛，如上面关于1，3-丙二醇制备所描述的。3-羟基丙醛通过醛脱氢酶转化为3-羟基丙酸。醛脱氢酶的合适实例包括但不限于：由大肠杆菌基因aldB(SEQ ID NO：15中示出的编码序列)编码的AldB(SEQ IDNO：16)；由大肠杆菌基因基因aldA(SEQ ID NO：17中示出的编码序列)编码的AldA(SEQ ID NO：18)；和由大肠杆菌基因aldH(SEQ IDNO：19中示出的编码序列)编码的AldH(SEQ ID NO：20)。
也可进行上面描述用于改善重组细菌的1，3-丙二醇产生的许多修饰来提高3-羟基丙酸产量。例如，除去甘油激酶可防止甘油(由G3P磷酸酶作用从G3P形成)消耗ATP而重新转化为G3P。另外，除去甘油脱氢酶(例如gldA)可防止甘油(由NAD依赖性3-磷酸甘油脱氢酶作用从DHAP形成)转化为二羟基丙酮。可对结构基因进行突变以削弱或改善酶活性的活性或可对调控基因(包括启动子区和核糖体结合位点)进行突变，以调节酶活性的表达水平。
上调或下调可通过多种本领域技术人员已知的方法实现。众所周知的是，基因的上调或下调指细胞内存在的源自由所述基因编码的蛋白质的活性水平相对于对照活性(例如由对应的(或未改变的)野生型基因所编码的蛋白质的活性)的水平的改变。
可上调涉及酶途径的特定基因来增加它们所编码的功能的活性。例如，可将所选基因的额外拷贝导入宿主细胞中的多拷贝质粒(例如pBR322)上。这些基因可与导致其所编码的功能活性增加的合适调控序列整合进染色体中。可修饰靶基因以处于非天然启动子或改变的天然启动子的控制下。可通过突变、缺失和/或置换体内改变内源启动子。
或者，相对于给定活性水平降低或消除某些基因的表达可能是有用的。下调(破坏)基因的方法是本领域技术人员已知的。
下调可通过编码区和/或调控(启动子)区的缺失、插入或改变来进行。特定的下调可通过这样获得：进行随机突变，然后进行筛选或选择，或如果基因序列是已知的话，通过本领域技术人员已知的分子生物学方法进行直接干预。实现下调的一种特别有用的但不是排他性的方法是改变启动子的强度。
此外，基因表达的下调可用于防止所关注蛋白质的表达或导致非功能性的蛋白质的表达。这可通过例如下面的方法来完成：1)删除编码区和/或调控(启动子)区，2)将外源核酸序列插入编码区和/或调控(启动子)区，以及3)改变编码区和/或调控(启动子)区(例如，通过改变DNA碱基对)。特定的破坏可通过这样获得：进行随机突变，然后进行筛选或选择，或如果基因序列是已知的话，使用本领域技术人员已知的分子生物学方法进行直接干预。一特别有用的方法是删除大量的编码区和/或调控(调节)区。
改变重组蛋白质表达的方法是本领域技术人员已知的，并且在如下文献中有部分论述：Baneyx，Curr.Opin.Biotechnol.(1999)10：411；Ross等人，J.Bacteriol.(1998)180：5375；deHaseth等人，J.Bacteriol.(1998)180：3019；Smolke和Keasling，Biotechnol.Bioeng.(2002)80：762；Swartz，Curr.Opin.Biotech.(2001)12：195；以及Ma等人，J.Bacteriol.(2002)184：5733。
包含如上所述的用于在产生微生物产物(包括甘油和甘油衍生物)中代谢蔗糖的基因表达的必要改变的重组细菌可用本领域熟知的技术构建，在本文的实施例中对某些所述技术进行示例说明。
本文所公开的重组细菌的构建可用多种适于编码区的克隆、转化和表达的载体及转化和表达盒来完成，所述编码区可在合适的宿主微生物中赋予在产生甘油及其衍生物中利用蔗糖的能力。合适的载体是与所采用的细菌相容的那些。合适的载体可，例如源于细菌、病毒(例如噬菌体T7或M-13衍生的噬菌体)、粘粒、酵母或植物。用于获得和使用这些载体的方法是本领域技术人员已知的(Sambrook等人，同上)。
可用于驱动本发明的编码区在所需宿主细胞中表达的起始控制区或启动子有很多，并且为本领域技术人员所熟悉。事实上，任何能驱动表达的启动子均适用于本发明。例如，可使用任何上文列出的启动子。
终止控制区也可源于优选宿主的天然的多种基因。任选地，终止位点可以是非必需的；然而，如果包括则是最优选的。
为了本发明多肽有效表达，将编码所述多肽的核苷酸序列通过起始密码子有效连接至所选表达控制区，使得表达导致形成合适的信使RNA。
在本发明中特别有用的是美国专利7,371,558中描述的载体pSYCO101、pSYCO103、pSYCO106和pSYCO109以及美国专利7,524,660中描述的pSYCO400/AGRO。这些载体的必要元件源自分离自肺炎克雷伯氏菌和分离自酿酒酵母dha调节子。每一载体含有开放阅读框dhaB1、dhaB2、dhaB3、dhaX(SEQ ID NO：71中示出的编码序列)、排列在三个独立操纵子中的orfX、DAR1和GPP2。pSYCO101、pSYCO103、pSYCO106、pSYCO109和pSYCO400/AGRO的核苷酸序列分别在SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：74、SEQ IDNO：75和SEQ ID NO：76中示出。所述载体之间的不同在下面的一览表中说明[前缀“p-”指启动子；包括在每个“()”中的开放阅读框表示操纵子的组成]：
pSYCO 101(SEQ ID NO：72)：
p-trc (Dar1_GPP2)，与另外两个途径操纵子相比取向相反，
p-1.6长GI(dhaB1_dhaB2_dhaB3_dhaX)和
p-1.6长GI(orfY_orfX_orfW)。
pSYCO103(SEQ ID NO：73)：
p-trc(Dar1_GPP2)，与另外两个途径操纵子相比取向相同，
p-1.5长GI(dhaB 1_dhaB2_dhaB3_dhaX)和
p-1.5长GI(orfY_orfX_orfW)。
pSYCO106(SEQ ID NO：74)：
p-trc(Dar1_GPP2)，与另外两个途径操纵子相比取向相同，
p-1.6长GI(dhaB1_dhaB2_dhaB3_dhaX)和
p-1.6长GI(orfY_orfX_orfW)。
pSYCO109(SEQ ID NO：75)：
p-trc(Dar1_GPP2)，与另外两个途径操纵子相比取向相同，
p-1.6长GI(dhaB1_dhaB2_dhaB3_dhaX)和
p-1.6长GI(orfY_orfX)。
pSYCO400/AGRO(SEQ ID NO：76)：
p-trc (Dar1_GPP2)，与另外两个途径操纵子相比取向相同，
p-1.6长GI(dhaB 1_dhaB2dhaB3_dhaX)和
p-1.6长GI(orfY_orfX)。
p-1.20短/长GI(scrK)，与所述途径操纵子相比取向相反。
一旦构建了合适的表达盒，则将它们用于转化合适的宿主细菌。含有所述编码区的表达盒导入宿主细菌可通过已知的步骤完成，例如通过转化(如使用钙透化细胞或电穿孔)或通过用重组噬菌体病毒转染(Sambrook等人，同上)。表达盒可在宿主细胞中维持在稳定质粒上。此外，可使用本领域技术人员熟知的载体和方法，通过同源或随机重组将表达盒整合进宿主细菌的基因组中。也可将位点特异性重组系统用于表达盒的基因组整合。
除了举例说明的细胞，还可使用经特别设计以增强微生物产物(包括甘油和/或其衍生物)的产量的具有单突变或多突变的细胞。可使正常将碳原料分流至非生产性途径的细胞或表现出显著分解代谢阻遏的细胞突变以避免这些表型缺陷。
产生突变体的方法是通用的并且为本领域所熟知。美国专利7,371,558给出了关于某些方法的概述。利用辐射或化学剂产生突变体的具体方法在本领域中得到很好评述。例如，参见Thomas D.Brock的Biotechnology：ATextbook of Industrial Microbiology，第二版，(1989)Sinauer Associates，Inc.，Sunderland，MA.或Deshpande，Mukund V.，Appl.Biochem.Biotechnol.36，227(1992)。
在发生诱变后，可通过多种方法选择具有所需表型的突变体。随机筛选是最通用的，在该方法中针对经诱变处理的细胞产生所需产物或中间体的能力对其进行筛选。或者，可通过使经诱变处理的群体在选择培养基上生长而进行对突变体的选择性分离，其中仅抗性菌落可生长。突变体选择的方法是高度发展的并且为工业微生物学领域所熟知。参见，例如Brock(同上)；DeMancilha等人，Food Chem.14，313(1984)。
本发明的发酵培养基包含蔗糖作为碳底物。其他碳底物例如葡萄糖和果糖也可以存在。
除了碳底物，合适的发酵培养基还含有例如本领域技术人员已知的合适矿物质、盐、辅因子、缓冲液和其他组分，其适于培养物的生长和产生甘油及其衍生物(例如1，3-丙二醇)所必需的酶途径的促进。在1，3-丙二醇的产生中，特别要注意Co(II)盐和/或维生素B12或其前体。
腺苷钴胺素(辅酶B12)是脱水酶活性的重要辅因子。辅酶B12的合成存在于原核生物中，原核生物某些能够从头合成该化合物，例如蟑螂埃希菌(Escherichia blattae)、克雷伯氏菌属物种、柠檬酸杆菌属物种和梭菌属物种，而其他物种则可进行部分反应。大肠杆菌，例如不能产生咕啉环结构，但能够催化钴啉醇酰胺转化为类咕啉并且可引入5′-脱氧腺苷基团。因而，本领域已知的是在大肠杆菌发酵中需要提供辅酶B12前体(例如维生素B12)。维生素B12可以恒定速率连续添加给大肠杆菌发酵或分阶段添加以与细胞群体的产生相符，或可以单次或多次推注添加。
尽管维生素B12添加至本文所述的转化大肠杆菌，但考虑能从头生物合成维生素B12的其他细菌也将是合适的生产细胞，向这些细菌添加维生素B12将是不必要的。
通常，细菌在含有蔗糖的合适培养基中于25至40℃下生长。适用于本实例的生长培养基是普通的商业制备的培养基，例如Luria
Bertani(LB)肉汤、Sabouraud Dextrose(SD)肉汤或酵母培养基(YM)肉汤。也可以使用其他确定的或合成的生长培养基，微生物学或发酵科学领域的技术人员将知道用于具体细菌生长的合适培养基。已知可直接或间接调节分解代谢物阻遏的试剂，如环腺苷2′∶3′-单磷酸，也可以掺入反应培养基中。类似地，可将已知可调节导致1，3-丙二醇产生增加的酶活性的试剂(如甲基紫精)与产1，3-丙二醇菌株的遗传操纵结合使用或作为对产1，3-丙二醇菌株的遗传操纵的替代。
适于发酵的pH范围在pH 5.0至pH 9.0之间，其中pH 6.0至pH 8.0通常作为起始条件。
取决于重组细菌的要求，可在有氧、缺氧或无氧条件下进行反应。分批补料发酵可用有限的或过量的碳源例如碳底物来进行。
分批发酵是通常使用的方法。经典的分批发酵是封闭系统，其中培养基的组成在发酵开始时设定并且在发酵过程中不进行人工改变。因此，在发酵开始时，用所需细菌对培养基进行接种，在不向系统添加物质的情况下进行发酵。然而，通常来说，“分批”发酵是指碳源的添加是分批的，但经常试图控制诸如pH和氧浓度之类的因素。在分批发酵系统中，代谢产物和生物质组成持续改变直至发酵结束。在分批培养物内，细胞缓慢通过静态延滞期到达高速生长对数期，并最后达到稳定期，此时生长速率减缓或终止。如果不加以处理，稳定期中的细胞将最终死亡。通常，对数期中的细胞负责产生大部分终产物或中间产物。
标准分批式系统的一种变型是补料分批系统。补料分批发酵工艺也适用于本发明，并且包括典型的分批式系统，不同的是随着发酵进程递增地添加底物。在分解代谢阻遏往往抑制细胞的代谢作用以及在期望培养基中具有有限量的底物的情况下，补料分批式系统是有用的。补料分批式系统中的实际底物浓度难以测量并因而可根据可测量因素例如pH、溶解氧以及废气如CO2的分压进行评估。分批发酵和补料分批发酵在本领域内是常用的且众所周知，并且实例可见于Brock(同上)。
连续发酵是一种开放式系统，其中将设定好的发酵培养基连续加入生物反应器中，并同时移出等量调理过的培养基用于加工。连续发酵一般使培养物维持在恒定的高密度下，其中细胞主要处于对数生长期。
连续发酵允许调节一种因素或任意数目的因素，这些因素影响细胞生长或终产物浓度。例如，一种方法将维持限制性营养物质例如碳源或氮水平处于固定速率并允许所有其他参数适度。在其他系统中，可连续改变影响生长的许多因素，而细胞浓度保持不变，细胞浓度通过培养基浊度测量。连续系统力求维持稳态的生长条件，并因而在发酵过程中由于培养基被取出而导致的细胞损失必须与细胞的生长率保持平衡。用于调节连续发酵工艺中的营养物质和生长因子的方法以及使产物形成速率保持最高水平的方法是工业微生物学领域众所周知的，并且多种方法已由Brock(同上)详细描述。
考虑可采用分批发酵、补料分批发酵或连续发酵工艺来实施本发明，并且任何已知的发酵模式均将适用。另外，考虑可将细胞固定在基材上作为整细胞催化剂并处于发酵条件下，用于产生甘油和甘油衍生物，例如1，3-丙二醇。
在一个实施方案中，提供了用于从蔗糖制备甘油、1，3-丙二醇和/或3-羟基丙酸的工艺。该工艺包括如下步骤：在存在蔗糖的情况下培养如上所述的重组细菌，以及任选回收所产生的甘油、1，3-丙二醇和/或3-羟基丙酸。所述产物可用本领域已知的方法回收。例如，可通过离心、过滤、滗析等方法从发酵培养基中移除固体。然后，可使用诸如蒸馏、液-液萃取或基于膜的分离从发酵培养基分离产物，所述培养基已如上所述经处理而移除了固体。
实施例
本发明将在下面的实施例中进一步限定。应该理解，尽管这些实施例说明了本发明的优选实施方案，但仅是以例证的方式给出的。通过上述论述和这些实施例，本领域的技术人员可确定本发明的必要特征，并且在不脱离本发明的实质和范围的前提下，可对本发明进行各种变化和修改以适应多种用途和条件。
一般方法
实施例中描述的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域所熟知的，并且如下文献进行了描述：Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.Molecular Cloning：ALaboratory Manual；Cold Spring HarborLaboratory Press：Cold Spring Harbor，(1989)(Maniatis)、T.J.Silhavy，M.L.Bennan和L.W.Enquist，Experiments with Gene Fusions，ColdSpring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.(1984)、Ausubel，F.M.等人，Current Protocols in Molecular Biology(Greene PublishingAssoc.and Wiley-Interscience出版，(1987))。
适于细菌培养物维持及生长的材料和方法在领域所熟知的。适用于如下实施例的技术可在如下文献列出的内容中找到：Manual ofMethods for General Bacteriology(Ph i l l ipp Gerhardt，R.G.E.Murray，Ralph N.Costilow，Eugene W.Nester，Willis A.Wood，Noel R.Krieg和G.Briggs Phillips编辑)，American Society for Microbiology，Washington，DC.(1994))或Thomas D.Brock的Biotechnology.：ATextbook of Industrial Microbiology，Second Edition，Sinauer Associates，Inc.，Sunderland，MA(1989)。描述用于细菌细胞生长和维持的所有试剂、限制性酶和材料可从Aldrich Chemicals(Milwaukee，WI)、BDDiagnostic Systems(Sparks，MD)、Life Technologies(Rockville，MD)、New England Biolabs(Beverly，MA)或Sigma Chemical Company(St.Louis，MO)获得。
缩写的含义如下：“s”意指秒，“min”意指分钟，“h”意指小时，“nm”意指纳米，“μL”意指微升，“mL”意指毫升，“L”意指升，“mM”意指毫摩尔每升，“M”意指摩尔每升，“g”意指克，“μg”意指微克，“bp”意指碱基对，“kbp”意指千碱基对，“rpm”意指每分钟转数，“ATCC”意指美国典型培养物保藏中心(Manassas，VA)，“dH2O”意指蒸馏水。
实施例1
csc操纵子表达质粒的构建
该实施例示出了csc操纵子表达质粒pBHRcscBKA和pBHRcscBKAmutB的构建。
从大肠杆菌菌株ATCC 13281分离基因组DNA并用EcoRI和BamHI消化。通过Tris-硼酸-EDTA琼脂糖凝胶电泳分离长大约4kbp的片段并与已用EcoRI和BamHI消化的质粒载体pLitmus28(NewEngland Biolabs，Beverly，MA)连接。将所得的质粒用于转化大肠杆菌菌株DH5alpha(Invitrogen，Carlsbad，CA)，通过在含有100μg/mL氨苄青霉素的MacConkey蔗糖琼脂(MacConkey琼脂基，购自Difco，Sparks，MD)上生长来鉴别含有利用蔗糖所需的基因的转化体。从已获得代谢蔗糖能力的菌落分离质粒DNA，并对所述质粒(命名为pScr1；在SEQ ID NO：77中示出)进行测序以鉴定利用蔗糖所必需的DNA区。该插入序列长4140bp并且含有与已知的大肠杆菌蔗糖利用基因cscB、cscK和cscA(Jahreis等人，J.Bacteriol.184：5307-5316，2002)同源的推定开放读框。
随后使用如下步骤将该csc操纵子移转至质粒pBHR1(MobiTecGmbH，Goettingen，Germany)。
将质粒pScr1用XhoI消化并用Klenow片段处理以得到平端，然后用AgeI消化。通过凝胶纯化分离所得的含有所述csc基因的4175bp片段。用AgeI和NaeI消化质粒pBHR1，通过凝胶纯化分离所得的5142bp片段。然后连接这两个凝胶纯化的片段，将所得的质粒用于转化大肠杆菌菌株DH5alpha。通过在含有50μg/mL卡那霉素的LuriaBertani (LB)琼脂上生长来选择转化体。从该转化体分离质粒DNA，验证该质粒的序列。将该质粒命名为pBHRcscBKA(在SEQ ID NO：78中示出)。
通过用Stratagene
Figure BPA00001308832300371
定点诱变试剂盒(Stratagene，LaJolla，CA)在pBHRcscBKA中进行单碱基对置换产生另一表达质粒。在位置4263处的胸腺嘧啶碱基置换为鸟嘌呤，所得的质粒命名为pBHRcscBKAmutB(在SEQ ID NO：79中示出)。该置换导致由cscB编码的多肽中的谷氨酰胺残基置换为组氨酸，据报道该变化可改变来自大肠杆菌菌株EC3132的同源蛋白质的转运能力(Jahreis等人，同上)。
实施例2至4
具有csc操纵子的重组大肠杆菌菌株的构建
这些实施例示出了用包含csc操纵子的质粒转化的重组大肠杆菌菌株的构建。证实了这些重组菌株消耗蔗糖并从蔗糖产生终产物1，3-丙二醇(PDO)和甘油。
大肠杆菌菌株TTab pSYCO109
通过从美国专利7,371,558(实施例17)中描述的菌株TT aldA删除aldB基因而产生菌株TTab。简而言之，aldB缺失可这样来产生：首先，用pKD3质粒(Datsenko和Wanner，Proc.Natl.Acad. Sci.USA97：6640-6645，2000)的FRT-CmR-FRT盒替换大肠杆菌菌株MG 1655(可得自美国典型培养物保藏中心，ATCC No：700926)中的aldB的1.5kbp编码区。置换盒用引物对SEQ ID NO：80和SEQ ID NO：81，采用pKD3作为模板来扩增。引物SEQ ID NO：80含有80bp的aldB 5’端的同源序列和20bp的pKD3的同源序列。引物SEQ ID NO：81含有80bp的aldB 3’端的同源序列和20bp的pKD3的同源序列。将该PCR产物用凝胶纯化并电穿孔进MG1655/pKD46感受态细胞内(美国专利7,371,558)。在具有12.5mg/L氯霉素的LB板上选择重组株。使用引物对SEQ ID NO：82和SEQ ID NO：83，通过PCR确认aldB基因的缺失。野生型菌株产生1.5kbp PCR产物，而重组株产生特征性的1.1kbpPCR产物。制备P1溶胞产物并用于将所述突变移至TT aldA株而形成TT aldAΔaldB::Cm株。用采用引物对SEQ ID NO：82和SEQ IDNO：83的基因组PCR检验氯霉素抗性克隆以确保存在所述突变。用FLP重组酶(Datsenko和Wanner，同上)移除氯霉素抗性标记以产生菌株TTab。然后用美国专利7,371,558中描述的pSYCO109(在SEQ IDNO：75中示出)转化菌株TTab，以产生菌株TTab pSYCO109。
如所引用的参考文献中所述，菌株TTab是大肠杆菌菌株FM5(ATCC No.53911)的衍生菌株，包含如下修饰：
glpK、gldA、ptsHI、crr、edd、arcA、mgsA、qor、ackA、pta、aldA和aldB基因缺失；
galP、glk、btuR、ppc和yqhD基因上调；以及
gapA基因下调。
质粒pSYCO 109含有编码甘油产生途径的基因(DAR1和GPP2)以及编码甘油脱水酶和相关复活因子的基因(dhaB123、dhaX、orfX、orfY)。
用实施例1中所述的两种csc操纵子过表达质粒pBHRcscBKA和pBHRcscBKAmutB中的每一者转化菌株TTab/pSYCO109。通过在含有50μg/mL壮观霉素和50μg/mL卡那霉素的LB琼脂上生长来选择转化株。选取单独的菌落并在具有相同抗生素的LB肉汤中在34℃下摇动(250rpm)培养过夜。将对照菌株TTab/pSYCO109在除了卡那霉素之外的相同条件下培养。
将这些过夜培养物稀释进含有10.5g/L蔗糖的TM3培养基中至光密度为0.01单位(550nm下测量)。TM3是含有13.6g/L KH2PO4、2.04g/L二水柠檬酸合物、2g/L七水硫酸镁、0.33g/L柠檬酸铁铵、0.5g/L酵母提取物、3g/L硫酸铵、0.2g/L CaCl2·2H2O、0.03g MnSO4·H2O、0.01g/L NaCl、1mg/L  FeSO4·7H2O、1mg/L、CoCl2·6H2O、1mg/LZnSO4·7H2O、0.1mg/L  CuSO4·5H2O、0.1mg/L  H3BO4、0.1mg/LNaMoO4·2H2O和足以使最终pH为6.8的NH4OH的基础培养基。将维生素B12添加至该培养基中至浓度为0.1mg/L。将培养物在34℃下摇动(225rpm)孵育24小时。在孵育后0、5、8、11、14、17、20和23小时移出等分试样，通过高效液相色谱测定所述肉汤中的蔗糖、甘油和1，3-丙二醇(PDO)浓度。
色谱分离用Aminex HPX-87P柱(Bio-Rad，Hercules，CA)，采用dH2O等度流动相，流速0.5mL/min，柱温度为60℃来实现。通过示差折光检测法参照标准曲线定量洗脱的化合物，标准曲线从商购获得的溶解于TM3培养基中至已知浓度的纯化合物制备。保留时间为：蔗糖12.2分钟、1，3-丙二醇17.9分钟以及甘油23.6分钟。
在这些条件下，两种csc表达质粒(实施例3和4)均导致代谢蔗糖以及产生PDO和甘油，而对照亲本株(实施例2，对比物)不能代谢蔗糖或产生PDO或甘油(参见表2-4)。表中给出的数据点代表一式两份的培养物的测量结果的平均值。
表2
蔗糖消耗
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表3
PDO产量
表4
甘油产量
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Claims (13)

1.重组细菌，所述重组细菌在其基因组中或在至少一个重组构建体上包含：
(a)一种或多种编码具有蔗糖转运蛋白活性的多肽或多肽复合物的核苷酸序列；
(b)编码具有果糖激酶活性的多肽的核苷酸序列；和
(c)编码具有蔗糖水解酶活性的多肽的核苷酸序列；
其中(a)、(b)和(c)各自可操作地连接至相同的或不同的启动子，
另外其中所述重组细菌能够代谢蔗糖以产生选自甘油、1，3-丙二醇和3-羟基丙酸的产物。
2.权利要求1的重组细菌，其中基于Clustal V比对方法，在与SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：28中示出的氨基酸序列比较时，所述具有蔗糖转运蛋白活性的多肽具有至少95％的序列同一性。
3.权利要求1的重组细菌，其中所述具有蔗糖转运蛋白活性的多肽复合物包含：
a)第一亚基，其中基于Clustal V比对方法，在与SEQ ID NO：30中示出的氨基酸序列比较时，所述第一亚基具有至少95％的序列同一性；
b)第二亚基，其中基于Clustal V比对方法，在与SEQ ID NO：32中示出的氨基酸序列比较时，所述第二亚基具有至少95％的序列同一性；和
c)第三亚基，其中基于Clustal V比对方法，在与SEQ ID NO：34中示出的氨基酸序列比较时，所述第三亚基具有至少95％的序列同一性。
4.权利要求1的重组细菌，其中所述具有蔗糖转运蛋白活性的多肽复合物包含：
a)第一亚基，其中基于Clustal V比对方法，在与SEQ ID NO：36中示出的氨基酸序列比较时，所述第一亚基具有至少95％的序列同一性；
b)第二亚基，其中基于Clustal V比对方法，在与SEQ ID NO：38中示出的氨基酸序列比较时，所述第二亚基具有至少95％的序列同一性；
c)第三亚基，其中基于Clustal V比对方法，在与SEQ ID NO：40中示出的氨基酸序列比较时，所述第三亚基具有至少95％的序列同一性；和
d)第四亚基，其中基于Clustal V比对方法，在与SEQ ID NO：42中示出的氨基酸序列比较时，所述第四亚基具有至少95％的序列同一性。
5.权利要求1的重组细菌，其中基于Clustal V比对方法，在与SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50、SEQID NO：52、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：85或SEQ ID NO：87中示出的氨基酸序列比较时，所述具有果糖激酶活性的多肽具有至少95％的序列同一性。
6.权利要求1的重组细菌，其中基于Clustal V比对方法，在与SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：62、SEQID NO：64、SEQ ID NO：66或SEQ ID NO：68示出的氨基酸序列比较时，所述具有蔗糖水解酶活性的多肽具有至少95％的序列同一性。
7.权利要求1的重组细菌，其中所述具有蔗糖转运蛋白活性的多肽基本上对应于SEQ ID NO：26中示出的序列。
8.权利要求1的重组细菌，其中所述具有果糖激酶活性的多肽基本上对应于SEQ ID NO：48中示出的序列。
9.权利要求1的重组细菌，其中所述具有蔗糖水解酶活性的多肽基本上对应于SEQ ID NO：58中示出的序列。
10.权利要求1-9中任一项的重组细菌，其中所述细菌选自如下属：埃希氏菌属(Escherichia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)和气杆菌属(Aerobacter)。
11.权利要求10的重组细菌，其中所述细菌为大肠杆菌。
12.用于从蔗糖制备甘油、1，3-丙二醇和/或3-羟基丙酸的方法，所述方法包括：
a)在存在蔗糖的情况下培养权利要求1-9中任一项的重组细菌；以及
b)任选地，回收所产生的甘油、1，3-丙二醇和/或3-羟基丙酸。
13.用于从蔗糖制备甘油、1，3-丙二醇和/或3-羟基丙酸的方法，所述方法包括：
a)在存在蔗糖的情况下培养权利要求10的重组细菌；以及
b)任选地，回收所产生的甘油、1，3-丙二醇和/或3-羟基丙酸。
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