CN103074295A - 一种医用人羊膜组织储备库的构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种医用人羊膜组织储备库的构建方法，包括下述步骤：1、人羊膜的选材及建档；2、取供体符合医学标准剖腹产或正常分娩的胎膜，分离绒毛膜留取羊膜；3、羊膜用磷酸盐缓冲液反复漂洗后，剪成膜片；4、用含1000U/ml庆大霉素和2.5μg/ml二性霉素B的磷酸盐缓冲液浸泡；5、置入含4%～100%甘油的磷酸盐缓冲液混合液的无菌细胞培养瓶或塑料袋中，于-20-80℃冷冻保存；6、将人羊膜片用钴60辐照灭菌处理后，获得医用人羊膜组织膜片；7、将羊膜组织膜片置于-80℃冷冻储存，建立可供检索的羊膜组织膜片档案，即构建出具有保存时间长并可及时有效用于临床治疗的人羊膜组织膜片储备库。
Description
技术领域
本发明涉及一种人体组织储备库的构建方法，具体地说涉及一种医用人羊膜组织储备库的构建方法。
背景技术
随着社会的不断发展和人民生活水平的不断提高及人口老龄化，由各种疾病导致的慢性难愈合创面创面也日益增多，已经成为严重危害人民身心健康、降低其生活和工作质量，以及增加社会医疗保障负担的重要原因。尤其是肛周疾病不仅术后创面难愈合，而且换药时患者创口疼痛难忍，创面容易出血或渗血，包扎困难，易被粪便污染，限制患者活动时间长等，给患者造成极大的躯体上和精神上的痛苦。与此同时，因慢性难愈合创面治疗所花费的医疗资源也明显增加。慢性难愈合创面的防控已经成为近年来国内乃至国际创面治疗的一个难点。
人羊膜是胎盘的最内层，构成胎盘的胎儿部分。它是人胚胎时期羊膜囊扩大的囊壁，附着于绒毛膜内表面的透明薄膜。在妊娠晚期，羊膜与绒毛膜虽与紧密相贴但能与绒毛膜完全分开。羊膜组织光滑为含单层上皮细胞的半透明组织，无血管、神经和淋巴管，具有一定的弹性。正常羊膜厚度为0.02-0.5mm，是人体最厚的基底膜。羊膜的基底膜的形态与皮肤基底膜非常相似，且主要由层粘连蛋白和Ⅳ型胶原组成。此外人羊膜是医疗废弃物，来源广泛，取材方便，其作为一种生物敷料较早用于烧伤创面的覆盖，不仅可以降低创面的炎症促进上皮化而且抑制瘢痕的形成。但是，实时获取用与肛周手术创面的新鲜或冻存灭菌的羊膜组织膜片存在很大的难度，因此，寻找简单、有效的羊膜保存方法则具有重要的临床意义和经济意义。
人羊膜组织来源丰富容易获得，含有很多有优势的特征如免疫原性低，抗炎效果显著而且在获取细胞的时候也不会损伤人的胚胎等。因此，认为羊膜组织是再生医学领域很有应用前景的一种生物材料。但是，目前在足月生产之后一般羊膜与其他胎儿附属物要求都被丢弃了。
因此，无论何时需要，在使用胎膜作为羊膜来源的情况下，难以在分娩之后立即收集胎膜组织。事实上，对胎盘组织的工业应用（胎盘注射液、胎盘化妆品等）来说，在分娩之后收集的胎盘组织被冷藏以便使用。但新鲜羊膜仅仅从分娩之后立即收集的胎膜中才能大量获得。即胎膜组织娩出数小时之后或者经长时间冷藏的胎膜组织得到大量羊膜非常困难。由于这种原因，为了在临床应用中使用来自胎膜的大量羊膜，迫切需要开发从新鲜的胎膜中制备大量羊膜及冷冻储存的工艺。
人组织储备库是在约-80℃冰箱（深低温）储存人体组织或搜集存储组织资源的场所。一个完善的组织库应具备随时随地将健康组织提供临床使用的能力。目前，在世界范围内，波兰和印度等国家已建立人体组织储存库，储存骨髓、骨和羊膜等人体组织。人羊膜组织储备库所做的工作是将胎膜采集后经过分离获得羊膜冷冻并储存起来，可分为资料库和实物库。资料库所做的工作是将健康提供者的羊膜进行资料登记，实物库则是在进行资料登记的同时，采集和储存健康提供者可供临床使用的羊膜。目前，国内尚无人羊膜组织储备库，每年大量的羊膜被废弃，羊膜资源严重流失。
因此，本发明的发明人付出了许多努力来制备来自胎膜的大量新鲜羊膜且采用辐照灭菌技术，构建人羊膜组织储备库，于-80℃冰箱深低温冷冻储存大量的人羊膜膜片以便其临床实时实践应用。
发明内容
本发明针对上述现有技术存在的问题而提供一种充分利用胎儿附属物—羊膜为资源的医用人羊膜组织储备库的构建方法。
本发明的技术方案如下：
一种医用人羊膜组织储备库的构建方法，包括下述步骤：
（1）人羊膜的选材严格遵循供体符合医学标准并建立资料档案；
（2）取供体符合医学标准剖腹产或正常分娩的胎膜，从胎膜上钝性分离羊膜；（3）用磷酸盐缓冲液或0.9%生理盐水反复漂洗后，任意剪成一定大小的圆形或方形的膜片，并用无菌缝合线对基底膜面层进行标记；
（4）用含1000U/ml庆大霉素和2.5μg/ml二性霉素B的磷酸盐缓冲液或0.9%生理盐水浸泡30～40分钟；
（5）置入含4%～100%甘油的磷酸盐缓冲液或0.9%生理盐水混合液75ml～250m无菌细胞培养瓶中或塑料袋中，置于-20～-80℃深低温冰箱中冷冻保存；
（6）将上述方法制得的人羊膜片，用钴60辐照灭菌处理后，辐照剂量为25kGy，即获得医用人羊膜组织片；
（7）将医用人羊膜组织片置于-20～-80℃深低温冰箱冷冻储存，按膜片面积大小和娩出新生儿性别进行保存，建立可供检索的羊膜组织膜片信息档案，即构建出医用人羊膜组织储备库。
上述全部过程均在无菌环境中进行操作。
本发明的优点如下：
本发明所获得医用人羊膜组织储存于细胞培养瓶和塑料袋中，用含4%甘油的磷酸盐缓冲液（PBS）或0.9%生理盐水的培养基，置-80℃深低温冰箱冷冻储存，可得到大量人羊膜组织用于临床创面治疗和科学研究。
本发明医用人羊膜组织储备库的构建方法，可从胎膜中获得大量的羊膜组织，建立系统工程技术组织储存库，它是一种将现有资源充分利用的有效方法，根据本发明的方法，存储于库内的羊膜，能够长期保存而不失活性，突破了人羊膜组织用于治疗的及时性和有效性的技术瓶颈，为临床及时提供人羊膜组织膜片治疗各种急性或慢性创面。因此，该方法可被用于有效制备管理储存人羊膜组织片，其操作简单易行，建库成本低廉，富有应用前景。
附图说明：
图1是 新鲜羊膜的组织结构图。
图2 是冷冻羊膜的组织结构图。
图3 是实施例3用冷冻羊膜组织膜片贴敷于坏死性筋膜炎创面的图示。
具体实施方式：
下面结合附图和具体实施例详细描述本发明。
实施例1：
本发明医用人羊膜组织储备库的构建方法，包括下述步骤：
（1）人羊膜的选材严格遵循供体符合医学标准并建立资料档案；
（2） 取供体符合医学标准剖腹产的胎膜，从胎膜上钝性分离羊膜；如图1所示。
（3）用0.9%生理盐水反复漂洗后剪成一定大小的长方形的膜片，如10×12cm2并用无菌缝合线对基底膜面层进行标记；
（4）用含1000U/ml庆大霉素和2.5μg/ml二性霉素B的0.9%生理盐水浸泡30分钟；
（5）置入含4%甘油的0.9%生理盐水混合液75ml无菌细胞培养瓶中，置于-80℃深低温冰箱中冷冻保存；
（6）将上述方法制得的人羊膜组织膜片，用钴60辐照消毒灭菌处理后，辐照剂量25kGy，获得医用人羊膜组织膜片，置于-80℃深低温冰箱中冷冻保存；即制备出建库所需的人羊膜组织膜片，如图2所示。
上述操作过程均在严格无菌环境内进行，为保证羊膜组织不受污染，所使用的0.9%生理盐水均加入1000U/ml庆大霉素和2.5ug/ml二性霉素B。
羊膜来源的安全控制：取健康正常或剖腹产后的胎膜组织，排除乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、梅毒、获得性免疫缺陷病毒、巨细胞病毒和衣原体等，对孕妇进行跟踪检测，检测结果记入每个羊膜的生产记录档案。
将所获得的羊膜组织储存在-80℃深低温冰箱里，作为库存的产品。将其详细信息（包括供者姓名、年龄、住院号、新生儿性别和化验检查信息等）输入电脑数据库，建立完善的数据档案备查询。
实施例2
（1）人羊膜的选材严格遵循供体符合医学标准并建立资料档案；
（2）取供体符合医学标准正常分娩的胎膜，从胎膜上钝性分离羊膜；
（3）用磷酸盐缓冲液（PBS）水反复漂洗后剪圆形直径7cm并用无菌缝合线对基底膜面层进行标记；
（4）用含1000U/ml庆大霉素和2.5μg/ml二性霉素B的磷酸盐缓冲液（PBS）浸泡40分钟；
（5）置入含10 %甘油的磷酸盐缓冲液（PBS）混合液150ml塑料袋中，置于-80℃深低温冰箱中冷冻保存；
（6）将上述方法制得的人羊膜组织膜片，用钴60辐照灭菌处理后，辐照剂量25kGy，获得医用人羊膜组织膜片，置于-80℃深低温冰箱中冷冻保存；即制备出人羊膜组织膜片。
在临床试验时，将上述库储存羊膜室温解冻后备用。将肛肠外科藏毛窦术后创面进行常规清创，剔除坏死的表皮和脓性分泌物，清创后创面4×4×3 cm3用消毒纱布浸沾干创面后，开始贴敷膜片，取大于创面外缘1cm的膜片即直径5cm膜片，按无菌缝合线进行基底膜面层标记将膜片基底膜面贴敷与创面，并使羊膜组织膜片与创面紧密贴敷之间无气泡，观察至创面晾干或湿润无大量渗出物即可。膜片外不需要用其他任何敷料再行对创面进行包扎，患者膜片贴敷后，疼痛明显减轻，临床疼痛评分1-2分或无疼痛。身体活动不受限。急性创面经局部消毒处理后使用该膜片仅需贴敷一次即可直至创面痊愈，无须反复换药。
实施例3
（1）人羊膜的选材严格遵循供体符合医学标准并建立资料档案；
（2）取供体符合医学标准剖腹产的胎膜，从胎膜上钝性分离羊膜；
（3）用0.9%生理盐水反复漂洗后剪成直径是19×19cm2 并用无菌缝合线进行基底膜面层标记；
（4）用含1000U/ml庆大霉素和2.5μg/ml二性霉素B的0.9%生理盐水浸泡30分钟；
（5）置入一盛有准备好灭菌的含100%甘油的0.9%生理盐水混合液250ml无菌细胞培养瓶中，置于-80℃深低温冰箱中冷冻保存；
（6）将上述方法制得的人羊膜组织膜片，用钴60辐照灭菌处理后，辐照剂量25kGy，获得医用人羊膜组织膜片，置于-80℃深低温冰箱中冷冻保存；即制备出建库所需的人羊膜组织膜片。
在临床试验时，将上述库储存羊膜组织膜片室温解冻。将外科患者坏死性筋膜炎（左侧腹股沟区）手术常规清创，剔除坏死的表皮、异物。彻底清创后该创面达15×8×7 cm3大小， 用消毒无菌纱布浸沾干创面后，开始贴敷膜片，取大于创面外缘1cm的羊膜组织膜片，将已标记的基底膜面层膜片贴敷在创面上，并且使膜片与创面之间紧密贴敷无气泡，如图3所示。膜片外不需要用其他敷料包扎，创面晾干或湿润后活动不受限。保持了创面基底部肉芽新鲜，减少了抗生素的应用。因为本病为严重感染创面，创面渗出液过多时，羊膜组织片会自行脱落或被溶解，则需换药重新贴敷羊膜组织膜片直至羊膜组织膜片与创面紧密贴敷，此时创面不再需要进行患药直至创面痊愈。创面贴敷后，患者行走活动不受限，疼痛明显减轻，临床疼痛评分0-1分，减轻了患者的痛苦和医护人员的劳动强度，治疗疗程短，降低了医疗费用。本发明医用人羊膜组织储备库内地膜片也适合于各种手术后切口、压疮、烫伤、烧伤和糖尿病相关创面等各种急性或慢性创面。
Claims (5)
1.一种医用人羊膜组织储备库的构建方法，其特征是包括下述步骤：
（1）人羊膜的选材严格遵循供体符合医学标准并建立资料档案；
（2）取供体符合医学标准剖腹产或正常分娩的胎膜，在胎膜娩出5～10分钟内，从胎膜上钝性分离羊膜；
（3）用磷酸盐缓冲液或0.9%生理盐水反复漂洗后剪成膜片并用无菌缝合线对基底膜面层进行标记；
（4）用含1000U/ml庆大霉素和2.5μg/ml二性霉素B的磷酸盐缓冲液或0.9%生理盐水浸泡30～40分钟；
（5）置入一盛有含4%～100%甘油的磷酸盐缓冲液或0.9%生理盐水混合液75～250ml无菌细胞培养瓶或塑料袋中，置于-20～-80℃冰箱中冷冻保存；
（6）将上述方法制得的人羊膜片，用钴60 辐照灭菌，辐照剂量为25～35kGy处理后，获得医用人羊膜组织膜片；
（7）将上述医用人羊膜组织膜片置于-20～-80℃深低温冰箱冷冻储存，按膜片面积大小和提供羊膜的新生儿不同性别进行保存，建立可供检索的羊膜组织片信息档案，即构建出医用人羊膜组织储备库。
2.根据权利要求1所述的医用人羊膜组织储备库的构建方法，其特征是所述1000U/ml庆大霉素和2.5μg/ml二性霉素B的0.9%生理盐水或磷酸盐缓冲液浸泡时间为40分钟。
3.根据权利要求1所述的医用人羊膜组织储备库的构建方法，其特征是所述的甘油为10%灭菌甘油。
4.根据权利要求1所述的医用人羊膜组织储备库的构建方法，其特征是所述的灭菌方法，采用钴60辐照，辐照剂量25kGy。
5.根据权利要求1所述的医用人羊膜组织储备库的构建方法，其特征是所述的低温冰箱冷冻的温度为-80℃。
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