CN103071789B - 一种聚乙二醇部分修饰的胶体金及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种聚乙二醇部分修饰的胶体金及其制备方法，包括以下步骤：（1）胶体金的制备；（2）纳米金在玻璃固相载体上的固定；（3）聚乙二醇修饰；（4）聚乙二醇部分修饰胶体金溶液的制备。该方法制备出的胶体金表面有80-95%区域为聚乙二醇所覆盖，而另外5-20%区域则仍然为裸露的金表面。本发明制备的聚乙二醇部分修饰的胶体金在复杂介质中的稳定性和对目标蛋白的选择性识别显著增强；通过对胶体金的非对称修饰，可以实现对反应的定向调控，也能解决传统方法中各向同性胶体金带来的不可控团聚及沉降问题，有望在纳米组装及生物传感方面得到广泛应用。
Description
技术领域
本发明属于分析化学领域，具体涉及一种聚乙二醇部分修饰的胶体金及其制备方法。
背景技术
胶体金是由氯金酸(HAuCl4)在还原剂作用下聚合成的纳米金颗粒，这些纳米金粒子由于静电作用在溶液中分散成为一种稳定的胶体状态，故称胶体金。人类对于胶体金的认识最早可追溯到1857年，英国著名物理学家、化学家迈克尔·法拉第用还原法从氯金酸水溶液中制备出了胶体金，并发现了胶体金溶液在电解质溶液中的变色现象。随着现代纳米科技的发展，胶体金已经广泛应用到物理、化学及生命科学的各个领域，包括纳米材料自组装、生物标记、催化、电化学、相转移、及生物传感等（ Langmuir， 2009, 25(24), 13840–13851； Nano Today， 2011，6, 286-308）。在分析化学领域，以免疫胶体金快速诊断技术为代表的胶体金诊断技术，在临床医学检测、激素检测、食品安全检测、药物残留和毒品快速检测，以及抗原抗体等诸多诊断领域得到迅速发展（《安徽农业科学》，2010, 38(16)：8429-8431）。
目前在分析化学及医学临床检测中最广泛使用的是用柠檬酸钠还原法制备的粒径为10-100纳米的胶体金（ Nat. Phys. Sci. 1973, 241, 20-22; Chem. Rev. , 2012, 112 (8), pp 4469–4506）。然而用柠檬酸钠还原法制备的胶体金在实际应用中有以下几方面的缺点：首先是胶体金的稳定性受缓冲电解质的影响较大。特别是在盐浓度较高的情况下，由于金纳米粒子表面所带的部分电荷被中和，纳米金在溶液中易发生团聚现象，从而有可能产生假阳性或假阴性的检测结果；第二，虽然标记上生物大分子如DNA或蛋白质之后，胶体金在电解质溶液中的稳定性有所增强，但在目标分子检测过程中，胶体金与目标物的结合会导致胶体金大量团聚。随着团聚体的增大，其表面所带的电荷逐渐减少，而质量却不断增加，因此在水溶液中难以再以胶体形式存在，将会随着反应时间的推进以沉淀形式析出，从而不利于对目标物的准确测定（ Small , 2012, DOI: 10.1002/smll.201201061）。第三，传统方法制备的胶体金在生物分子标记时对目标物的选择性不强，容易产生非特异性吸附，从而影响分析结果的准确性。
利用聚乙二醇修饰来提高胶体金的稳定性及反应的特异性已经得到学术界的广泛认可，并在医学临床检测中得到了推广应用（ J Am Chem Soc. 2009, 131(13): 4783-4787； Adv. Drug Deliver. Rev. 2012, 64, 246-255; Nanoscale , 2012, 4, 7135-7142; Biomaterials , 2012, 33(27), 6408–6419）。然而目前报导的方法大多为各向同性地在纳米金表面修饰上聚乙二醇，因此无法实现对目标物的定向反应，也无法解决目标物结合后导致的大量胶体金团聚所产生的胶体金沉降问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种聚乙二醇部分修饰的胶体金及其制备方法。应用该方法制备出的胶体金能同时克服传统胶体金的三大缺陷，从而增强胶体金在环境监测、食品安全控制及医学诊断等领域的实际应用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种聚乙二醇部分修饰的胶体金的制备方法包括以下步骤：
（1）胶体金的制备：采用传统的柠檬酸钠还原法制备柠檬酸钠保护的胶体金溶液；
（2）纳米金在玻璃固相载体上的固定：包括以下三个步骤：
a. 将玻璃固相载体浸入体积比为4：1的浓硫酸与过氧化氢的混合溶液中氧化，然后放入超声仪中超声；所述的浓硫酸的含量大于等于98%；所述的过氧化氢的质量分数为30%；
b. 将处理过的玻璃固相载体浸入含季铵盐阳离子表面活性剂的溶液中，静置过夜；
c. 将上述表面组装有季铵盐阳离子表面活性剂双分子层的玻璃固相载体浸入步骤（1）的柠檬酸钠保护的胶体金溶液中，静置30-60分钟；
（3）聚乙二醇修饰：将步骤（2）中吸附有单层胶体金的玻璃固相载体浸入末端修饰有巯基的聚乙二醇溶液中，静置反应；
（4）聚乙二醇部分修饰胶体金溶液的制备：将步骤（3）中修饰有聚乙二醇的纳米金连同玻璃固相载体一起浸入装有溶剂的容器中，放入超声仪中超声；修饰有聚乙二醇的纳米金将会从玻璃固相载体表面脱落进入溶剂中，从而得到聚乙二醇部分修饰的胶体金溶液。
所述的步骤（2）a中的氧化时间为5-10分钟。
所述的步骤（2）a中的超声频率为20-50 kHz，功率密度为0.1-0.5 W/cm2，超声时间为10-20分钟。
所述的步骤（2）b中所述的季铵盐阳离子表面活性剂的通式为 ，其中R1，R2和R3为甲基或乙基，R为碳原子数为10-18的正烷基，X-为氯或溴离子。
所述步骤（2）b中所述的季铵盐阳离子表面活性剂的浓度为0.02-0.1 M。
所述步骤（3）中所述的末端修饰有巯基的聚乙二醇的分子量在1000-20000之间。
所述步骤（3）中所述的静置反应时间为10-24小时。
所述步骤（4）中的超声频率为20-50 kHz，功率密度为0.1-0.5 W/cm2，超声时间为2-3分钟。
所述步骤（4）中的溶剂是水、缓冲溶液或有机溶剂。
一种如上所述的方法制得的聚乙二醇部分修饰的胶体金表面有80-95%区域为聚乙二醇所覆盖，而另外5-20%区域仍然为裸露的金表面。
本发明的有益效果在于：
（1）胶体金在复杂介质中的稳定性得到了显著增强。相比于目前广泛使用的柠檬酸纳还原法制备的胶体金，本方法制备的聚乙二醇部分修饰的胶体金在复杂介质中（如高盐、高浓度蛋白、核酸等同时存在）的分散性能更好，且分散后的溶液不易沉降，在常温下能够以胶体金形式稳定存在数周；
（2）聚乙二醇具有良好的抗蛋白吸附能力，因此这类聚乙二醇部分修饰的胶体金能够显著提高对目标蛋白的选择性识别；
（3）通过对胶体金的非对称修饰，本方法制备的胶体金表面具有非对称结构，因此可以实现对反应的定向调控。也能解决传统方法中各向同性胶体金带来的不可控团聚及沉降问题。
附图说明
图1是本发明所述聚乙二醇部分修饰的胶体金制备方法的示意图。
图2是应用本发明方法制备的聚乙二醇部分修饰的胶体金在检测水样中汞离子（Hg2+）含量的光谱图。其中黑色实线为不含Hg2+的水样，而黑色虚线为含1μM Hg2+的水样。
具体实施方式
以下结合附图来叙述本发明的具体实施方式：
本发明所述聚乙二醇部分修饰的胶体金制备方法的示意图如图1所示，主要分为以下几个步骤：1）将玻璃固相载体浸入含浓硫酸与30%过氧化氢混合溶液（体积比为4：1）中反应5-10分钟，然后放入超声仪中水浴超声10-20分钟。2）将处理过的玻璃固相载体取出，用二次水冲洗后浸入含0.02-0.1 M的季铵盐阳离子表面活性剂溶液中，静置过夜；3）将表面组装有季铵盐阳离子表面活性剂的玻璃固相载体取出，用二次水冲洗后浸入以柠檬酸钠还原法制备的胶体金溶液中，静置反应30-60分钟。4）将吸附有单层纳米金的玻璃固相载体取出，用二次水冲洗后浸入含有聚乙二醇的溶液中，静置反应10-24小时。5）将上述修饰有聚乙二醇的纳米金连同玻璃固相载体一起取出，用二次水清洗后浸入装有少量溶剂的容器中，放入超声仪中水浴超声2-3分钟。修饰有聚乙二醇的纳米金将会从玻璃固相载体表面脱落进入溶液中，从而得到均匀分散的聚乙二醇部分修饰的胶体金溶液。
实施例1
以下为应用本发明所述方法制备聚乙二醇2-巯基乙醚乙酸（Poly(ethylene glycol) 2-thioethyl ether acetic acid，平均分子量1000）部分修饰的平均粒径为43纳米的胶体金，并应用该胶体金检测环境水体中汞离子（Hg2+）含量的具体实施例：
首先将盖玻片（20 mm×20 mm）浸入10 ml含98%浓硫酸与30%过氧化氢混合溶液（体积比为4：1）的烧杯中反应5分钟，然后将烧杯放入超声仪中水浴超声15分钟；接下来将处理过的盖玻片取出，用二次水冲洗三次后，浸入含0.05 M的十二烷基三甲基溴化铵溶液中，静置过夜；再将表面组装有十二烷基三甲基溴化铵的盖玻片取出，用二次水冲洗三次后，浸入10 ml以柠檬酸钠还原法制备的平均粒径为43纳米的胶体金溶液的烧杯中，静置反应60分钟；然后将吸附有单层纳米金的盖玻片取出，用二次水冲洗三次后浸入2 ml含有聚乙二醇2-巯基乙醚乙酸溶液的表面皿中，静置反应24小时。最后，将上述修饰有聚乙二醇2-巯基乙醚乙酸的纳米金连同盖玻片一起取出，用二次水清洗三次后，浸入装有2 ml二次水的表面皿中，放入超声仪中水浴超声2分钟。修饰有聚乙二醇2-巯基乙醚乙酸的纳米金将会从盖玻片表面脱落进入二次水中，从而得到均匀分散的聚乙二醇2-巯基乙醚乙酸部分修饰的平均粒径为43纳米的胶体金溶液。
将上述聚乙二醇2-巯基乙醚乙酸部分修饰的平均粒径为43纳米的胶体金溶液分成两等份，其中一份加入3nmol DNA探针A（DNA序列：SH-GCGTTTGTCCTTTGTGTTGTGCTT），而另一份溶液中加入3nmol DNA探针B（DNA序列：SH-CGCATTCAGGATTCTCAACTCGTA）,常温避光反应24小时后，分别于10000rpm离心5分钟，将上清液弃去后，再分别向离心管中加入1mL浓度为0.6 M磷酸缓冲液（pH 7.4,含7.5 mM氯化镁）将沉淀于离心管底部的胶体金重新分散，得到分别标记有DNA探针A和DNA探针B的胶体金溶液。
在样品检测前，分别取5μL标记有DNA探针A和5μL标记有DNA探针B的溶液，混合，加入10μL待测样品溶液，避光反应30分钟后测定溶液的紫外－可见光谱图。如图2所示，样品空白的溶液的紫外光谱图只有一个吸收峰位于539nm处，而含有1μM Hg2+的样品溶液除了在539纳米处有个吸收峰外，在600nm处出现了一个肩峰，溶液颜色也由粉红色变为绛紫色，说明应用该方法可以准确辨别环境水样是否被Hg2+污染。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
Claims (1)
1.一种聚乙二醇部分修饰的胶体金的制备方法，其特征在于：胶体金表面有80-95%区域为聚乙二醇所覆盖，而另外5-20%区域仍然为裸露的金表面；
制备方法包括以下步骤：
（1）胶体金的制备：采用传统的柠檬酸钠还原法制备柠檬酸钠保护的胶体金溶液；
（2）纳米金在玻璃固相载体上的固定：包括以下三个步骤：
a. 将玻璃固相载体浸入体积比为4：1的浓硫酸与过氧化氢的混合溶液中氧化，然后放入超声仪中超声；所述的浓硫酸的质量分数大于等于98%；所述的过氧化氢的质量分数为30%；
b. 将处理过的玻璃固相载体浸入含季铵盐阳离子表面活性剂的溶液中，静置过夜；
c. 将上述表面组装有季铵盐阳离子表面活性剂双分子层的玻璃固相载体浸入步骤（1）的柠檬酸钠保护的胶体金溶液中，静置30-60分钟；
（3）聚乙二醇修饰：将步骤（2）中吸附有单层胶体金的玻璃固相载体浸入末端修饰有巯基的聚乙二醇溶液中，静置反应；
（4）聚乙二醇部分修饰胶体金溶液的制备：将步骤（3）中修饰有聚乙二醇的纳米金连同玻璃固相载体一起浸入装有溶剂的容器中，放入超声仪中超声；修饰有聚乙二醇的纳米金将会从玻璃固相载体表面脱落进入溶剂中，从而得到聚乙二醇部分修饰的胶体金溶液；
所述的步骤（2）a中的氧化时间为5-10分钟；
所述的步骤（2）a中的超声频率为20-50 kHz，功率密度为0.1-0.5 W/cm2，超声时间为10-20分钟；
所述的步骤（2）b中所述的季铵盐阳离子表面活性剂的通式为 ，其中R1，R2和R3为甲基或乙基，R为碳原子数为10-18的正烷基，X-为氯或溴离子；
所述步骤（2）b中所述的季铵盐阳离子表面活性剂的浓度为0.02-0.1 M；
所述步骤（3）中所述的末端修饰有巯基的聚乙二醇的分子量在1000-20000之间；
所述步骤（3）中所述的静置反应时间为10-24小时；
所述步骤（4）中的超声频率为20-50 kHz，功率密度为0.1-0.5 W/cm2，超声时间为2-3分钟；
所述步骤（4）中的溶剂是水或有机溶剂。
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