CN103063487B - 一种制备酶与底物复合物晶体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种制备酶与底物复合物晶体的方法。具体步骤为：1）将酶蛋白晶体放入防冻液中，置于-20℃中，5-10分钟；2）迅速取出酶蛋白晶体，加入与防冻液等体积的底物；3）将酶蛋白晶体与底物复合物再次置于-20℃中，5-10分钟；4）取出后迅速放入液氮中固定。本发明可以获得真实的酶-底物复合物结构；可进一步提高底物的占有率和空间稳定性，以提高底物电子密度的质量。在提高生物大分子及复合物晶体的空间有序性基础上，可获得更高分辨率的衍射数据。
Description
技术领域
本发明涉及一种制备酶与底物复合物晶体的方法。
背景技术
准确地把握生物大分子及其复合物的结构是了解生命过程的基础，对其三维结构的解析，可给出大量的其本身及所属体系的信息。
利用生物大分子X射线衍射系统测定生物大分子及其复合物晶体结构的方法，是目前结构生物学研究领域的主要手段。该工作可大致分成以下四个环节：高纯度大分子样品的制备；晶体的获得；结构的解析；结构信息指导下的生物学研究。在目前的技术条件下，样品晶体的质量是影响其结构解析的主要原因。
影响生物大分子晶体及其复合物质量的主要原因是分子的化学稳定性及构象一致性较差而得不到稳定的复合物晶体。例如，在通常条件下，当酶与底物发生反应时，底物会被酶降解，所以不易清楚地看到底物和酶的结合情况。突变酶中关键基团使酶失活以及选用底物类似物替代原有底物的的方法，经常被用来捕捉酶和底物的结合，但由此方法获得的结构多为近似结构。另外，在常温下，酶与底物的结合一般不很稳定，这样底物即便在失活酶中的位置也经常不易确定。另外，一些低温技术也被用于提高衍射数据的质量，例如：由常温迅速降温到-180℃的“闪淬”技术；将已冻晶体回浸到晶体母液中再次冷冻的方法。
突变酶中关键基团以及选用底物类似物的方法，缺陷在于获得的结构为近似结构，而低温技术只是用来提高衍射分辨率，没有涉及到抑制酶活。因此，对晶体处理方法的改进对于提高解析结构的质量有着非常重要的意义。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明目的是提供一种制备酶与底物复合物晶体的方法，用于分析复合物晶体的结构。
我们发现在低温-20℃条件下，分子构象的一致性、分子间结合的稳定性都会大大改善，一般酶的生物活性也会大幅度降低。由此获得的酶-底物复合物更为稳定，得到的晶体结构衍射数据更趋于复合物结合时的实际结构。基于上述考虑，提出了“酶晶体低温抑活底物固定”方法。
本发明所述方法是将酶与底物置于-20℃低温结合，包括以下步骤：
1）将酶蛋白晶体放入防冻液中，置于-20℃中，5-10分钟；
2）迅速取出酶蛋白晶体，加入与防冻液等体积的底物；
3）将酶蛋白晶体与底物复合物再次置于-20℃中，5-10分钟；
4）取出后迅速放入液氮中固定。
其中，所述酶蛋白晶体为6-磷酸-β-葡萄糖苷酶；所述底物为对硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷-6-磷酸。
所述对硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷-6-磷酸的浓度为20mM。
所述防冻液为50%甘油和池液，体积比为1:2。所述池液为0.1M4-羟乙基哌嗪乙磺酸钠（HEPES sodium）pH 7.5、10%异丙醇和20%聚乙二醇4000（Polyethylene glycol 4000）。
在本发明的优选的实施例中，所述方法包括以下步骤：
1）准备低温晶体板；
2）制备防冻液；
3）将蛋白晶体6-磷酸-β-葡萄糖苷酶放入防冻液中，置于晶体板上，置于-20℃，10分钟；
4）取出蛋白晶体板，加入3μl 20mM对硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷-6-磷酸；
5）将晶体板放回-20℃中，10分钟。
6）取出晶体板，将蛋白晶体与底物复合物放入液氮固定。
采用以下方法准备低温晶体板：用水将含有甘油的纸条润湿，再将坐滴孔内加满水，盖上玻璃盖。
所述防冻液为1μl 50%(v/v)甘油和2μl池液；其中，所述池液为0.1M 4-羟乙基哌嗪乙磺酸钠，pH 7.5、10%(v/v)异丙醇和20%聚乙二醇4000(w/v)。
本发明进一步通过X光衍射仪收集复合物晶体数据。
本方法原理是利用低温条件使酶活性降低，使底物与酶的结合更稳定，在此条件下无需改变酶与底物而得到复合物晶体，再利用液氮固定晶体，最终获得酶-底物复合物的实际结构。具体地，在-20℃环境温度下浸泡底物，此时酶基本失去活性、底物不易降解而底物和酶结合的稳定性却大大提高，平衡后将晶体迅速沉入液氮便可得到理想的酶-底物复合物。
本发明的有益效果为：
（1）本方法将酶晶体和底物置于使酶失活的低温条件下，进行底物浸泡，首先，可以获得真实的酶-底物复合物结构；其次，可进一步提高底物的占有率和空间稳定性，以提高底物电子密度的质量。另外，在提高生物大分子及复合物晶体的空间有序性基础上，可获得更高分辨率的衍射数据。
（2）本方法是对生物大分子X射线晶体衍射系统样品处理方法的技术开发和改进。通过此技术，可以获得复合物结合状态的真实结构并提高衍射数据的质量，进一步提高X射线生物大分子晶体学研究的水平，以及X射线晶体衍射系统的检测水平，扩大其应用范围。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
1、准备低温晶体板，用水将含有甘油的纸条润湿，再将坐滴孔内加满水，盖上玻璃盖，保持环境的湿度。
2、制备防冻液：1μl 50%(v/v)甘油，2μl池液(0.1M 4-羟乙基哌嗪乙磺酸钠，pH 7.5、10%(v/v)异丙醇和20%聚乙二醇4000(w/v))
3、用尼龙环挑出6-磷酸-β-葡萄糖苷酶蛋白晶体，放入防冻液中，迅速置于-20℃低温冰箱中，等待10分钟。
4、迅速取出蛋白晶体板，快速加入3μl 20mM底物对硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷-6-磷酸。
5、再次将晶体板放回-20℃低温冰箱中，等待10分钟。
6、再次迅速取出晶体板，用尼龙环挑出蛋白晶体与底物复合物，放入液氮固定。
对照组：制备方法同实施例1，不同之处在于步骤3和4中置于4℃层析室。
由结果可知，对于本发明的技术方案，在低温下酶失活，通过X光衍射仪收集复合物晶体数据，分辨率对于酶的反应底物：对硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷-6-磷酸，在复合物晶体结构中有较完整的电子密度。而对照组为常规方法浸泡，底物大都被降解，苯环部分密度很低。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (2)
1.一种制备酶与底物复合物晶体的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将酶蛋白晶体放入防冻液中，置于-20℃中，5-10分钟；
2)迅速取出酶蛋白晶体，加入与防冻液等体积的底物；
3)将酶蛋白晶体与底物复合物再次置于-20℃中，5-10分钟；
4)取出后迅速放入液氮中固定；
其中，所述酶蛋白晶体为6-磷酸-β-葡萄糖苷酶；所述底物为对硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷-6-磷酸，且底物的浓度为20mM；
所述防冻液为50％甘油和池液，体积比为1:2；所述池液为0.1M4-羟乙基哌嗪乙磺酸钠pH7.5、10％异丙醇和20％聚乙二醇4000。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，进一步通过X光衍射仪收集复合物晶体数据。
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