CN103060927A - 一种基于超疏水界面的水溶性蛋白的磁性可控书写方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于蛋白质书写技术领域，特别涉及一种通过以超疏水界面为书写基底实现对水溶性蛋白磁性可控书写的方法。包括制备超疏水基底、在该基底上制备水溶性蛋白质包裹的磁性水凝胶球、在超疏水基底的另一侧施加磁场并移动磁场等步骤，从而实现基于超疏水界面的水溶性蛋白的磁性可控书写。基底的疏水程度可通过控制基底表面的粗糙程度和化学组成来调控，进而实现对蛋白质液滴与基底接触面积的大小、蛋白质微球运动轨迹宽度、蛋白质点直径等因素的控制，达到可控书写的目的。
Description
技术领域
本发明属于蛋白质书写技术领域，特别涉及一种通过以超疏水界面为书写基底实现对水溶性蛋白磁性可控书写的方法。
背景技术
蛋白质是生命的物质基础，它是与生命及各种形式的生命活动紧密联系在一起的物质。因而对于蛋白质的控制技术的研究，近年来逐步受到人们的广泛关注，例如在生物芯片技术方面的应用等。蛋白质芯片作为生物芯片技术中的较为普遍的一种，其核心技术就是对于蛋白质的可控书写。在传统的蛋白质芯片制备技术中，特别是在构建微阵列的操作中，主要是对固相载体进行物理化学处理，再将已知的蛋白分子产物固定其上，根据该生物分子的特性，捕获能与之特异性结合的特定蛋白质。其中主要包括接触式点样和非接触式点样两种手段，此两种方法在实际应用具有操作复杂，技术成本高，准确性不好等缺点。由于蛋白质的多样性和功能的复杂性，那么，如何将其固定在载体上而不破坏其生物活性以及其天然构象问题，就成为了研究的主要内容。
发明内容
本发明的目的是通过磁场对超疏水基底表面上具有磁性水凝胶球核的水溶性蛋白质液滴的运动进行控制，实现在该超疏水基底表面上的磁性、水溶性蛋白质的可控书写，这种方法结合了基底的超疏水性质以及基底对蛋白质的粘附性等特点，通过磁场实现了对蛋白质的可控书写，即通过在超疏水表面施加磁场，实现对在其表面上蛋白质液滴进行近程控制，利用基底与水凝胶球之间的压力，把蛋白质压印在超疏水基底上以完成书写，包括书写点，线，点阵等结构。这种书写方法操作过程简单，超疏水基底的制作相对简易且成本低，大大增加了实验的可操作性。蛋白质图形的尺寸可以通过控制蛋白质液滴与基底接触面积的大小来实现，具体途径主要有以下两个方面：（1）通过控制基底表面的粗糙程度和化学组成来调控基底的疏水程度以实现对蛋白质液滴与基底接触面积的控制；（2）通过向磁性水凝胶球中滴加不同体积的蛋白质液滴来实现与基底接触面积的控制，达到可控书写的目的。这种将基底表面浸润性与蛋白质可控书写相结合的方法，是一种全新的蛋白质书写方法，包括蛋白质图像成型，蛋白质点阵制备等，可广泛应用于生物芯片制作及蛋白质分离提纯等技术领域。
本发明所采用的超疏水基底可以是高分子，如聚苯乙烯（PS）；金属铝、铜等；半导体硅、氧化锌等多种材质，通过其对其表面进行化学修饰和调控微观结构来控制基底的超疏水性。基底材料选材广泛，制备方法多样。
本发明以选用壳聚糖、藻酸盐等天然高分子材料包裹磁性粒子制备水凝胶为例，将蛋白质附于水凝胶球周围以获得磁性蛋白质球。
本发明所使用的超疏水基底可选用聚合物聚苯乙烯（PS）采用相分离方法，或者金属铝、铜等采用刻蚀的方法，亦或半导体ZnO采用低温液相法均可实现超疏水界面。进行书写操作的材料包含全部水溶性蛋白质。
一种基于超疏水界面的水溶性蛋白的磁性可控书写方法，其步骤如下：
1)①将聚苯乙烯（PS）溶于有机非极性溶剂四氢呋喃中，将此溶液与乙醇以体积比2：1.3的比例共混，等沉淀全溶后将所得溶液滴加到聚苯乙烯（PS）基底表面，待在表面析出聚苯乙烯膜后，迅速倒掉基底表面残留的溶液，将基底置于乙醇溶液中1～2分钟后取出，室温下干燥，进而获得聚苯乙烯（PS）超疏水基底。
②将40mL、质量分数37％的盐酸，12.5mL的水，2.5mL的氢氟酸混合，将该溶液滴在铝片上，15～20秒后用清水清洗并超声水浴4～5分钟，然后放入80℃的空箱中干燥，最后放入1％质量浓度的氟硅烷中浸泡24小时后取出，从而获得超疏水铝片基底。
③将20mL摩尔浓度为0.1mol/L的硝酸锌、六次甲基四胺溶液、700uL氢氟酸溶液（1mol/L）混和，充分搅拌后，将清洗干净的Si片放到装有该混和溶液的密闭容器中，在95℃恒温箱中保温2小时，从而在Si上得到ZnO微纳米结构；最后，将覆盖ZnO微纳米结构的Si片取出，用二次去离子水彻底清洗，用高纯氮气吹干，将覆盖有ZnO微纳米结构的Si片和盛有20uL的十七氟四氢三甲氧基硅烷（FAS）的小烧杯（标称5mL）同时放在一个大的聚四氟乙烯烧杯中，并将大烧杯密闭，放在150℃的恒温箱中保温180min后取出，以获得超疏水的ZnO微纳米结构基底。
2)将1mL浓度为10mg/mL的壳聚糖溶液或者藻酸盐溶液和5mg四氧化三铁在0.1～0.5mg交联剂京尼平（Genipin）作用下混合，取该混合溶液2～20uL，滴加至步骤1）制备的超疏水基底上，然后置于室温饱和湿度的环境下，放置12～20小时，取出，冷冻干燥后即可得到包裹四氧化三铁的磁性水凝胶球；将水溶性蛋白质（如血清白蛋白、卵清蛋白等）滴加至磁性水凝胶球上，从而获得水溶性蛋白质包裹的磁性水凝胶球；
3)在步骤2）的超疏水基底的另一侧施加磁场并移动磁场，即可实现基于超疏水界面的水溶性蛋白的磁性可控书写。
或在步骤2）超疏水基底水溶性蛋白质包裹的磁性水凝胶球的上方3～5cm处放置另一超疏水基底，在该超疏水基底背离水溶性蛋白质包裹的磁性水凝胶球的一侧施加磁场，当水溶性蛋白质包裹的磁性水凝胶球被吸引至上方基底后撤销该磁场，即可实现在后放置的超疏水基底上水溶性蛋白的磁性可控书写（打点操作）。
本发明所述方法可用于对蛋白质的多种形式的书写，包括书写不同宽度的图形、不同直径的打点、点阵等。
上述方法所使用的聚苯乙烯，分子量可以为10万～50万；其四氢呋喃溶液的浓度可以为50～70mg/mL；
附图说明
图1：混合溶液交联前后得到包裹磁性颗粒的水凝胶球过程示意图；1表示磁性颗粒；2表示超疏水基底；3表示水凝胶球；
图2：水溶性蛋白磁性可控书写的直线书写操控示意图；1表示磁性颗粒；2表示超疏水基底；3表示水凝胶球；4表示水溶性蛋白质；5表示磁铁。对应实施例1、2、3、4。
图3：水溶性蛋白磁性可控书写的在任一点打点操控示意图；1表示磁性颗粒；2表示超疏水基底；3表示水凝胶球；4表示水溶性蛋白质；5表示磁铁。对应实施例6、7、8。
图4：水溶性蛋白磁性可控书写的绘制图案操控示意图；1表示磁性颗粒；2表示超疏水基底；3表示水凝胶球；4表示水溶性蛋白质；5表示磁铁。对应实施例9。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的阐述，而不是要以此对本发明进行限制。
实施例1
将2.5g聚苯乙烯（PS）溶于50mL四氢呋喃中，取20mL上述溶液与13mL乙醇混合，震荡使沉淀消失，取所得溶液滴于聚苯乙烯薄片上，待在表面析出聚苯乙烯膜后，迅速倒掉表面溶液并放于乙醇溶液中，放置1分钟取出置于空气中干燥，从而获得超疏水聚苯乙烯基底。
将0.1g壳聚糖溶于10mL乙酸溶液中，取1mL所得溶液，将0.1mg京尼平（Genipin）和5mg四氧化三铁溶于上述溶液中，放置5小时后将2微升混合溶液滴于超疏水聚苯乙烯基底上，置于室温饱和湿度的空箱中，放置12小时取出并冷冻干燥得到包覆四氧化三铁磁性颗粒的壳聚糖小球。将2微升的荧光标记牛血清白蛋白滴于壳聚糖小球上，形成蛋白液滴；然后在基底的另一侧放置磁铁施加磁场控制蛋白液滴以直线移动，实现对蛋白质在超疏水表面上以300μm的线宽书写直线的控制。
实施例2
将2.5g聚苯乙烯（PS）溶于50mL四氢呋喃中，取20mL上述溶液与13mL乙醇混合，震荡使沉淀消失，取所得溶液滴于聚苯乙烯薄片上，待在表面析出聚苯乙烯膜后，迅速倒掉表面溶液并放于乙醇溶液中，放置1分钟取出置于空气中干燥，从而获得超疏水聚苯乙烯基底。
将0.1g壳聚糖溶于10mL乙酸溶液中，取1mL所得溶液，将0.1mg京尼平（Genipin）和5mg四氧化三铁溶于上述溶液中，放置5小时后将2微升混合溶液滴于超疏水聚苯乙烯基底上，置于室温饱和湿度的空箱中，放置12小时取出并冷冻干燥得到包覆四氧化三铁磁性颗粒的壳聚糖小球。将4微升的荧光标记牛血清白蛋白滴于壳聚糖小球上，形成蛋白液滴；然后在基底的另一侧放置磁铁施加磁场控制蛋白液滴以直线移动，实现对蛋白质在超疏水表面上以800μm的线宽书写直线的控制。
实施例3
将2.5g聚苯乙烯（PS）溶于50mL四氢呋喃中，取20mL上述溶液与13mL乙醇混合，震荡使沉淀消失，取所得溶液滴于聚苯乙烯薄片上，待在表面析出聚苯乙烯膜后，迅速倒掉表面溶液并放于乙醇溶液中，放置1分钟取出置于空气中干燥，从而获得超疏水聚苯乙烯基底。将此基底在紫外光下辐照1分钟，改变其表面的疏水程度，使该表面液滴接触角由158°变为148°。
将0.1g壳聚糖溶于10mL乙酸溶液中，取1mL所得溶液，将0.1mg京尼平（Genipin）和5mg四氧化三铁溶于上述溶液中，放置5小时后将2微升混合溶液滴于超疏水聚苯乙烯基底上，置于室温饱和湿度的空箱中，放置12小时取出并冷冻干燥得到包覆四氧化三铁磁性颗粒的壳聚糖小球。将2微升的荧光标记牛血清白蛋白滴于壳聚糖小球上，形成蛋白液滴；然后在基底的另一侧放置磁铁施加磁场控制蛋白液滴以直线移动，实现对蛋白质在超疏水表面上的直线书写。在紫外辐照前后的基底上对比直线线宽由300μm变为500μm。
实施例4
将3g聚苯乙烯（PS）溶于50mL四氢呋喃中，取20mL上述溶液与13mL乙醇混合，震荡使沉淀消失，取所得溶液滴于聚苯乙烯薄片上，待在表面析出聚苯乙烯膜后，迅速倒掉表面溶液并放于乙醇溶液中，放置1分钟取出置于空气中干燥，从而获得超疏水聚苯乙烯基底。
将0.1g藻酸盐溶于10mL水中，取1mL所得溶液，将0.1mg京尼平（Genipin）和5mg四氧化三铁溶于上述溶液中，放置5小时后将2微升混合溶液滴于超疏水聚苯乙烯基底上，置于室温饱和湿度的空箱中，放置12小时取出并冷冻干燥得到藻酸盐磁性小球。将6微升的荧光标记牛血清白蛋白滴于小球上，在基底另一侧施加磁场使蛋白质液滴在超疏水基底上以直线移动，实现蛋白质在超疏水基底上以1000μm为线宽的直线书写。
实施例5
将2.5g聚苯乙烯（PS）溶于50mL四氢呋喃中，取20mL上述溶液与13mL乙醇混合，震荡使沉淀消失，取所得溶液滴于聚苯乙烯薄片上，待在表面析出聚苯乙烯膜后，迅速倒掉表面溶液并放于乙醇溶液中，放置1分钟取出置于空气中干燥，从而获得超疏水聚苯乙烯基底。
将0.1g壳聚糖溶于10mL乙酸溶液中，取1mL所得溶液，将0.1mg京尼平（Genipin）和5mg四氧化三铁溶于上述溶液中，放置5小时后分别将3滴2微升混合溶液滴于超疏水聚苯乙烯基底上，置于室温饱和湿度的空箱中，放置12小时取出并冷冻干燥得到壳聚糖小球。分别将2微升、4微升、6微升的荧光标记牛血清白蛋白滴于小球上，同时对多个蛋白质液滴施加磁场并以直线平行或交叉移动，实现蛋白质分别以300μm、800μm、1000μm为线宽的线性阵列的可控书写。
实施例6
将2.5g聚苯乙烯（PS）溶于50mL四氢呋喃中，取20mL上述溶液与13mL乙醇混合，震荡使沉淀消失，取所得溶液滴于聚苯乙烯薄片上，待在表面析出聚苯乙烯膜后，迅速倒掉表面溶液并放于乙醇溶液中，放置1分钟取出置于空气中干燥，从而获得超疏水聚苯乙烯基底。
将0.1g壳聚糖溶于10mL乙酸溶液中，取1mL所得溶液，将0.1mg京尼平（Genipin）和5mg四氧化三铁溶于上述溶液中，放置5小时后将2微升混合溶液滴于超疏水聚苯乙烯基底上，置于室温饱和湿度的空箱中，放置12小时取出并冷冻干燥得到壳聚糖小球。将2微升的荧光标记牛血清白蛋白滴于小球上，在上述超疏水基底水溶性蛋白质包裹的磁性水凝胶球上方3cm处放置另一超疏水基底，在该超疏水基底背离水溶性蛋白质包裹的磁性水凝胶球的一侧施加磁场，当该磁性蛋白质球被吸引至上方基底后撤销该磁场，即可实现在后放置的超疏水基底上以300μm为直径打点的操作。
实施例7
将3g聚苯乙烯（PS）溶于50mL四氢呋喃中，取20mL上述溶液与13mL乙醇混合，震荡使沉淀消失，取所得溶液滴于聚苯乙烯薄片上，待在表面析出聚苯乙烯膜后，迅速倒掉表面溶液并放于乙醇溶液中，放置1分钟取出置于空气中干燥，从而获得超疏水聚苯乙烯基底。将此基底在紫外光下辐照1分钟，改变其表面的疏水程度，使该表面液滴接触角由158°变为148°。
将0.1g壳聚糖溶于10mL乙酸溶液中，取1mL所得溶液，将0.1mg京尼平（Genipin）和5mg四氧化三铁溶于上述溶液中，放置5小时后将2微升混合溶液滴于超疏水聚苯乙烯基底上，置于室温饱和湿度的空箱中，放置12小时取出并冷冻干燥得到壳聚糖小球。将2微升的荧光标记牛血清白蛋白滴于小球上，在上述超疏水基底水溶性蛋白质包裹的磁性水凝胶球上方3cm处放置另一超疏水基底，在该超疏水基底背离水溶性蛋白质包裹的磁性水凝胶球的一侧施加磁场，当该磁性蛋白质球被吸引至上方基底后撤销该磁场，即可实现在后放置的超疏水基底上打点的操作，紫外辐照前后点直径由300μm变为500μm。
实施例8
将40mL、质量分数37％的盐酸，12.5mL的水，2.5mL的氢氟酸混合，将该溶液滴在铝片上，15秒后用清水清洗并超声水浴5分钟，然后放入80℃的空箱中干燥，最后放入1％质量浓度的氟硅烷中浸泡24小时后取出，从而获得超疏水铝片基底。
将0.1g壳聚糖溶于10mL乙酸溶液中，取1mL所得溶液，将0.5mg京尼平（Genipin）和5mg四氧化三铁溶于上述溶液中，放置5小时后将2微升混合溶液滴于超疏水聚苯乙烯基底上，置于室温饱和湿度的空箱中，放置12小时取出并冷冻干燥得到壳聚糖小球。将4微升的荧光标记牛血清白蛋白滴于小球上，在上述超疏水基底水溶性蛋白质包裹的磁性水凝胶球上方3cm处放置另一超疏水基底，在该超疏水基底背离水溶性蛋白质包裹的磁性水凝胶球的一侧施加磁场，当该磁性蛋白质球被吸引至上方基底后撤销该磁场，即可实现在后放置的超疏水基底上以800μm为直径打点的操作。
实施例9
将3g聚苯乙烯（PS）溶于50mL四氢呋喃中，取20mL上述溶液与13mL乙醇混合，震荡使沉淀消失，取所得溶液滴于聚苯乙烯薄片上，待在表面析出聚苯乙烯膜后，迅速倒掉表面溶液并放于乙醇溶液中，放置1分钟取出置于空气中干燥，从而获得超疏水聚苯乙烯基底。
将0.1g壳聚糖溶于10mL乙酸溶液中，取1mL所得溶液，将0.1mg京尼平（Genipin）和5mg四氧化三铁溶于上述溶液中，放置5小时后将2微升混合溶液滴于超疏水聚苯乙烯基底上，置于室温饱和湿度的空箱中，放置12小时取出并冷冻干燥得到壳聚糖磁性小球。将2微升的荧光标记的鸡卵清蛋白（可以从商业渠道获得）滴于水凝胶球上，在基底另一侧对磁性蛋白液滴施加磁场使其以边长为2cm的矩形路线移动，实现对该水溶性磁性蛋白质球以300μm为线宽书写图案的操作。
Claims (7)
1.一种基于超疏水界面的水溶性蛋白的磁性可控书写方法，其步骤如下：
1)制备超疏水基底；
2)将1mL浓度为10mg/mL的壳聚糖溶液或者藻酸盐溶液和5mg四氧化三铁在0.1～0.5mg交联剂京尼平作用下混合；然后取该混合溶液2～20uL，滴加至步骤1）制备的超疏水基底上，置于室温饱和湿度的环境下，放置12～20小时，取出，冷冻干燥后即可得到包裹四氧化三铁的磁性水凝胶球；将水溶性蛋白质滴加至磁性水凝胶球上，从而获得水溶性蛋白质包裹的磁性水凝胶球；
3)在步骤2）的超疏水基底的另一侧施加磁场并移动磁场，即可实现基于超疏水界面的水溶性蛋白的磁性可控书写。
2.一种基于超疏水界面的水溶性蛋白的磁性可控书写方法，其步骤如下：
1)制备超疏水基底；
2)将1mL浓度为10mg/mL的壳聚糖溶液或者藻酸盐溶液和5mg四氧化三铁在0.1～0.5mg交联剂京尼平作用下混合；然后取该混合溶液2～20uL，滴加至步骤1）制备的超疏水基底上，置于室温饱和湿度的环境下，放置12～20小时，取出，冷冻干燥后即可得到包裹四氧化三铁的磁性水凝胶球；将水溶性蛋白质滴加至磁性水凝胶球上，从而获得水溶性蛋白质包裹的磁性水凝胶球；
3)在步骤2）超疏水基底水溶性蛋白质包裹的磁性水凝胶球的上方3～5cm处放置另一超疏水基底，在该超疏水基底背离水溶性蛋白质包裹的磁性水凝胶球的一侧施加磁场，当水溶性蛋白质包裹的磁性水凝胶球被吸引至上方基底后撤销该磁场，即可实现在后放置的超疏水基底上水溶性蛋白的磁性打点操作。
3.如权利要求1或2所述的一种基于超疏水界面的水溶性蛋白的磁性可控书写方法，其特征在于：超疏水基底为采用相分离方法制备的聚苯乙烯超疏水基底、采用刻蚀方法制备的铝片或铜片超疏水基底，或是采用低温液相法制备的具有微纳米结构的ZnO超疏水基底。
4.如权利要求3所述的一种基于超疏水界面的水溶性蛋白的磁性可控书写方法，其特征在于：聚苯乙烯超疏水基底的制备是将聚苯乙烯溶于有机非极性溶剂四氢呋喃中，将此溶液与乙醇以体积比2：1.3的比例共混，等沉淀全溶后将所得溶液滴加到聚苯乙烯基底表面，待在表面析出聚苯乙烯膜后，迅速倒掉基底表面残留的溶液，将基底置于乙醇溶液中1～2分钟后取出，室温下干燥，进而获得聚苯乙烯超疏水基底。
5.如权利要求3所述的一种基于超疏水界面的水溶性蛋白的磁性可控书写方法，其特征在于：铝片超疏水基底是将40mL、质量分数37％的盐酸，12.5mL的水，2.5mL的氢氟酸混合，将该溶液滴在铝片上，15～20秒后用清水清洗并超声水浴4～5分钟，然后放入80℃的空箱中干燥，最后放入1％质量浓度的氟硅烷中浸泡24小时后取出，从而获得超疏水铝片基底。
6.如权利要求3所述的一种基于超疏水界面的水溶性蛋白的磁性可控书写方法，其特征在于：微纳米结构的ZnO超疏水基底是将20mL摩尔浓度为0.1mol/L的硝酸锌、六次甲基四胺溶液、700uL且1mol/L氢氟酸溶液混和，充分搅拌后，将清洗干净的Si片放到装有该混和溶液的密闭容器中，在95℃恒温箱中保温2小时，从而在Si上得到ZnO微纳米结构；最后，将覆盖ZnO微纳米结构的Si片取出，用二次去离子水彻底清洗，用高纯氮气吹干，将覆盖有ZnO微纳米结构的Si片和盛有20uL的十七氟四氢三甲氧基硅烷的小烧杯同时放在一个大的聚四氟乙烯烧杯中，并将大烧杯密闭，放在150℃的恒温箱中保温180min后取出，以获得超疏水的ZnO微纳米结构基底。
7.如权利要求4所述的一种基于超疏水界面的水溶性蛋白的磁性可控书写方法，其特征在于：聚苯乙烯的分子量为10万～50万；其四氢呋喃溶液的浓度为50～70mg/mL。
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