CN103060192B - 一种仿生胶原膜包被的培养器皿及制备方法 - Google Patents

一种仿生胶原膜包被的培养器皿及制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN103060192B
CN103060192B CN201210537068.4A CN201210537068A CN103060192B CN 103060192 B CN103060192 B CN 103060192B CN 201210537068 A CN201210537068 A CN 201210537068A CN 103060192 B CN103060192 B CN 103060192B
Authority
CN
China
Prior art keywords
collagen
culture vessel
preparation
vessel
degrees celsius
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201210537068.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN103060192A (zh
Inventor
王迎军
翟志臣
姚咏嫦
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
South China University of Technology SCUT
Original Assignee
South China University of Technology SCUT
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by South China University of Technology SCUT filed Critical South China University of Technology SCUT
Priority to CN201210537068.4A priority Critical patent/CN103060192B/zh
Publication of CN103060192A publication Critical patent/CN103060192A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN103060192B publication Critical patent/CN103060192B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Landscapes

  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

本发明公开了一种仿生胶原膜包被的培养器皿及制备方法，包括如下步骤：（1）将胶原醋酸溶液与盐缓冲液混合，调整混合液的pH至中性；（2）将步骤（1）的混合液装入培养器皿，于40摄氏度以下保温待胶原重组完成；（3）将步骤（2）得到的含重组胶原的器皿于60摄氏度以下烘干；（4）用超纯水洗步骤（3）得到的胶原层，于60摄氏度以下干燥；（5）重复步骤（4）两次以上直至洗去所有的盐结晶，即得仿生胶原膜包被的培养器皿。通过简单的胶原自组装得到的产品，具有如下优点：胶原与培养器皿贴合紧密，平整度好，抗降解性能好，具有纳米纤维结构，且具有胶原体内独有的67nm周期性螺纹结构。

Description

一种仿生胶原膜包被的培养器皿及制备方法
技术领域
本发明属于生物材料领域，尤其涉及一种细胞或组织培养材料。
背景技术
将细胞培养于细胞外基质上有助于在体外维持细胞的分化表型，并可以使用无血清的培养基培养细胞。目前常用于细胞培养的细胞外基质材料有各类型的胶原、纤维粘连蛋白、层粘连蛋白等。胶原作为人与动物体内含量最大的细胞外基质成份，其优异的生物相容性与生物活性早就为人们所熟知。
在体内，前胶原分子合成后，被酶切去两端的端肽，形成长约300nm，直径1.5nm的胶原蛋白分子，然后多个胶原分子自组装形成具有67nm典型D-band结构的纳米胶原纤维。67nm D-band的产生是由于胶原分子在首尾相交联自组装时所产生的overlap和gap所致。Overlap段长约30nm，gap段长约37nm。螺纹结构的深度在3nm至5nm间。如图1所示。在合适的pH、温度、离子浓度的环境中，在静电等作用下，酸法提取得到的胶原分子可以在体外重新自组装，形成与体内类似的具有周期性螺纹结构的胶原纤维。
美国Advanced BioMatrix公司有包被胶原纤维的玻璃板出售，但这种玻璃板使用不够方便。限制了其的应用。虽然各国相关的多家公司（美国BD公司等）都有在商业化的培养器皿表面进行胶原包被，且有产品面市，但这种胶原包被的孔板仅仅利用孔板自身吸附胶原分子进行涂覆，并不具备胶原在体内所特有的纤维结构及典型的D-band周期性螺纹结构。而细胞可以响应基质表面的几何形貌，且尺寸可以小至纳米级。因此，制备有纳米结构的胶原涂层培养器皿对于特殊细胞的培养及胶原体内天然纤维结构生物功能的研究有重要意义。
美国国家标准与技术研究院在非TC处理的细胞培养孔板（聚苯乙烯）表面制备胶原纤维涂层，但大部分的胶原都被洗去，因此包被孔板时使用的胶原浓度要求高，胶原的包被率低。
发明内容
本发明的目的在于针对上述产品的缺陷，提供一种易于使用，且均一、平整、具有天然纤维结构及周期性螺纹结构的仿生胶原膜包被的培养器皿，用以增强细胞粘附、细胞增殖和细胞功能及胶原的细胞学功能。该胶原膜同器皿表面结合紧密，不易脱落。本发明同时提供该培养器皿的制备方法。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一种仿生胶原膜包被的培养器皿的制备方法，包括如下步骤：
（1）将胶原醋酸溶液与盐缓冲液混合，调整混合液的pH至中性；
（2）将步骤（1）的混合液装入培养器皿，于40摄氏度以下保温待胶原重组完成；
（3）将步骤（2）得到的含重组胶原的器皿于60摄氏度以下烘干；
（4）用超纯水洗步骤（3）得到的胶原层（避免洗涤过于剧烈致胶原层脱离器皿底面），于60摄氏度以下干燥；
（5）重复步骤（4）两次以上直至洗去所有的盐结晶，即得仿生胶原膜包被的培养器皿。
优选地，步骤（1）所述胶原醋酸溶液为I型或II型胶原醋酸溶液；溶液浓度为0.02~0.2mg/ml。
优选地，步骤（2）所述保温温度为30~37摄氏度。
优选地，步骤（2）所述保温时间为1h至5h。
优选地，步骤（2）所述的培养器皿为培养多孔板、培养皿、培养瓶等细胞或组织培养用具，TC处理与否均可。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
（1）本发明通过操作简便的自组装过程，经多次清洗烘干，通过氢键与疏水相互作用增加了胶原对器皿表面的结合力，克服了胶原在器皿底面结合力差的问题，制备出具有均一平整结构的无纺布样式纳米纤维仿生胶原膜涂层。
（2）胶原利用率高，较美国国家标准与技术研究院的方法相比，达到相同的包被效果所需使用的胶原量大大减少。
（3）器皿底面附着的胶原膜其胶原是以纳米纤维形式存在，而且当重组温度介于30至37摄氏度时，形成的纤维具有典型的67nm周期性螺纹结构。
（4）所包被的胶原膜可以通过调整胶原的浓度来控制胶原纤维的包被率和膜厚度。
（5）本发明的胶原膜活性良好，显示出卓越的细胞亲合性，在细胞粘附方面优于商业化的组织处理细胞孔板。
附图说明
图1为胶原自组装原理图。
图2是天狼星红染色的孔板图，（a）无胶原包被培养孔板；（b）无结构胶原包被培养孔板；（c）实施例1制备的纤维结构胶原包被培养孔板。
图3是实施例1制备的包被在12孔板表面的胶原膜各放大倍数扫描电镜图，（a）1000倍；（b）5000倍；（c）30000倍；（d）50000倍。
图4为实施例1制备的胶原膜刮痕试验的扫描电镜图。
图5（a）显示ATDC5在实施例1制备的包被有纤维结构胶原的培养器皿上粘附的扫描电镜图；（b）显示培养于孔板中的细胞扫描电镜图。
图6是实施例2制备的包被在12孔板表面的胶原膜扫描电镜图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步具体详细描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
一种仿生胶原膜包被的培养器皿的制备方法，步骤如下：
（1）将普通酸法提取的I型胶原用0.005M的醋酸溶液调整浓度至0.2mg/ml。
（2）缓冲液的配制：终浓度为270mM NaCl，60mM HEPES、60mMNa2HPO4·H2O、1.4mM NaOH的缓冲液。
（3）将步骤（1）和步骤（2）溶液进行混合，得到pH为中性的胶原混合液，取1ml加入Corning公司经TC处理的12孔板中，盖好盖子，于30摄氏度烘箱保温3h。
（4）将步骤（3）得到的含重组胶原的12孔板盖子打开，于30摄氏度烘箱烘12h。
（5）用超纯水洗步骤（4）得到的器皿中的胶原层，避免洗涤过于剧烈致胶原层脱离器皿底面。于30摄氏度烘箱烘2h。
（6）重复步骤（5）四次，即得仿生胶原膜包被的培养器皿。
由图2可以看出，制备的胶原膜在培养器皿表面分布平整均一，布满了整个器皿的底面。
图3可以看出，器皿底面附着的胶原膜其胶原是以纳米纤维形式存在，直径约为200nm，而且具有典型的67nm周期性螺纹结构。
图4的刮痕试验表明胶原膜仅有几层胶原纤维构成，厚度为nm级。将ATDC5细胞（一种小鼠软骨分化模型细胞）分别培养于制备的包被有纤维结构胶原的培养器皿以及普通的商业化的组织处理细胞孔板中，培养24h后戊二醛固定，梯度酒精脱水并风干，镀金膜后扫描电镜观察。
图5a显示ATDC5在包被有纤维结构胶原的培养器皿上粘附良好，显示出卓越的细胞亲合性；而培养于孔板中的细胞铺展面积要远小于培养于胶原纤维膜上的细胞（图5b）说明胶原膜活性良好，在细胞粘附方面优于商业化的组织处理细胞孔板。
实施例2
一种仿生胶原膜包被的培养器皿的制备方法，步骤如下：
（1）将普通酸法提取的I型胶原用0.005M的醋酸溶液调整浓度至0.05mg/ml。
（2）缓冲液的配制：终浓度为270mM NaCl，60mM HEPES、60mMNa2HPO4·H2O、1.4mM NaOH的缓冲液。
（3）将步骤（1）和步骤（2）溶液进行混合，得到pH为中性的胶原混合液，取1ml加入Corning公司经TC处理的12孔板中，盖好盖子，于30摄氏度烘箱保温3h。
（4）将步骤（3）得到的含重组胶原的12孔板盖子打开，于30摄氏度烘箱烘12h。
（5）用超纯水洗步骤（4）得到的器皿中的胶原层，避免洗涤过于剧烈致胶原层脱离器皿底面。于30摄氏度烘箱烘2h。
（6）重复步骤（5）四次，即得仿生胶原膜包被的培养器皿。
由图6可以看出，制备的胶原膜以比较稀疏的方式分布于12孔板底面，且平整均一。

Claims (6)

1.一种仿生胶原膜包被的培养器皿的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将胶原醋酸溶液与盐缓冲液混合，调整混合液的pH至中性；
(2)将步骤(1)的混合液装入培养器皿，于40摄氏度以下保温待胶原重组完成；
(3)将步骤(2)得到的含重组胶原的器皿于60摄氏度以下烘干；
(4)用超纯水洗步骤(3)得到的胶原层，于60摄氏度以下干燥；
(5)重复步骤(4)两次以上直至洗去所有的盐结晶，即得仿生胶原膜包被的培养器皿。
2.根据权利要1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述胶原醋酸溶液为I型或II型胶原醋酸溶液；胶原浓度为0.02～0.2mg/ml。
3.根据权利要1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述保温温度为30～37摄氏度。
4.根据权利要3所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述保温时间为1h至5h。
5.根据权利要1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述的培养器皿为培养多孔板、培养皿、培养瓶。
6.权利要求1～5任意一项所述方法制备的仿生胶原膜包被的培养器皿。
CN201210537068.4A 2012-12-12 2012-12-12 一种仿生胶原膜包被的培养器皿及制备方法 Active CN103060192B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201210537068.4A CN103060192B (zh) 2012-12-12 2012-12-12 一种仿生胶原膜包被的培养器皿及制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201210537068.4A CN103060192B (zh) 2012-12-12 2012-12-12 一种仿生胶原膜包被的培养器皿及制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN103060192A CN103060192A (zh) 2013-04-24
CN103060192B true CN103060192B (zh) 2014-09-10

Family

ID=48103094

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201210537068.4A Active CN103060192B (zh) 2012-12-12 2012-12-12 一种仿生胶原膜包被的培养器皿及制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN103060192B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113403250A (zh) * 2021-05-14 2021-09-17 华南理工大学 一种仿生胶原膜包被片及其制备方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101601869A (zh) * 2009-06-23 2009-12-16 华南理工大学 一种胶原/生物玻璃/透明质酸组织修复材料的制备方法
CN101862475A (zh) * 2009-10-10 2010-10-20 广州市创伤外科研究所 一种ⅱ型胶原透明质酸复合海绵支架及其用途
CN101954126A (zh) * 2010-09-26 2011-01-26 华南理工大学 一种仿生型改性胶原组织修复材料的制备方法
CN102517272A (zh) * 2011-11-24 2012-06-27 杭州电子科技大学 基于i型胶原凝胶的细胞微球制备与成丝的方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101601869A (zh) * 2009-06-23 2009-12-16 华南理工大学 一种胶原/生物玻璃/透明质酸组织修复材料的制备方法
CN101862475A (zh) * 2009-10-10 2010-10-20 广州市创伤外科研究所 一种ⅱ型胶原透明质酸复合海绵支架及其用途
CN101954126A (zh) * 2010-09-26 2011-01-26 华南理工大学 一种仿生型改性胶原组织修复材料的制备方法
CN102517272A (zh) * 2011-11-24 2012-06-27 杭州电子科技大学 基于i型胶原凝胶的细胞微球制备与成丝的方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN103060192A (zh) 2013-04-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Liu et al. Coaxial extrusion bioprinting of 3D microfibrous constructs with cell-favorable gelatin methacryloyl microenvironments
Zehnder et al. Evaluation of an alginate–gelatine crosslinked hydrogel for bioplotting
Huang et al. In vitro characterization of chitosan–gelatin scaffolds for tissue engineering
Bakirci et al. Cell sheet based bioink for 3D bioprinting applications
Shevach et al. Nanoengineering gold particle composite fibers for cardiac tissue engineering
Rnjak et al. Primary human dermal fibroblast interactions with open weave three-dimensional scaffolds prepared from synthetic human elastin
Pezeshki‐Modaress et al. Gelatin/chondroitin sulfate nanofibrous scaffolds for stimulation of wound healing: In‐vitro and in‐vivo study
US20160325008A1 (en) Biomedical device
Hong et al. Three-dimensional scaffold of electrosprayed fibers with large pore size for tissue regeneration
Hirayama et al. Cellular building unit integrated with microstrand-shaped bacterial cellulose
Mehrotra et al. Cell adhesive behavior on thin polyelectrolyte multilayers: cells attempt to achieve homeostasis of its adhesion energy
CN104356402A (zh) 功能性自组装纳米多肽水凝胶
Zhang et al. The influence of scaffold microstructure on chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells
Zou et al. 3D printed gelatin scaffold with improved shape fidelity and cytocompatibility by using Antheraea pernyi silk fibroin nanofibers
CN101254313A (zh) 双层胶原－壳聚糖海绵支架及其制备方法
CN101601869A (zh) 一种胶原/生物玻璃/透明质酸组织修复材料的制备方法
CN107432952B (zh) 三维石墨烯-胶原复合支架及其制备方法和应用
CN109180988A (zh) 一种功能化纳米纤维素水凝胶及其制备方法
Chutipakdeevong et al. Hybrid biomimetic electrospun fibrous mats derived from poly (ε‐caprolactone) and silk fibroin protein for wound dressing application
CN106048744A (zh) 一种利用静电纺丝制备仿细胞外基质纳米纤维敷料的方法
Le et al. Double‐hydrophobic elastin‐like polypeptides with added functional motifs: Self‐assembly and cytocompatibility
CN108368468A (zh) 细胞培养装置
CN105906835A (zh) 一种孔洞梯度改变的生物材料的制备方法
CN103060192B (zh) 一种仿生胶原膜包被的培养器皿及制备方法
Neal et al. Laminin-and basement membrane-polycaprolactone blend nanofibers as a scaffold for regenerative medicine

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant