CN103059136A - 抗中华鳖IL-1β多克隆抗体的制备及在检测中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，旨在提供一种抗中华鳖IL-1β多克隆抗体的制备及在检测中的应用。该方法包括步骤：抗原(tIL-1β)制备、动物免疫和多克隆抗体纯化。本发明以重组tIL-1β蛋白为抗原免疫实验兔获得了特异性的抗tIL-1β多克隆抗体，制备的特异性抗tIL-1β抗体可用于tIL-1β间接免疫荧光(IFA)和western-blotting检测。结果为通过免疫学方法和手段进行中华鳖的病害控制提供基础。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及兔抗中华鳖IL-1beta (Chinesesoft-shelled turtle interleukin-1 beta，tIL-1β)多克隆抗体的制备，及其在以间接免疫荧光检测(IFA)方法、western-blotting和ELISA检测中华鳖IL-1β含量的应用。
背景技术
中华鳖属脊索动物门、脊索动物亚门、爬行纲、无孔亚纲、龟鳖目、曲颈龟亚目、鳖科(Trionychidae)。龟鳖类动物作为古老的水生爬行动物，古生代晚期就已经出现，具有 2亿年的进化史，然而其形态结构保持的相对稳定性和对环境具有极强的适应能力，提示其机体内可能存在某些特殊的物质或结构，因此，具有重要的科学研究价值。同时，由于鳖类具有较高的营养、滋补价值，导致近年来人工规模化养殖快速扩张，对其病害的预防和控制也引起了广泛的关注。因此，开展中华鳖免疫机制的研究有助于我们从比较发育免疫学的角度认识机体免疫系统的进化，也有助于我们通过免疫学方法和手段进行动物的病害控制。
IL-1家族包括IL-1α，IL-1β，IL-1Ra (IL-1 receptor antagonist)，IL-18，IL-33 及IL-1F5至IL-1F10，其中IL-1α、IL-1β、IL-18和IL-1Ra等四个成员发现较早，人们对进行了广泛而深入的研究。IL-1β参与机体的局部和全身炎症反应，也在机体的免疫损伤机制中起着主要的调节作用，是一个非常重要的促炎细胞因子。研究表明，它能诱导其它炎症细胞因子(如IL-4，IL-6等)、趋化因子、粘附分子、急性期反应蛋白(Acute phase response protein，APR)等的合成，有利于机体抵抗入侵的病原微生物等。IL-1β可以刺激滑膜细胞、软骨细胞、成纤维细胞分泌大量PGE2、胶原酶和中性蛋白酶等，从而使关节中的胶原组织降解、骨质吸收、局部血管通透性增加，直接参与关节的病理损伤。近年来发现多种肿瘤与IL-1β的表达存在一定的相关性，由于IL-1β能协同IL-2、IFN-γ诱导CTL和NK细胞的杀伤活性，促进杀伤细胞IL-2受体的表达以及成纤维细胞分泌IL-6，因此具有抗肿瘤作用。研究还发现IL-1β能降低血糖水平，也与COX-2的表达存在相关性。尽管，IL-1β在参与机体的免疫防御反应中起到了积极作用，但是，IL-1β是也介导‘‘auto-inflammatory’’的主要细胞因子，尤其对一些慢性疾病发生发展起到了推波助澜作用，如心肌梗塞或中风等缺血性损伤、动脉粥样硬化、2型糖尿病、关节炎和冒烟型多发性骨髓瘤等均与其多度激活不无关系。研究表明，机体通过给予IL-1受体拮抗物（interleukin 1 receptor antagonist，IL-1ra)、IL-1单克隆抗体等减少IL-1β数量，从而有效地缓解或减轻急性和慢性非感染性炎症的发生发展。因此，IL-1β的加工成熟分泌必须被精确的控制。人类IL-1β生物学活性的多样性为我们对中华鳖IL-1β免疫机能的研究和病害的免疫干预预提供有益的借鉴，但由于缺乏有效的材料，如抗体等，使得我们对其的研究不能深入。
本发明旨在建立兔抗tIL-1β多克隆抗体的制备方法及基于该多抗的间接免疫荧光检测(IFA)方法、western-blotting检测方法和ELISA检测方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，提供一种兔抗中华鳖IL-1beta (Chinese soft-shelled turtle interleukin-1 beta，tIL-1β)多克隆抗体的制备方法，并进一步提供了基于该多抗的tIL-1β间接免疫荧光检测(IFA)方法、western-blotting检测方法和ELISA检测方法。
为解决技术问题，本发明提供的解决技术方案为：
提供一种兔抗中华鳖IL-1beta(Chinese soft-shelled turtle interleukin-1 beta，tIL-1β)多克隆抗体的制备方法，包括步骤：
(1)抗原(tIL-1β)制备
对中华鳖IL-1β基因序列PCR扩增，并引入Nde I与Xho I酶切位点，将扩增片段克隆至原核表达载体pET-30a(+)中，转化感受态E.coliBL21(DE3) pLysS菌株，挑取单菌落经PCR和测序鉴定；阳性克隆以1mmol·L-1 IPTG诱导4h，提取表达产物用SDS-PAGE检测；Ni-NTAAgarose亲和层析柱纯化表达重组蛋白，Western blot检测免疫原性和Bradford法测定蛋白浓度，纯化蛋白作为抗原备用；
（2）动物免疫
以含200 μg重组蛋白·mL乳剂-1的tIL-1β重组蛋白与弗氏完全佐剂1:1乳剂1 mL 对6月龄大耳白实验兔进行首免；分别间隔2周进行二免、三免，免疫原为tIL-1β重组蛋白与弗氏不完全佐剂1:1乳化后的乳化剂(含300 μg重组蛋白·mL乳剂-1) 1 mL；收集分离首免后第56天血清，-20℃保存备用；
（3）多克隆抗体纯化
将3次加强免疫后获得多抗血清，离心，过0.45μm滤膜，以proteinAAgarose对其进行纯化。
（4）多克隆抗体标记
将获得的兔抗tIL-1β抗体纯化后，用生物素标记，超滤去除未反应的生物素，收集生物素标记的兔抗tIL-1β抗体用ELISA方法进行样品中tIL-1β含量的检测。
本发明进一步提供了利用前述抗tIL-1β抗体实施间接免疫荧光检测tIL-1β的方法，包括：
利用BamH I/Xho I酶切位点将包含完整tIL-1β基因克隆至真核表达质粒，酶切和测序鉴定正确后，抽提质粒以转染HEK293，转染后36h，弃去培养液，以0.02M、pH7.2 磷酸缓冲液+0.05%Tween-20的PBST洗涤3次，每次3 min，用4℃预冷甲醇固定细胞，每孔150 μl，-20℃下放置30 min；同上洗涤后，加入经含5%w/v的脱脂奶粉PBST 50倍稀释的抗tIL-1β抗体，每孔50 μl，37℃作用l h；同上洗涤后，分别加入经含5%脱脂奶粉PBST 80倍稀释的FITC-羊抗兔IgG抗体，每孔50 μl，37℃作用l h；同上洗涤后，用含50%甘油的PBS封底，并置于荧光显微镜下观察结果。
本发明进一步提供了利用前述抗tIL-1β抗体实施western-blotting检测tIL-1β的方法，包括：
利用BamH I/Xho I酶切位点将包含完整tIL-1β基因克隆至真核表达质粒，酶切和测序鉴定正确后，抽提质粒以转染HEK293，转染后36h，弃去培养液，收集细胞并裂解，提取细胞总蛋白，进行SDS-PAGE电泳，将凝胶分离的蛋白转移至NC膜，用含5%脱脂奶粉的TBST(Tris缓冲液、0.05% 吐温20)封闭，以提纯的多抗为一抗，HRP标记的羊抗兔IgG为二抗(Promega公司)，4-氯-1-萘酚(4-CN)显色并拍照。
本发明进一步提供了利用前述兔抗tIL-1β抗体标记后用ELISA进行tIL-1β检测的方法，包括：
将酶标板用一定浓度的纯化兔抗tIL-1β抗体包被后，加入100微升待检样品在一定温度下孵育1-2小时，适当洗涤后，加入生物素标记的兔抗tIL-1β抗体在一定温度下孵育1-2小时，适当洗涤后，加入显色液，直接在酶标仪上读取OD490nm值，根据OD值的大小，可以了解待检样品中tIL-1β的含量。
相对于现有技术，本发明的有益效果在于：
本发明以重组tIL-1β蛋白为抗原免疫实验兔获得了特异性的抗tIL-1β多克隆抗体，制备的特异性抗tIL-1β抗体可用于tIL-1β间接免疫荧光(IFA)和western-blotting检测。结果为通过免疫学方法和手段进行中华鳖的病害控制提供基础。
附图说明
图 1 为重组中华鳖IL-1β前体蛋白SDS-PAGE(A)的检测分析图。
图中，1为pET32空载体；2为pET32-t-IL-1β诱导表达；3为细胞超声后上清液；4为细胞超声后沉淀。
图2为重组中华鳖IL-1β抗His抗体western-blotting的检测分析图。
图 3为Protein A纯化抗tIL-1β多抗SDS-PAGE分析图。
图4为纯化多抗检测tIL-1β真核表达质粒转染HEK293细胞的SDS-PAGE分析图。
具体实施方式
下面结合实施对本发明的抗体剂制备技术和应用作进一步描述。
1 材料与方法
1.1 抗原制备
参考《分子克隆实验指南》和GenBank上发表的tIL-1β蛋白基因序列(GenBank登录号：JX846915)，PCR扩增tIL-1β基因，利用BamH I/Xho I酶切位点克隆至原核表达载体pET-30a(+)中，转化感受态E.coli BL21(DE3) pLysS菌株，挑取单菌落进行PCR和测序鉴别；1 mmol·L-1 IPTG诱导阳性克隆4h，表达产物用SDS-PAGE检测；重组蛋白用Ni-NTA Agarose亲和层析柱纯化表达，Western blot检测后，用饱和硫酸铵纯化蛋白，Bradford法测定蛋白浓度，备用作为抗原。
1.2 试验动物
试验动物为6月龄健康大耳白实验兔。
1.3 免疫方法
tIL-1β重组蛋白与弗氏完全佐剂1:1乳化后的乳化剂(含200 μg重组蛋白·mL乳剂-1) 1 mL为进行首免；分别间隔2周进行二免、三免，免疫原为tIL-1β重组蛋白与弗氏不完全佐剂1:1乳化后的乳化剂(含300 μg重组蛋白·mL乳剂-1) 1 mL；收集分离首免后第56天血清，-20℃保存备用。
1.4 多克隆抗体纯化
将3次加强免疫后获得多抗血清，离心，过0.45μm滤膜，以proteinAAgarose对其进行纯化。
1.5 免疫印迹(West-Blotting)分析多克隆抗体的反应性
将SDS-PAGE电泳凝胶分离的蛋白转移至NC膜，用含5%脱脂奶粉的TBST(Tris缓冲液、0.05% 吐温20)封闭，以提纯的多抗为一抗，HRP标记的羊抗兔IgG为二抗(Promega公司)，4-氯-1-萘酚(4-CN)显色并拍照。
1.6间接免疫荧光(IFA)
利用BamH I/Xho I酶切位点将完整tIL-1β基因克隆至真核表达质粒，酶切和测序鉴定正确后。抽提质粒以转染HEK293，转染后36h，弃去培养液，以0.02M、pH7.2 磷酸缓冲液+0.05%Tween-20的PBST洗涤3次，每次3 min，用4℃预冷甲醇固定细胞，每孔150 μl，-20℃下放置30 min；同上洗涤后；加入经含5%w/v的脱脂奶粉PBST 50倍稀释的抗tIL-1β抗体或抗Flag抗体，每孔50 μl，37℃作用l h；同上洗涤后，分别加入经含5%脱脂奶粉PBST 80倍稀释的FITC-羊抗兔IgG抗体，每孔50 μl，37℃作用l h；同上洗涤后，用含50%甘油的PBS封底，并置于荧光显微镜下观察结果。
2 结果
2.1 tIL-1β重组蛋白表达和纯化
图1、2显示tIL-1β重组蛋白表达SDS-PAGE和western-blotting分析结果。含重组质粒pET30a-tIL-1β的E.coli BL21(DE3)诱导表达的SDS-PAGE分析结果显示，融合蛋白6His- tIL-1β相对分子量约为18kDa（图1)，与理论推测结果一致，表达产物经Ni-NTA Agarose亲和层析后纯度较高（图1)。经Bradford 法测定浓度，推算出每升重组菌可纯化得到目的蛋白68.9 mg。利用抗His抗体对表达产物进行Westernblot分析显示，在转印膜目的蛋白处出现特异性反应条带，表明融合表达产物对抗His抗体具有良好的免疫反应性(图2)。
2.2 抗tIL-1β多克隆抗体纯化
经proteinA Agarose亲和层析后的SDS-PAGE电泳显示(图3)，纯化后的多克隆抗体纯度较高，几乎不含杂蛋白，可见Mr为58 KDa重链和27 KDa轻链。
2.3 Western Blotting检测
图4显示纯化多抗检测tIL-1β真核表达质粒转染HEK293细胞的SDS-PAGE分析结果。结果显示，纯化多抗不仅与tIL-1β前体具有良好的反应性，而且也可与成熟tIL-1β出现反应。
2.4 特异性抗tIL-1β抗体IFA检测tIL-1β
IFA检测转染tIL1β真核表达质粒的HEK293细胞的结果表明，抗tIL-1β多克隆抗体能与真核表达的tIL1β表现特异性的结合，经FITC-羊抗兔IgG抗体作用后，表现特异性的荧光。其中，以5%脱脂奶粉作抗体稀释液和封闭液时效果较好，显著降低了反应背景。
Claims (3)
1.一种抗抗中华鳖IL-1β多克隆抗体的制备方法，包括步骤：
(1)抗原(tIL-1β)制备
对中华鳖IL-1β基因序列PCR扩增，并引入Nde I与Xho I酶切位点，将扩增片段克隆至原核表达载体pET-30a(+)中，转化感受态E.coliBL21(DE3) pLysS菌株，挑取单菌落经PCR和测序鉴定；阳性克隆以1mmol·L-1 IPTG诱导4h，提取表达产物用SDS-PAGE检测；Ni-NTAAgarose亲和层析柱纯化表达重组蛋白，Western blot检测免疫原性和Bradford法测定蛋白浓度，纯化蛋白作为抗原备用；
（2）动物免疫
以含200 μg重组蛋白·mL乳剂-1的tIL-1β重组蛋白与弗氏完全佐剂1:1乳剂1 mL 对6月龄大耳白实验兔进行首免；分别间隔2周进行二免、三免，免疫原为tIL-1β重组蛋白与弗氏不完全佐剂1:1乳化后的乳化剂1 mL，乳化剂含300 μg重组蛋白·mL乳剂-1；收集分离首免后第56天血清，-20℃保存备用；
（3）多克隆抗体纯化
将3次加强免疫后获得多抗血清，离心，过0.45μm滤膜，以proteinAAgarose对其进行纯化。
2.一种利用权利要求1中所述的抗tIL-1β抗体实施间接免疫荧光检测tIL-1β的方法，包括：
利用BamH I/Xho I酶切位点将包含完整tIL-1β基因克隆至真核表达质粒，酶切和测序鉴定正确后，抽提质粒以转染HEK293，转染后36h，弃去培养液，以0.02M、pH7.2 磷酸缓冲液+0.05%Tween-20的PBST洗涤3次，每次3 min，用4℃预冷甲醇固定细胞，每孔150 μl，-20℃下放置30 min；同上洗涤后，加入经含5%w/v的脱脂奶粉PBST 50倍稀释的抗tIL-1β抗体，每孔50 μl，37℃作用l h；同上洗涤后，分别加入经含5%脱脂奶粉PBST 80倍稀释的FITC-羊抗兔IgG抗体，每孔50 μl，37℃作用l h；同上洗涤后，用含50%甘油的PBS封底，并置于荧光显微镜下观察结果。
3.一种利用权利要求1中所述的抗tIL-1β抗体实施western-blotting检测tIL-1β的方法，包括：
利用BamH I/Xho I酶切位点将包含完整tIL-1β基因克隆至真核表达质粒，酶切和测序鉴定正确后，抽提质粒以转染HEK293，转染后36h，弃去培养液，收集细胞并裂解，提取细胞总蛋白，进行SDS-PAGE电泳，将凝胶分离的蛋白转移至NC膜，用含5%脱脂奶粉的TBST封闭，以提纯的多抗为一抗，HRP标记的羊抗兔IgG为二抗，4-氯-1-萘酚(4-CN)显色并拍照；TBST为Tris缓冲液+0.05% 吐温20。
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| PB01 | Publication | ||
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| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
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Application publication date: 20130424 |