CN103045708A - 利用色素合成酶辅助因子诱导小球藻合成虾青素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于微藻生物技术领域，特别涉及一种利用色素合成酶辅助因子诱导小球藻合成虾青素的方法。具体为将小球藻在液体培养基中活化培养，获得同步化生长的藻液，待用；取上述生长到处于指数生长期的藻液，并向藻液中添加色素合成酶辅助因子，同时补充碳源和氮源进行培养，直至藻体细胞内虾青素的积累量最高时培养结束，采收细胞破壁提取虾青素。本发明简单易行、成本低廉、能显著增加虾青素的产量，从而大大提高小球藻生产虾青素的效率。

Description

利用色素合成酶辅助因子诱导小球藻合成虾青素的方法

技术领域

本发明属于微藻生物技术领域，特别涉及一种利用色素合成酶辅助因子诱导小球藻合成虾青素的方法。

背景技术

虾青素(Astaxanthin)是一种鲜红色脂溶性色素，属于酮式类胡萝卜素。大量实验表明，虾青素不但具有独特的着色功能，而且还表现出超强的抗氧化特性和多种生物活性。由于突出的生理功能，虾青素在水产及家禽养殖、食品、化妆品、医药等领域具有广阔的应用前景，因此几十年来利用各种途径生产虾青素一直是国内外普遍关注的热点问题。

目前虾青素的规模化生产主要依靠化学手段人工合成，或是从甲壳类动物及其加工后的废物、红法夫酵母(Xanthophyllomyces dendrorhous，即以前的Phaffia rhodozyma)及雨生红球藻(Haema tococcus pluvialis)中提取生物合成的天然虾青素。由于生产技术难度高及菌种和藻种本身的限制，虾青素的产量有限，远远不能满足市场需求，这也在一定程度上制约了天然虾青素的广泛应用。

小球藻Chlorella zofingiensis合成虾青素的能力自二十世纪90年代报道后引起了广泛关注，被认为有可能成为新的天然虾青素工业来源。1994年，Rise等首次报道了C.zofingiensis在高光和氮缺乏的协同作用下，能够在胞内大量合成并积累虾青素，用以抵御光氧化损伤。随后，C.zofingiensis的虾青素合成模式、合成途径、及其合成途径上关键基因的表达调控机制陆续被报道出来。2005年，Ip和Chen首次发现了光照不是诱导C.zofingiensis虾青素积累的必要条件，在黑暗条件下C.zofingiensis仍然能以较快的速度合成虾青素，提出了暗异养培养C.zofingiensis生产虾青素的概念，并申请了美国专利(US2005214897-A1)。上述研究进展暗示，虽然小球藻C.zofingiensis和雨生红球藻H.pluvialis一样同属单细胞绿藻，但二者的细胞生理生化特性和虾青素合成机制截然不同。因此，C.zofingiensis源虾青素的生产工艺不能照搬照抄现有的H.pluvialis源虾青素的生产模式和调控技术，必须专门针对C.zofingiensis细胞特性及其虾青素代谢调控机制建立一套新的工艺流程和设备，这是C.zofingiensis源虾青素产业化生产前必须首先完成的任务。

发明内容

本发明目的在于提供一种利用色素合成酶辅助因子诱导小球藻合成虾青素的方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

(1)活化培养：将小球藻(Chlorella zofingiensis)在液体培养基中活化培养，获得同步化生长的藻液，待用；

(2)诱导培养：取步骤(1)中生长到处于指数生长期的藻液，并向藻液中添加色素合成酶辅助因子，同时补充碳源和氮源进行培养，直至藻体细胞内虾青素的积累量最高时培养结束，采收细胞破壁提取虾青素。

所述活化培养是将小球藻(C.zofingiensis)培养于液体培养基中振荡发酵养，培养条件为温度20-30℃，光强0-200μmol m^-2s^-1，转速100-200rpm，光暗比为12-24h/12-24h。

所述液体培养基为Kuhl、BG-11、BBM、Basa1、CZ-M1、KM1中的一种。

所述Kuhl培养基为：10g/L葡萄糖、1g/L硝酸钾、89mg/L十二水磷酸氢二钠、621mg/L二水磷酸二氢钠、246mg/L七水硫酸镁、9.3mg/LEDTA、6.9mg/L七水硫酸亚铁、14.7mg/L二水氯化钙、0.29mg/L七水硫酸锌、0.17mg/L一水硫酸锰、0.06mg/L硼酸、0.002mg/L五水硫酸铜、0.012mg/L四水钼酸铵、1000ml水，pH 6.5。

所述诱导培养为取步骤(1)中生长到处于指数生长期的藻液，并向藻液中添加色素合成酶辅助因子，同时补充碳源和氮源进行振荡发酵养培养，培养条件为温度20-30℃，光强0-200μmol m^-2s^-1，转速100-200rpm，光暗比为12-24h/12-24h；直至藻体细胞内虾青素的积累量最高时培养结束，采收细胞破壁提取虾青素。

所述色素合成酶辅助因子为Mg、Zn、Cu、Fe、Mn中的一种或几种；并且其一次性添加或流加，流加量控制在0.02-20mM。

所述碳源为无机碳源和/或有机碳源；所述氮源为无机氮源和/或有机氮源；并且其一次性添加或流加，碳源和氮源添加量控制在C/N比100-300。

所述无机碳源为二氧化碳、碳酸盐、碳酸氢盐中的一种或几种；所述有机碳源为葡萄糖、蔗糖、果糖、甘油、乙醇、醋酸盐中的一种或几种。

所述无机氮源为硝酸盐、铵盐、氨水中的一种或几种；所述有机氮源为尿素、酵母粉、蛋白胨中的一种或几种。

本发明所具有的优点：本发明基于对小球藻C.zofingiensis中虾青素合成代谢调控的研究，筛选出了虾青素合成的有效促进剂(色素合成酶辅助因子)，实现了小球藻虾青素的快速合成和高效积累。

本发明采用廉价原料，操作简单，具有很高的推广应用价值，具体为通过在细胞生长的指数期添加虾青素合成促进剂，同时适当补充碳源和氮源，在避免了这些物质过早加入对藻细胞生长的抑制作用的同时，大幅提高了虾青素的产量，是对照组的1.4-6.5倍。从中提取的虾青素可用于水产及家禽养殖、食品、化妆品、医药等领域。

具体实施方式

实施例1

1)活化培养：无菌条件下挑取小球藻C.zofingiensis单藻落到灭菌的Kuhl液体培养基中，而后将藻种按10％(体积比)接种量，接种到含100ml无菌Kuhl培养基的250ml三角瓶中，在温度为25℃，转速为150rpm，光照强度为100μmol m^-2s^-1连续光照的摇床中振荡培养。

Kuhl培养基配方：10g/L葡萄糖、1g/L硝酸钾、89mg/L十二水磷酸氢二钠、621mg/L二水磷酸二氢钠、246mg/L七水硫酸镁、9.3mg/LEDTA、6.9mg/L七水硫酸亚铁、14.7mg/L二水氯化钙、0.29mg/L七水硫酸锌、0.17mg/L一水硫酸锰、0.06mg/L硼酸、0.002mg/L五水硫酸铜、0.012mg/L四水钼酸铵、1000ml水，pH 6.5。

2)诱导培养：取步骤(1)培养3天后中生长到处于指数生长期的藻液，在无菌条件下，向培养液内加入氯化亚铁至终浓度0.2mM，葡萄糖至终浓度200mM，硝酸钾至终浓度5mM。继续培养20天后，藻细胞的生物量和虾青素产量达到最高，培养结束，取样采用液相色谱(HPLC)法测定(色谱仪采用Waters 2695自动抽气进样系统和Waters 2996紫外检测器、二极管阵列检测器(PDA)；光谱扫描波长范围为300-700nm；积分定量用检测波长为450nm；温度4℃；进样量20μl；流速1.2ml min^-1；色谱柱采用Waters

ODS2C₁₈反相柱(4.6×250mm，5μm)；流动相A采用乙腈∶无水甲醇∶0.1M Tris-盐酸(pH 8.0)的体积比为84∶2∶14；流动相B采用无水甲醇∶乙酸乙酯的体积比为68∶32；洗脱梯度为100％A至100％B，15min；100％B，20min)虾青素产量。测得虾青素产量高达26mg/L。

同时以未添加氯化亚铁作为对照1组，未添加氯化亚铁、葡萄糖和硝酸钾作为对照2组，采用液相色谱(HPLC)法测定本发明、对照组1和对照组2虾青素产量，测得本发明虾青素产量为26mg/L，是对照组1虾青素产量的1.6倍，是对照组2虾青素产量的6.5倍。

实施例2

1)活化培养：无菌条件下挑取小球藻C.zofingiensis单藻落到灭菌的Kuhl液体培养基中，而后将藻种按10％(体积比)接种量，接种到含100ml无菌Kuhl培养基的250ml三角瓶中，在温度为25℃，转速为150rpm，光照强度为100μmol m^-2s^-1连续光照的摇床中振荡培养。

Kuhl培养基配方：10g/L葡萄糖、1g/L硝酸钾、89mg/L十二水磷酸氢二钠、621mg/L二水磷酸二氢钠、246mg/L七水硫酸镁、9.3mg/LEDTA、6.9mg/L七水硫酸亚铁、14.7mg/L二水氯化钙、0.29mg/L七水硫酸锌、0.17mg/L一水硫酸锰、0.06mg/L硼酸、0.002mg/L五水硫酸铜、0.012mg/L四水钼酸铵、1000ml水，pH 6.5。

2)诱导培养：取步骤(1)培养3天后中生长到处于指数生长期的藻液，在无菌条件下，向培养液内加入氯化镁至终浓度20mM，葡萄糖至终浓度200mM，硝酸钾至终浓度5mM。继续培养20天后，藻细胞的生物量和虾青素产量达到最高，培养结束，取样采用液相色谱(HPLC)法测定(色谱仪采用Waters 2695自动抽气进样系统和Waters 2996紫外检测器、二极管阵列检测器(PDA)；光谱扫描波长范围为300-700nm；积分定量用检测波长为450nm；温度4℃；进样量20μl；流速1.2ml min^-1；色谱柱采用Waters

ODS2C₁₈反相柱(4.6×250mm，5μm)；流动相A采用乙腈∶无水甲醇∶0.1M Tris-盐酸(pH 8.0)的体积比为84∶2∶14；流动相B采用无水甲醇∶乙酸乙酯的体积比为68∶32；洗脱梯度为100％A至100％B，15min；100％B，20min)虾青素产量。测得虾青素产量高达22mg/L。

同时以未添加氯化镁作为对照1组，未添加氯化镁、葡萄糖和硝酸钾作为对照2组，采用液相色谱(HPLC)法测定本发明、对照组1和对照组2虾青素产量，测得本发明虾青素产量为22mg/L，是对照组1虾青素产量的1.4倍，是、对照组2虾青素产量的5.5倍。

实施例3

1)活化培养：无菌条件下挑取小球藻C.zofingiensis单藻落到灭菌的Kuhl液体培养基中，而后将藻种按10％(体积比)接种量，接种到含100ml无菌Kuhl培养基的250ml三角瓶中，在25℃，转速为150rpm，光照强度为100μmol m^-2s^-1连续光照的摇床中振荡培养。

Kuhl培养基配方：10g/L葡萄糖、1g/L硝酸钾、89mg/L十二水磷酸氢二钠、621mg/L二水磷酸二氢钠、246mg/L七水硫酸镁、9.3mg/LEDTA、6.9mg/L七水硫酸亚铁、14.7mg/L二水氯化钙、0.29mg/L七水硫酸锌、0.17mg/L一水硫酸锰、0.06mg/L硼酸、0.002mg/L五水硫酸铜、0.012mg/L四水钼酸铵、1000ml水，pH 6.5。

2)诱导培养：取步骤(1)培养3天后中生长到处于指数生长期的藻液，在无菌条件下，向培养液内加入氯化铜至终浓度0.02mM，葡萄糖至终浓度200mM，硝酸钾至终浓度5mM。继续培养20天后，藻细胞的生物量和虾青素产量达到最高，培养结束，取样采用液相色谱(HPLC)法测定(色谱仪采用Waters 2695自动抽气进样系统和Waters 2996紫外检测器、二极管阵列检测器(PDA)；光谱扫描波长范围为300-700nm；积分定量用检测波长为450nm；温度4℃；进样量20μl；流速1.2ml min^-1；色谱柱采用Waters

ODS2C₁₈反相柱(4.6×250mm，5μm)；流动相A采用乙腈∶无水甲醇∶0.1M Tris-盐酸(pH 8.0)的体积比为84∶2∶14；流动相B采用无水甲醇∶乙酸乙酯的体积比为68∶32；洗脱梯度为100％A至100％B，15min；100％B，20min)虾青素产量。测得虾青素产量高达23mg/L。

同时以未添加氯化铜作为对照1组，未添加氯化铜、葡萄糖和硝酸钾作为对照2组，采用液相色谱(HPLC)法测定本发明、对照组1和对照组2虾青素产量，测得本发明虾青素产量为23mg/L，是对照组1虾青素产量的1.4倍，是对照组2虾青素产量的5.8倍。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种利用色素合成酶辅助因子诱导小球藻合成虾青素的方法，其特征在于：

(1)活化培养：将小球藻(Chlorella zofingiensis)在液体培养基中活化培养，获得同步化生长的藻液，待用；

(2)诱导培养：取步骤(1)中生长到处于指数生长期的藻液，并向藻液中添加色素合成酶辅助因子，同时补充碳源和氮源进行培养，收集培养后菌株细胞破壁提取虾青素。

2.按权利要求1所述的利用色素合成酶辅助因子诱导小球藻合成虾青素的方法，其特征在于：

所述活化培养是将小球藻(C.zofingiensis)培养于液体培养基中振荡发酵养，培养条件为温度20-30℃，光强0-200μmol m^-2s^-1，转速100-200rpm，光暗比为12-24h/12-24h。

3.按权利要求1或2所述的利用色素合成酶辅助因子诱导小球藻合成虾青素的方法，其特征在于：所述液体培养基为Kuhl、BG-11、BBM、Basa1、CZ-M1、KM1中的一种。

4.按权利要求3所述的利用色素合成酶辅助因子诱导小球藻合成虾青素的方法，其特征在于：所述Kuhl培养基为：10g/L葡萄糖、1g/L硝酸钾、89mg/L十二水磷酸氢二钠、621mg/L二水磷酸二氢钠、246mg/L七水硫酸镁、9.3mg/L EDTA、6.9mg/L七水硫酸亚铁、14.7mg/L二水氯化钙、0.29mg/L七水硫酸锌、0.17mg/L一水硫酸锰、0.06mg/L硼酸、0.002mg/L五水硫酸铜、0.012mg/L四水钼酸铵、1000ml水，pH 6.5。

5.按权利要求3所述的利用色素合成酶辅助因子诱导小球藻合成虾青素的方法，其特征在于：所述诱导培养为取步骤1)中生长到处于指数生长期的藻液，并向藻液中添加色素合成酶辅助因子，同时补充碳源和氮源进行振荡发酵养培养，培养条件为温度20-30℃，光强0-200μmol m^-2s^-1，转速100-200rpm，光暗比为12-24h/12-24h；直至藻体细胞内虾青素的积累量最高时培养结束，采收细胞破壁提取虾青素。

6.按权利要求1或5所述的利用色素合成酶辅助因子诱导小球藻合成虾青素的方法，其特征在于：所述色素合成酶辅助因子为Mg、Zn、Cu、Fe、Mn中的一种或几种；并且其一次性添加或流加，流加量控制在0.02-20mM。

7.按权利要求1或5所述的利用色素合成酶辅助因子诱导小球藻合成虾青素的方法，其特征在于：所述碳源为无机碳源和/或有机碳源；所述氮源为无机氮源和/或有机氮源；并且其一次性添加或流加，碳源和氮源添加量控制在C/N比100-300。

8.按权利要求7所述的利用色素合成酶辅助因子诱导小球藻合成虾青素的方法，其特征在于：所述无机碳源为二氧化碳、碳酸盐、碳酸氢盐中的一种或几种；所述有机碳源为葡萄糖、蔗糖、果糖、甘油、乙醇、醋酸盐中的一种或几种。

9.按权利要求7所述的利用色素合成酶辅助因子诱导小球藻合成虾青素的方法，其特征在于：所述无机氮源为硝酸盐、铵盐、氨水中的一种或几种；所述有机氮源为尿素、酵母粉、蛋白胨中的一种或几种。