CN103040847A - 一种小分子化合物zzy-0001在制备抗肿瘤药物中的新用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于计算机辅助药物设计发现的一种小分子化合物ZZY-0001在制备与Bcl-2蛋白家族抗细胞凋亡成员Mcl-1蛋白高表达相关的疾病(如肿瘤、自身免疫性疾病)的治疗药物中的用途。本发明还涉及该类化合物在制备增效剂中的用途，所述增效剂与其它抗肿瘤药物或放射治疗合用以治疗肿瘤。
Description
技术领域
本发明属于生物技术和医学领域。具体而言，本发明涉及基于计算机辅助药物设计发现的一种小分子化合物ZZY-0001在制备与Bcl-2蛋白家族抗细胞凋亡成员Mcl-1蛋白高表达相关的疾病(如肿瘤、自身免疫性疾病)的治疗药物中的用途。本发明还涉及该化合物在制备增效剂中的用途，所述增效剂与其它抗肿瘤药物或放射治疗合用以治疗肿瘤。
背景技术
细胞凋亡是细胞受到某种信号刺激后进行的程序化死亡，是细胞的一种基本生物学现象。而Bcl-2蛋白家族在细胞凋亡通路起重要的调节作用。它可以分为抗凋亡成员和促凋亡成员两类。研究表明Bcl-2蛋白家族抗细胞凋亡成员过度表达可导致正常细胞凋亡通路受阻，与许多疾病(如肿瘤、自身免疫性疾病)的发生相关，特别是肿瘤产生及发生耐药的重要原因之一。(Nature 2000，407，796-801；Nat Rev Cancer 2004，4，592-603)
研究表明Bcl-2蛋白家族抗细胞凋亡成员被发现在许多肿瘤中过度表达，不同成员在不同肿瘤以及不同肿瘤亚型中的表达水平不同。(Oncogene 2003，22，8590-607；Oncogene 2008，27，6398-406)通过抑制肿瘤细胞中过度表达的抗细胞凋亡成员的抗凋亡作用，可以恢复其正常的凋亡通路，增加其对化疗放疗的敏感性，是治疗肿瘤的新策略。Bcl-2蛋白家族抗细胞抗凋亡成员是通过其表面的疏水凹槽与促凋亡成员的Bcl-2蛋白家族保守区域(BH)3结合而发生相互作用，来调节细胞正常的生理凋亡。小分子抑制剂通过结合于抗凋亡成员表面疏水凹槽，可以干扰促凋亡成员BH3区域与之结合起到促进细胞凋亡的作用。(NatRev Cancer2005，5，876-85；Kelly，P.N.；Cell Death Differ 2011，18，1414-24)近些年该类小分子抑制剂引起了研究者的广泛兴趣，通过不同途径发现了一系列小分子抑制剂，其中有三个(ABT-263，AT-101，GX15-07)作为口服抗肿瘤药物进入临床研究。研究结果表明Bcl-2蛋白家族抗细胞凋亡成员小分子抑制剂展现出较好的抗肿瘤作用和对其他抗肿瘤药物或放射治疗的增效协同作用，具有很好的发展前景。(Nat Rev Drug Discov 2008，7，989-100；中国新药杂志2008，17，2008-2013.；药学进展2004，28，97-103；Clin Cancer Res 2012，18，1-7；J Thorac Oncol 2011，6，1757-1760；Lung Cancer 2011，74，481-485)
在Bcl-2蛋白家族抗细胞抗凋亡成员中，除了众所周知的Bcl-xL和Bcl-2蛋白，Mcl-1蛋白也越来越被重视，研究发现其过度表达与很多肿瘤的发生和耐药具有密切关系。(BioorgMed Chem Lett，2012，22，39-44；J Hepatol，2006，44，151-157；Leukemia 2005，19，1248-1252)另外，研究还表明虽然Mcl-1蛋白与Bcl-xL、Bcl-2蛋白为同源蛋白，但是其活性腔结构具有显著差异，这导致了其结合底物具有明显不同的选择性。(J Biol Chem 2009，284，30508-30517；J Biol Chem 2005，280，4738-4744；Mol Cell 2005，17，393-403；Cancer Cell 2006，9，351-365)如对于Bcl-xL和Bcl-2蛋白具有高亲和力的ABT-263和ABT-737这类化合物单独使用抗瘤谱较窄，就因为其Mcl-1蛋白结合力较差。(Nature2005，435，677-681；Cancer Cell 2006，10，389-399；Oncogene 2007，26，3972-3979)因此，对于Bcl-2蛋白家族抗细胞抗凋亡成员Bcl-xL、Bcl-2和Mcl-1蛋白具有广谱作用的小分子抑制剂作为抗肿瘤(特别是Mcl-1蛋白高表达的肿瘤)药物更为理想。
发明内容
本研究前期深入分析了Bcl-2蛋白家族抗细胞凋亡成员抑制剂结合腔，构建了小分子抑制剂三维药效团模型(Bioorg Med Chem Lett，2012，22，39-44；Bioorgan Med Chem，2007，15，6407-6417；高等学校化学学报，2008，29，591-595；化学学报，2006，64，2327-2332；化学学报，2006，64，2215-2220)，并进一步对Bcl-xL、Bcl-2蛋白和Mcl-1蛋白结合底物选择性差异的结构基础进行了研究，在此基础上开展了对三个蛋白具有广谱作用的小分子抑制剂的计算机辅助设计研究。我们发现ABT-737结构中的二乙氨乙基链极大影响了其与Mcl-1蛋白的结合，因此我们对ABT-737结构进行改造成功获得了一个对于Bcl-xL、Bcl-2蛋白和Mcl-1蛋白具有广谱作用的小分子抑制剂ZZY-0001。
本发明涉及如式I所示编号为ZZY-0001的化合物在制备与Bcl-2蛋白家族抗细胞凋亡成员Mcl-1蛋白高表达相关的疾病(如肿瘤、自身免疫性疾病)的治疗药物中的用途。
该化合物我们参照文献(J Med Chem 2008，51，6902)方法合成。该化合物曾在改善ABT-737口服生物利用度的研究中被合成过，但文献仅报道了其动物口服生物利用度和在人小细胞肺癌NCI-H146上的抗肿瘤活性(JMed Chem 2008，51，6902)，以及对于Bcl-xL和Bcl-2蛋白的亲和力(US20070072860，US20070015787，US20060258657，US20060128706，WO2005049594，WO 2005049593)。研究表明虽然Mcl-1蛋白与Bcl-xL、Bcl-2蛋白为同源蛋白，但是其活性腔结构具有显著差异，这导致了其结合底物具有明显不同的选择性。(J BiolChem 2009，284，30508-30517；JBiol Chem 2005，280，4738-4744；Mol Cell 2005，17，393-403；Cancer Cell 2006，9，351-365)如对于Bcl-xL和Bcl-2蛋白具有高亲和力的ABT-263和ABT-737这类化合物单独使用抗瘤谱较窄，就因为其Mcl-1蛋白结合力较差。(Nature 2005，435，677-681；Cancer Cell 2006，10，389-399；Oncogene 2007，26，3972-3979)其他大部分ABT-737类似物，也只报道了与Bcl-xL、Bcl-2蛋白的结合力。(Nature 2005，435，677；J Med Chem 2006，49，656；J Med Chem 2006，49，1165；J Med Chem 2007，50，641)因此我们通过计算机辅助设计对ABT-737进行改造得到小分子化合物ZZY-0001，并发现其Mcl-1蛋白结合力较好具有显著创新性。
经荧光偏振(FP)方法测试Bcl-xL、Bcl-2蛋白和Mcl-1蛋白亲和力，结果发现小分子化合物ZZY-0001能通过结合于Bcl-xL、Bcl-2蛋白和Mcl-1蛋白表面疏水凹槽，干扰促凋亡成员BH3区域与之结合。该类化合物因此可起到促进细胞凋亡的作用，可作为与Bcl-2蛋白家族抗细胞凋亡成员Bcl-xL、Bcl-2蛋白和Mcl-1蛋白高表达相关的疾病的治疗药物用于动物，优选用于哺乳动物，特别是人。
经MTT法测试体外抗肿瘤活性，结果表明小分子化合物ZZY-0001能较好的抑制Bcl-2蛋白家族抗细胞凋亡成员Bcl-xL、Bcl-2蛋白和Mcl-1蛋白高表达的肿瘤细胞的增殖。肿瘤包括人非小细胞肺癌、乳腺癌、白血病、宫颈癌和结肠癌。
本发明还涉及小分子化合物ZZY-0001在制备与Bcl-2蛋白家族抗细胞凋亡成员Bcl-xL、Bcl-2蛋白和Mcl-1蛋白高表达相关的疾病(如肿瘤、自身免疫性疾病)的治疗药物中的用途，所述的药物含有药学上可接受的载体。
本发明还涉及小分子化合物ZZY-0001在制备与Bcl-2蛋白家族抗细胞凋亡成员Bcl-xL、Bcl-2蛋白和Mcl-1蛋白高表达相关的疾病(如肿瘤、自身免疫性疾病)的治疗药物中的用途，所述的药物剂型是片剂、胶囊、粉末剂、颗粒剂、混悬剂或注射剂。
研究表明Bcl-2蛋白家族抗细胞凋亡成员Bcl-xL、Bcl-2蛋白和Mcl-1蛋白小分子抑制剂与其他抗肿瘤药物或放射治疗合用具有较好的增效协同作用，其他抗肿瘤药物包括依托泊苷、阿霉素、顺铂、紫杉醇、甲泼尼龙、苯丙氨酸氮芥、地塞米松等(Nature2005，435，677-81；J.Med.Chem.2006，49，1165-1181，Cancer res.2006，66，8731-8739；Clin.Cancer Res.2007，13，621-629)。因此本发明还涉及小分子化合物ZZY-0001在制备增效剂中的用途，所述增效剂与其它抗肿瘤药物或放射治疗合用以治疗肿瘤。
附图说明
图1不同肿瘤细胞系的Bcl-2、Bcl-xL和Mcl-1蛋白表达量
具体实施方法
本发明可通过下面的实施例得以说明，但这些实施例不意味着对本发明有任何限制。
实施例1：小分子化合物ZZY-0001与Bcl-2、Bcl-xL和Mcl-1三种蛋白亲和力测试
实验方法：参考前期工作和相关文献(Bioorg Med Chem Lett 2012，22，39-44；ChemMedChem 2011，6，904-21)，以ABT-737、ABT-263和AT-101作为对照药，采用荧光偏振(FP)方法考察目标化合物竞争抑制Bcl-2、Bcl-xL和Mcl-1蛋白与促凋亡蛋白Bim或Bid的BH3肽段(荧光素标记)结合的能力来评价其与靶蛋白的亲和力。荧光偏振信号由荧光分光光度计在激发光波长485nm和发射光波长为535nm的条件下检测。将系列浓度目标化合物与荧光素标记的Bim或Bid的BH3肽段与Bcl-2、Bcl-xL或Mcl-1蛋白一起在室温下培养20分钟后，检测其荧光偏振信号，计算该化合物的IC50值。并根据测量中所使用的蛋白总浓度、荧光多肽的总浓度、蛋白-多肽复合物的解离常数以及检测化合物的IC50值，计算检测化合物的竞争性抑制常数Ki。
实验结果：小分子化合物ZZY-0001与Bcl-2、Bcl-xL和Mcl-1蛋白亲和力测试结果如下表所示。
结果表明，小分子化合物ZZY-0001与Bcl-2、Bcl-xL和Mcl-1蛋白具有广谱结合能力，其中对于Bcl-2和Bcl-xL蛋白亲和力与阳性对照药物ABT-737、ABT-263相当，显著优于阳性对照药物AT-101，对于Mcl-1蛋白的亲和力显著优于ABT-737、ABT-263，略优于AT-101。因此小分子化合物ZZY-0001具有制备与Bcl-2蛋白家族抗细胞凋亡成员Bcl-2、Bcl-xL和Mcl-1蛋白高表达相关的疾病的治疗药物，以及制备增效剂与其它抗肿瘤药物或放射治疗合用以治疗肿瘤的潜在用途。
实施例2：人体肿瘤细胞系的Bcl-2、Bcl-xL和Mcl-1三种蛋白表达量检测
实验方法：参考相关文献(J.Med.Chem.，2007，50(8)，1723-1726)，以正常人脐静脉内皮细胞系HUVEC作为对照，以GAPDH作为内标，采用DC试剂盒(BIO-RAD公司)对不同肿瘤细胞系进行Western-blot来检测其蛋白Bcl-2、Bcl-xL和Mcl-1蛋白表达量。
实验结果：以往研究表明不同肿瘤种类的Bcl-2蛋白家族抗细胞凋亡成员表达情况有差异，同种肿瘤不同类型表达情况也有差异。本研究发现与正常人脐静脉内皮细胞系HUVEC相比，人非小细胞肺癌A549、人乳腺癌MDA-MB-435、人白血病HL-60、人宫颈癌HELA和人结肠癌HCT116细胞系的Bcl-2、Bcl-xL和Mcl-1三种蛋白不同程度高表达，Western-blot检测结果如图1所示。
实施例3：小分子化合物ZZY-0001对于人体肿瘤细胞的体外增殖抑制作用
实验方法：根据实验检测和相关文献(Bioorg Med Chem Lett 2012，22，39-44；Nature.2005，437，677-681)，以ABT-737和AT-101作为对照药，用MTT法来检测所有目标化合物抑制肿瘤细胞增殖的活性。将肿瘤细胞分入96孔板中，加入不同浓度的目标化合物，用含血清的培养基培养4天。之后加入MTT，在37℃下培养4小时后用酶标仪检测溶液的吸收度，通过与空白对照比较来评价其细胞增殖抑制情况。
实验结果：小分子化合物ZZY-0001对不同人肿瘤细胞系的抑制活性如下表所示。
实验结果表明，小分子化合物ZZY-0001对于多种表达Mcl-1蛋白的人体肿瘤细胞具有抑制活性。而在Mcl-1表蛋白达量较高的A549和HL-60肿瘤细胞上，活性明显优于阳性对照药物ABT-263，而与另一个对于Bcl-xL、Bcl-2蛋白和Mcl-1蛋白具有广谱作用的阳性药物AT-101活性相当。这些结果都表明小分子化合物ZZY-0001与Mcl-1蛋白的结合可能是其发挥抗肿瘤作用的重要原因，因此其具有制备Bcl-2蛋白家族抗细胞凋亡成员Mcl-1蛋白高表达的肿瘤的治疗药物中的潜在用途。
Claims (6)
1.如式I所示化合物在制备与Bcl-2蛋白家族抗细胞凋亡成员Mcl-1蛋白高表达相关的疾病的治疗药物中的用途。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的疾病为肿瘤。
3.如权利要求2所述的肿瘤选自人非小细胞肺癌、乳腺癌、白血病、宫颈癌和结肠癌。
4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的药物含有药学上可接受的载体。
5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的药物剂型是片剂、胶囊、粉末剂、颗粒剂、混悬剂或注射剂。
6.如权利要求1中式I所示化合物在制备增效剂中的用途，所述增效剂与其它抗肿瘤药物或放射治疗合用以治疗肿瘤。
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Non-Patent Citations (1)
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| CHEOL-MIN PARK,ET AL.: "Discovery of an Orally Bioavailable Small Molecule Inhibitor of Prosurvival B-Cell Lymphoma 2 Proteins", 《 J. MED. CHEM.》, vol. 51, no. 21, 31 December 2008 (2008-12-31), pages 6902 - 6915 * |
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