CN103030831B - 胶原止血或抗凝材料 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种具有局部止血或抗凝血功能的胶原材料，通过对胶原肽链上特定的氨基酸极性基团如羧基或氨基进行反应，改变其电性，从而设计出具有促进凝血的局部止血材料或防止凝血的抗凝血材料；本发明所提供的胶原材料可进行植入，起到局部止血或抗凝血作用，并可供受损部位周围的细胞进入其中生长，促进受损组织愈合，本发明方法简单、易行，特别适合工业上批量生产，同时也非常经济。

Description

胶原止血或抗凝材料

技术领域

本发明涉及一种胶原材料及其制备方法，特别涉及一种具有局部止血或抗凝血功能的胶原材料及其制备方法。

背景技术

胶原是许多脊椎动物和无脊椎物动体内含量最为丰富的蛋白质，属于结构蛋白质，是皮肤，骨，软骨、血管和牙齿的主要纤维成分，存在于所有的器官中。目前已确认的胶原有28种，包括从Ⅰ型到ⅩⅩⅧ型。其中Ⅰ型胶原在动物体内含量最多并且其免疫原性比其他型胶原要低得多，因而被运用的也最为广泛。胶原基本结构为由三条α多肽链组成，每一条α链自身为左手螺旋构型，三条α链相互缠绕在一起形成右手超螺旋结构。每一条α链是由多个α-氨基酸脱水缩合形成肽键（-NH-CO-）连接而成，通常的肽链段氨基酸呈（Gly-X-Y）周期性排列，每条肽链约有1000个氨基酸残基。已知自然界中共有30多种氨基酸，其中α-氨基酸有20种，只有α-氨基酸才能构成天然蛋白质，而天然胶原中基本都含有大部分α-氨基酸。α-氨基酸结构上差别取决于侧链基团R，根据R基团的极性或化学结构可将α-氨基酸分类为：1、非极性氨基酸（也可称疏水氨基酸）8种：丙氨酸（Ala）、缬氨酸（Val）、亮氨酸（Leu）、异亮氨酸（Ile）、脯氨酸（Pro）、苯丙氨酸（Phe）、色氨酸（Trp）、蛋氨酸（Met）；2、极性氨基酸（也可称亲水氨基酸）又分为：1）极性不带电荷的氨基酸7种：甘氨酸（Gly）、丝氨酸（Ser）、苏氨酸（Thr）、半胱氨酸（Cys）、酪氨酸（Tyr）、天冬酰胺（Asn）、谷氨酰胺（Gln）；2）极性带正电荷的氨基酸（也可称碱性氨基酸）3种：赖氨酸（Lys）、精氨酸（Arg）、组氨酸（His）；3）极性带负电荷的氨基酸（也可称酸性氨基酸）2种：天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）。胶原中所含有的极性氨基酸中，赖氨酸含量约为3%，天冬氨酸和谷氨酸总含量约为13%，精氨酸和组氨酸含量很少，且极性氨基酸残基较为活泼，容易参加各种化学反应。氨基酸的组成和排布序列决定了肽链的初级结构，从而导致大分子形态差异，进而造成各型胶原结构差异，最终造成生物学性能差异。

在伤口急救以及外科手术中，创面出血与渗血是经常遇到的难题，血液的大量流失会危及生命，同时血液是天然的微生物培养基，出血或渗血都会增加感染几率，从而降低手术成功率，因此，外科止血是手术技术核心之一。单纯依靠机械性止血方法如结扎、缝合、电烙等还不够，还需配合使用止血材料的来帮助止血。临床常用的传统止血材料如止血纱布、止血纤维、止血绷带在使用中都具有局限性：止血时间较长，易与伤口粘连而不易换药，对伤口的感染和化脓无能为力。因此人们又不断开发出新型的止血材料，主要有：明胶海绵，壳聚糖，氧化纤维素，纤维蛋白胶，藻酸钙纤维，多微孔类无机材料（例如沸石），微纤维胶原等。这些新型止血材料的作用机制和使用方法不尽相同，因此止血效果也有差别。合适的止血材料能明显缩短手术时间，对创伤或术后恢复至关重要。在选择止血材料时应当多方面综合考虑，包括出血部位，术腔形态大小，不同渗/出血情况的填塞要求，不同止血材料的止血机制，与机体的相容性，患者的凝血功能和经济条件等。纤维蛋白胶类能形成纤维蛋白凝块黏附于创面，可减少创面血肿形成的机会，适用于腹膜后出血，腹腔脏器出血的止血。氧化再生纤维素类具有抑菌和防止术后粘连的作用，适用于腹腔内脏器的止血，但在神经外科的手术中应避免使用，且操作复杂，成本较高。明胶海绵在吸收血液后体积迅速膨胀，压迫周围组织，应避免在靠近神经或空间狭小的部位使用。微纤维胶原止血过程需要血小板参与，不适用于血小板缺乏症患者。

正常的止血机理主要包括三个过程：小血管的收缩，血小板的激活和凝血系统的启动。凝血又分为内源性凝血和外源性凝血两条途径，但通常在实际凝血过程中这两条途径区分并不明显。此外，由于血液中的多种组分（如血浆蛋白，红细胞上的血红蛋白等）在血液环境中呈负电性，一旦接触到带正电荷异物易发生聚集，可起到促进凝血作用。目前利用胶原制成的生物材料（例如胶原海绵）的止血机理主要是通过与血小板作用来达到止血目的，具体实现方式为：材料在与血液接触时，其表面迅速形成了蛋白吸附层，而后引起血小板在材料表面上的聚集粘附，刺激血小板释放一些亚细胞颗粒和分泌物，包括各种凝血因子，凝血因子粘附在伤口上，导致血栓形成，填塞受伤血管，达到止血目的。

新型理想的外科手术补片也希望具有局部止血功能。理想的止血材料应具备以下特点：止血迅速、无毒、无抗原性、不增加感染概率、不影响组织愈合、不易溶解但降解速度较快且可调、价格低廉。近年来随着对胶原研究的不断深入，特别是基因工程和克隆技术的飞跃发展，人们对胶原的形态结构、分布、物理性质以及生物生理功能有了更深刻的了解。胶原在医用生化材料、保健材料等方面，具有合成材料不可比拟的优越性，用各种不同方法精制得到的未变性胶原，其结构仍然保持其在动物体内时的天然结构。研究表明，胶原具有低免疫原性，可生物降解性，止血功能等作为天然生物材料的优势，并且体内易被吸收，无毒无刺激。正因胶原表现出良好的止血作用，目前已被大量应用于制备止血海绵。不过目前以胶原为原料的止血材料如胶原海绵、明胶等通常是将天然胶原制成胶溶液或胶原提取物，往往在其制备过程中破坏了天然胶原的螺旋区结构和生物活性。单纯明胶海绵或胶原蛋白海绵的韧性较差，与创面结合不紧，且无抗水肿效果。

而另一方面，胶原因其良好的生物相容性常用作组织工程支架材料，已被广泛用于修复人体受损组织，然而有些部位如血管、心脏瓣膜、心脏房室间隔等受损时，需要修复材料具有适当的抗凝血性以防止血栓发生。例如，血管修复材料，利用牛心包制成的生物心脏瓣膜就需要具有良好的血液相容性。由于血栓形成主要发生在材料表面，只要形成血栓的任何一个环节受到抑制或阻断，都可得到良好的抗凝血性，故可考虑从材料表面与血液相互调控的角度来对材料表面改性。目前常用的方法有：1、对材料表面接枝改性，减少材料与血液成分的相互作用，阻抗血浆蛋白吸附；2、使材料表面带有负电荷，因血液多种组分在血液环境中呈负电性，利用静电排斥作用阻碍血浆蛋白等物质吸附；3、材料表面生物化，将具有抗凝血功能的生物活性物质负载到材料表面；4、材料表面内皮化，在材料表面培养内皮细胞使其最终生长出一层内皮。

大量对生物材料抗凝血作用的研究表明，表面带负电荷的材料具有较好的抗凝血作用。此外，有研究表明未破坏天然螺旋区结构的胶原比已破坏的胶原对细胞有吸附和促进细胞生长作用。因此，本发明寻求保留天然胶原原有的螺旋区结构的基础上，通过对胶原纤维上特定的基团进行反应，改变其电性，从而设计出具有止血功能或抗凝血功能的胶原材料以满足不同需求。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的具有局部止血或抗凝血功能的胶原材料，通过对胶原肽链上特定的氨基酸极性基团如羧基或氨基进行反应，改变其电性，从而设计出具有促进凝血的局部止血材料或防止凝血的抗凝血材料。本发明所提供的胶原材料可进行植入，起到局部止血或抗凝血作用，并可供受损部位周围的细胞进入其中生长，促进受损组织愈合。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种制备具有局部止血或抗凝血功能的胶原材料的方法，包括以下步骤：

1、通过直接与胶原中极性带正电荷的氨基酸发生化学反应，从而减少材料的正电荷，使材料带负电。

2、通过直接与胶原中极性带负电荷的氨基酸发生化学反应，从而减少材料的负电荷，使材料带正电。

3、在弱酸性至弱碱性条件下（pH6.0-8.0）和醛类参与下，或者在碱性条件下和环氧化合物A参与下，通过往胶原肽链中碱性氨基酸的氨基引入极性带电氨基酸基团，使材料带负电；这里的环氧化合物A至少带有2个或2个以上的环氧基；极性带电氨基酸基团可以带正电，也可以带负电。环氧基开环后分别与胶原肽链中碱性氨基酸的氨基以及引入的极性带电氨基酸的氨基发生反应，将极性氨基酸接入胶原基材。

4、在环氧化合物参与和碱性催化剂作用下，通过往胶原肽链上酸性氨基酸的羧基引入极性带正电氨基酸基团，使材料带正电；这里的碱性催化剂可以是吡啶，异喹啉等化合物，浓度范围为0.1%-10%(v/v)。环氧化合物中的环氧基开环后在催化剂作用下与胶原肽链中酸性氨基酸的羧基与引入的极性带电氨基酸的羧基发生反应，将极性氨基酸接入胶原基材。

5、通过活化胶原中极性带负电荷的氨基酸上的羧基，促使其与溶液中加入的游离氨基发生缩合反应，减少胶原基材上的负电荷，从而使材料带正电；这里的活化物可以是碳亚二胺类化合物，浓度范围为0.1%-5%（w/v），加入的游离氨基可以是极性氨基酸。

6、按以上1-5中任选一种方案处理后，再对材料表面进行短时间化学处理，使材料表面电性与内部电性不同。这里的化学处理，主要是对1-5中反应形成的酯键进行破坏，使其水解成-COO^-，时间范围为5-30分钟。

较佳的，所述步骤1中所述化学反应为醛类或环氧类化合物与胶原中赖氨酸上的ε-氨基反应；优选所述醛类为戊二醛，更优选戊二醛体积浓度为0.1%-2%；优选所述环氧类化合物为乙二醇二缩水甘油醚和/或聚环氧丙烷。

较佳的，所述步骤1具体为：在pH6.0-8.0条件下，将胶原与戊二醛（体积浓度0.1%-2%）进行反应，反应过程如图2所示，反应时间范围为30分钟到

14天；制成的胶原基材在溶液中带负电荷，具有抗凝血特性；例如，将牛心包置于加有pH7.4的PBS缓冲液的0.6%（v/v）戊二醛溶液中3天。或者在碱性条件下（pH8.0-10.5），将胶原与环氧化合物进行反应，环氧化合物中的环氧基与赖氨酸的ε-氨基发生反应，反应过程如图3所示，反应时间范围为1小时到14天；反应完成后，胶原基材在溶液中带负电荷，具有抗凝血特性；例如，将牛心包置于加有碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液的乙二醇二缩水甘油醚溶液中9天。

较佳的，步骤2中所述化学反应为乙二醇二缩水甘油醚在碱性催化剂作用下与胶原中极性带负电荷的氨基酸上的羧基发生反应；胶原与乙二醇二缩水甘油醚用量比例为1g胶原加入50mL，碱性催化剂为吡啶或异喹啉，浓度范围为0.1%-10%（v/v）。

较佳的，步骤2具体为：在0.5%（v/v）吡啶催化作用下，将胶原如牛心包与2%（v/v）乙二醇二缩水甘油醚按1g：50mL的比例进行反应。反应时间为1小时到14天。反应完成后，胶原基材在溶液中带正电荷，具有促进凝血的特性。

较佳的，步骤3中所述环氧化合物A为乙二醇二缩水甘油醚和/或聚环氧丙烷，所述极性带电氨基酸基团为赖氨酸、天冬氨酸和/或谷氨酸。

较佳的，所述步骤3具体为：在弱酸性至弱碱性条件下（Ph6.0-8.0），将胶原与戊二醛（体积浓度0.1%-2%）和赖氨酸（质量浓度1%）体积比为1:1的混合溶液发生反应，此处胶原与混合溶液的用量比例为：1g胶原加混合溶液50mL，反应过程如图4所示。反应时间范围为30分钟到14天；或者在碱性条件下pH8.0-10.5，将胶原与乙二醇二缩水甘油醚：赖氨酸的质量比为1:1的混合溶液进行反应，乙二醇二缩水甘油醚中的两个环氧基分别与胶原肽链中赖氨酸的ε-氨基和溶液中赖氨酸的ε-氨基发生反应，将溶液中的赖氨酸接入胶原基材，反应时间范围为1小时到14天。反应过程如图4所示。反应完成后，胶原基材在溶液中带负电荷，具有抗凝血特性。

较佳的，步骤4中所述极性带正电氨基酸基团为赖氨酸，所述环氧类化合物为乙二醇二缩水甘油醚和/或聚环氧丙烷。

较佳的，步骤4具体为：在0.5%（v/v）吡啶催化作用下，将胶原如牛心包浸入赖氨酸与乙二醇二缩水甘油醚比例为1:2(w/w)的混合溶液中进行反应，反应过程如图4所示。反应时间为1小时到14天。反应完成后，胶原基材在溶液中带正电荷，具有促进凝血的特性。

较佳的，步骤5中所述极性氨基酸为赖氨酸。

较佳的，步骤5具体为：在酸性条件下（pH4.0-6.5），将胶原与EDC（碳化二亚胺）和NHS（N-羟基琥珀酰亚胺）的混合液（EDC：NHS质量比为5:1）发生反应，碳化二亚胺中的-N=C=N-基团与天冬氨酸和谷氨酸上的-COOH发生反应，形成不稳定的O-异酰基脲结构，NHS使其形成稳定的酯基，再与溶液中的游离氨基反应。反应过程如图5所示。反应完成后，整个胶原基材在溶液中带正电荷，具有止血特性。例如，将小牛皮置于含有1%(w/w)赖氨酸、pH为5.5-6.7的MES缓冲液、碳化二亚胺：NHS比例为5:1（w/w）的溶液中1-3小时，碳化二亚胺浓度为1%(w/v)。

较佳的，步骤6具体为：在0.5%（v/v）吡啶催化作用下，将胶原如牛心包浸入赖氨酸与乙二醇二缩水甘油醚比例为1:2（w/w）的混合溶液中进行反应14天，然后置于弱酸性条件下（pH5.5-6.5）5-10分钟，使胶原基材上靠近接入的赖氨酸基团的酯键发生水解，使胶原基材表面恢复中性或略呈负电性，而基材内部依然带正电。

本发明所述胶原为：动物组织胶原，如牛心包，小牛皮。

本发明的有益效果在于：（1）未破坏天然胶原螺旋区结构，保留其生物活性，相较现有的胶原止血海绵，更有利于组织吸附和进入生长；（2）通过改变胶原基材电性，可使其具有促进凝血或者抗凝血作用，满足不同需求。

附图说明

图1中，a为Lys结构式，b为Asp结构式，c为Glu结构式；

图2为碱性催化剂作用下，胶原中天冬氨酸上的羧基与环氧化合物发生反应的过程；

图3为胶原中赖氨酸上的ε-氨基与戊二醛发生反应的过程；

图4为碱性条件下，胶原中赖氨酸上的ε-氨基与环氧化合物发生反应的过程；

图5为弱酸性至弱碱性条件下，戊二醛与胶原中赖氨酸上的ε-氨基以及溶液中赖氨酸上的氨基发生反应的过程；

图6为碱性条件下，环氧化合物与胶原中赖氨酸上的ε-氨基以及溶液中赖氨酸上的氨基发生反应的过程；

图7为碱性催化剂作用下，胶原中天冬氨酸上的羧基与环氧化合物以及加入的赖氨酸发生反应的过程；

图8为胶原中天冬氨酸上的羧基与碳化二亚胺/NHS溶液发生反应的过程。

具体实施方式

1、在弱酸性至弱碱性条件下（pH6.0-8.0），将胶原与戊二醛（体积浓度0.1%-2%）发生反应，此处胶原与戊二醛的用量比例为：1g胶原加1%（v/v）戊二醛50mL，反应过程如图2所示。反应时间范围为30分钟到14天。制成的胶原基材在溶液中带负电荷，具有抗凝血特性。例如，将牛心包置于加有pH7.4的PBS缓冲液的0.6%（v/v）戊二醛溶液中3天。或者在碱性条件下（pH8.0-10.5），按1g胶原加2%（v/v）乙二醇二缩水甘油醚50mL的比例将胶原与乙二醇二缩水甘油醚进行反应，乙二醇二缩水甘油醚中的环氧基与赖氨酸的ε-氨基发生反应，反应过程如图3所示。反应时间范围为1小时到14天。反应完成后，胶原基材在溶液中带负电荷，具有抗凝血特性。例如，将牛心包置于加有pH8.0-10.5的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液的乙二醇二缩水甘油醚溶液中9天,此处，碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液为0.04mol/L，乙二醇二缩水甘油醚含量0.02%（v/v）。以上两种方法所得材料各取1cm²置于5mL加有柠檬酸钠的血浆中，再滴几滴1mol/L的CaCl₂溶液，均于8-9分钟即开始出现凝血反应，正常凝血则需5-6分钟。

2、在0.5%（v/v）吡啶催化作用下，将牛心包与2%（v/v）乙二醇二缩水甘油醚按1g：50mL的比例进行反应。反应时间为1小时到14天。反应完成后，胶原基材在溶液中带正电荷，具有促进凝血的特性，所得材料取1cm²置于5mL加有柠檬酸钠的血浆中，再滴几滴1mol/L的CaCl₂溶液，3-4分钟即开始出现凝血反应，正常凝血则需5-6分钟。

3、在弱酸性至弱碱性条件下（pH6.0-8.0），将胶原与戊二醛（体积浓度0.1%-2%）和赖氨酸（质量浓度1%）体积比为1:1的混合溶液发生反应，此处胶原与混合溶液的用量比例为：1g胶原加混合溶液50mL，反应过程如图4所示。反应时间范围为30分钟到14天；或者在碱性条件下如pH8.0-10.5的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液的乙二醇二缩水甘油醚，此处，碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液为0.04mol/L，乙二醇二缩水甘油醚含量0.02%（v/v），将胶原与乙二醇二缩水甘油醚：赖氨酸为1:1（w/w）的混合溶液进行反应，乙二醇二缩水甘油醚中的两个环氧基分别与胶原肽链中赖氨酸的ε-氨基和溶液中赖氨酸的ε-氨基发生反应，将溶液中的赖氨酸接入胶原基材，反应时间范围为1小时到14天。反应过程如图5所示。反应完成后，胶原基材在溶液中带负电荷，所得材料取1cm²置于5mL加有柠檬酸钠的血浆中，再滴几滴1mol/L的CaCl₂溶液，8-10分钟后才开始出现凝血反应，正常凝血则需5-6分钟。

4、在0.5%（v/v）吡啶催化作用下，将牛心包浸入赖氨酸与乙二醇二缩水甘油醚比例为1:2（w/w）的混合溶液中进行反应，反应过程如图6所示。反应时间为1小时到14天。反应完成后，胶原基材在溶液中带正电荷，具有促进凝血的特性，所得材料取1cm²置于5mL加有柠檬酸钠的血浆中，再滴几滴1mol/L的CaCl₂溶液，3-4分钟即开始出现凝血反应，正常凝血则需5-6分钟。

5、在酸性条件下（pH4.0-6.5），将胶原与EDC（碳化二亚胺）和NHS（N-羟基琥珀酰亚胺）的混合液发生反应，碳化二亚胺中的-N=C=N-基团与天冬氨酸和谷氨酸上的-COOH发生反应，形成不稳定的O-异酰基脲结构，NHS使其形成稳定的酯基，再与溶液中的游离氨基反应。反应过程如图7所示。反应完成后，整个胶原基材在溶液中带正电荷，具有止血特性。例如，将小牛皮置于含有1%(w/w)赖氨酸、pH为5.5-6.7的MES缓冲液、碳化二亚胺：NHS比例为5:1（w/w）的溶液中1-3小时，碳化二亚胺浓度为1%（w/w）。所得材料取1cm²置于5mL加有柠檬酸钠的血浆中，再滴几滴1mol/L的CaCl₂溶液，2-3分钟即开始出现凝血反应，正常凝血则需5-6分钟。

6、在0.5%吡啶（v/v）催化作用下，将牛心包浸入赖氨酸与乙二醇二缩水甘油醚比例为1:2（w/w）的混合溶液中进行反应14天，然后置于pH为5.5-6.5的MES缓冲液5-10分钟，使胶原基材上靠近接入的赖氨酸基团的酯键发生水解，使胶原基材表面恢复中性或略呈负电性，而基材内部依然带正电。所得材料取1cm²置于5mL加有柠檬酸钠的血浆中，再滴几滴1mol/L的CaCl₂溶液，将凝血反应后的产品做病理切片，观察得血块集中在胶原内部。

Claims (8)

1.一种制备具有止血或抗凝血功能的胶原材料的方法，包括以下步骤：

（A）通过直接与胶原中极性带正电荷的氨基酸发生化学反应，从而减少材料的正电荷，使材料带负电，其中所述化学反应为醛类或环氧类化合物与胶原中赖氨酸上的ε-氨基反应，所述醛类为体积浓度为0.1%-0.6%的戊二醛，所述环氧类化合物为乙二醇二缩水甘油醚和/或聚环氧丙烷；在pH6.0-8.0条件下，将胶原与戊二醛进行反应；或

（B）在pH6.0-8.0弱酸性至弱碱性条件下和醛类参与下，或者在碱性条件下和环氧化合物A参与下，通过往胶原肽链中碱性氨基酸的氨基引入极性带电氨基酸基团，使材料带负电，所述环氧化合物A至少带有2个环氧基，所述极性带电氨基酸基团带正电或带负电；或

（C）通过直接与胶原中极性带负电荷的氨基酸发生化学反应，从而减少材料的负电荷，使材料带正电；或

（D）在环氧化合物参与和碱性催化剂作用下，通过往胶原肽链上酸性氨基酸的羧基引入极性带正电氨基酸基团，使材料带正电；环氧化合物中的环氧基开环后在催化剂作用下与胶原肽链中酸性氨基酸的羧基与引入的极性带电氨基酸的羧基发生反应，将极性氨基酸接入胶原基材；或

（E）通过使用活化物活化胶原中极性带负电荷的氨基酸上的羧基，促使其与溶液中加入的游离氨基发生缩合反应，减少胶原基材上的负电荷，从而使材料带正电；

（F）以上（A）-（E）中任选一种方案处理后，再对材料表面进行短时间化学处理，使材料表面电性与内部电性不同，所述化学处理，主要是对（A）-（E）中反应形成的酯键进行破坏，使其水解成-COO-，时间范围为5-30分钟。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述（B）中所述环氧化合物A为乙二醇二缩水甘油醚和/或聚环氧丙烷，所述极性带电氨基酸基团为赖氨酸、天冬氨酸和/或谷氨酸。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述（D）中所述极性带正电氨基酸基团为赖氨酸，所述环氧类化合物为乙二醇二缩水甘油醚和/或聚环氧丙烷，所述碱性催化剂是浓度范围为0.1%-10%(w/v)的吡啶和/或异喹啉。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述（E）中所述活化物是浓度范围为0.1%-5%(w/v)的碳亚二胺类化合物，所述加入的游离氨基是极性氨基酸。

5.根据权利要求1所述的方法，其中（A）具体为：反应时间范围为30分钟到14天，制成的胶原基材在溶液中带负电荷，具有抗凝血特性；或者在pH8.0-10.5碱性条件下，将胶原与环氧化合物进行反应，反应时间范围为1小时到14天；反应完成后，胶原基材在溶液中带负电荷，具有抗凝血特性。

6.根据权利要求2所述的方法，其中（B）具体为：碱性条件下pH8.0-10.5，将胶原与乙二醇二缩水甘油醚：赖氨酸的质量比为1:1的混合溶液进行反应，反应时间范围为1小时到14天，反应完成后，胶原基材在溶液中带负电荷，具有抗凝血特性。

7.根据权利要求3所述的方法，其中（D）具体为：在0.5%（v/v）吡啶催化作用下，将胶原浸入赖氨酸与乙二醇二缩水甘油醚比例为1:2（w/w）的混合溶液中进行反应，反应时间为1小时到14天，反应完成后，胶原基材在溶液中带正电荷，具有促进凝血的特性。

8.根据权利要求4所述的方法，其中（E）具体为：在酸性条件下pH4.0-6.5，将胶原与EDC和NHS的混合液发生反应，EDC：NHS质量比为5:1，反应完成后，整个胶原基材在溶液中带正电荷，具有止血特性。

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