CN103004761A - 一种薇甘菊正丁醇提取物及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种薇甘菊正丁醇提取物，它含有阿魏酸的重量百分含量为：阿魏酸4-10%，绿原酸4-10%。本发明还提供了该正丁醇提取物的制备方法和用途。本发明还提供了一种除草剂。本发明从天然植物薇甘菊中分离得到正丁醇提取物，其对杂草有较强的抑制活性，并从中分离得到2个抑制活性较强的活性成分阿魏酸+绿原酸，用于控制正丁醇提取物的质量。将薇甘菊正丁醇提取物采用现代工艺制成除草剂，对常见农田杂草有较好的抑制作用，代替现有的化学除草剂，在农药安全性方面有较大提升；这样既能消除薇甘菊的危害，又为农药研究开辟了新的资源，不论从经济效益还是社会效益上，都具有十分重要的意义。

Description

一种薇甘菊正丁醇提取物及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及一种薇甘菊正丁醇提取物，属农药领域。

背景技术

水稻是重要粮食作物，中国是世界是水稻生产大国之一。亚洲水稻种植面积及总产量远超过其他各洲。其中印度水稻种植面积居第一位，中国居第二位。水稻栽培方式多种多样，主要分为直播与插秧。最近十余年来，中国水稻栽培方式变化较大，直播面积显著增加，特别是长江中下游地区尤为明显，传统手插秧被机械插秧及直播取代。由于水稻栽培方式的变化，对除草剂品种的要求也与以前显著不同。插秧栽培对除草剂品种的要求不太严格，即或是选择性比较差的品种也可依靠位差与时差选择性而应用，而直播栽培则对除草剂品种的选择性要求比较严格，如敌稗、快杀稗、五氟磺草胺、氰氟草胺以及苄嘧磺隆、乙氧嘧磺隆、吡嘧磺隆等磺酰脲类除草剂品种对水稻具有高度选择性，故可顺利用于直播栽培。目前，化学除草剂的应用是杂草防治中的重要措施，它为减少农作物生产中的损失，提高产量做出了重要贡献。但是由于化学除草剂的大面积应用，出现了杂草再猖獗、杂草的抗药性提高和除草剂对人畜健康和环境的污染三大问题，即“3R”问题。具有高效、快速、方便和经济特点而又能避免以上三大问题的出现的新型农药将是研究开发的重要方向。根据植物协同进化的观点，在异源植物次生化合物中寻找植物除草剂，保护作物免受杂草的侵袭，是解决化学防治出现的上述三大问题的新途径。在大力提倡“绿色农药”，加强环境保护，贯彻执行“有害生物综合防治”和发展持续农业的今天，积极研究和开发植物源农药有着重要意义。因此，从薇甘菊中寻找具有忌避、拒食和生长发育抑制作用生物活性的化合物，指导合成无公害农药以及纯化薇甘菊中的生长抑制物质，研究其结构，并进一步将其开发为除草剂，既消除了薇甘菊的危害，又为农药研究开辟了新的资源，不论从经济效益还是社会效益上，都具有十分重要的意义。

薇甘菊（（学名：Mikania micrantha），也称小花蔓泽兰或小花假泽兰。原产于中美洲，现已广泛传播到亚洲热带地区，如印度、马来西亚、泰国、印度尼西亚、尼泊尔、菲律宾，以及巴布亚新几内亚、所罗门、印度洋圣诞岛和太平洋上的一些岛屿包括斐济、西萨摩亚、澳大利亚北昆士兰地区，成为当今世界热带、亚热带地区危害最严重的杂草之一。大约在1919年薇甘菊作为杂草在中国香港出现，1984年在深圳发现，2008年来已广泛分布在珠江三角洲地区。该种已列入世界上最有害的100种外来入侵物种之一。也列入中国首批外来入侵物种。

目前关于薇甘菊的报道，多集中在如何危害和防治上，对薇甘菊的化感作用，也有相关报道，如：邵华，等，薇甘菊的化感作用研究，广西林业科学，2003年6月第32卷第2期，研究薇甘菊对萝卜、黑麦草、白三叶以及薇甘菊常见伴生树种马占相思、马尾松、大叶桉的生化他感作用。分别用薇甘菊地上部分、根部、枯枝叶和土壤的水提液以及地上部分的石油醚、乙酸乙酯和乙醇提取液按照一定浓度进行生物测定。研究表明,薇甘菊地上部分水提液能够显著影响受体植物生长,根水提液的抑制作用程度稍低,其枯枝叶水提液基本无作用。薇甘菊地上部分的石油醚和乙醇提取物均对受体植物幼苗生长表现出一定的抑制作用,但是乙酸乙酯提取物的作用最强烈,可使种子发芽过程受阻,幼苗生长受抑制程度高达90%以上,显示化感物质主要集中在这一部分。综合利用薇甘菊还没有相关文献报道。

发明内容

本发明的技术方案是提供了一种薇甘菊正丁醇提取物。本发明的另一技术方案是提供了该提取物的制备方法和用途。

本发明提供了一种薇甘菊正丁醇提取物，它含有阿魏酸的重量百分含量为：阿魏酸4-10%，绿原酸4-10%。

它来源于薇甘菊Mikania micrantha的茎叶提取物。

本发明正丁醇提取物是由薇甘菊95%的乙醇提取物，加入正丁醇提取，得正丁醇提取物。

本发明正丁醇提取物是由薇甘菊95%的乙醇提取物，依次分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇提取，收取正丁醇部位，得正丁醇提取物。

本发明还提供了一种制备所述的薇甘菊正丁醇提取物的方法，它包括如下步骤：

a、取干燥薇甘菊，粉碎成粗粉；

b、加入95%乙醇回流提取，提取液回收乙醇，得浸膏；

c、将浸膏用正丁醇浸提，减压回收正丁醇，并减压干燥成干浸膏，得薇甘菊正丁醇提取物。

本发明还提供了所述的薇甘菊正丁醇提取物在制备除草剂中的用途。

其中，所述的除草剂为稻田除草剂。

本发明还提供了一种除草剂，它包含所述的薇甘菊正丁醇提取物为有效成分。

它由所述的薇甘菊正丁醇提取物为有效成分，加入其它辅助性成分制备成的液体制剂。

本发明从天然植物薇甘菊中分离得到正丁醇提取物，其对杂草有较强的抑制活性，并从中分离得到2个抑制活性较强的活性成分阿魏酸+绿原酸，用于控制正丁醇提取物的质量。将薇甘菊正丁醇提取物采用现代工艺制成除草剂，对常见农田杂草有较好的抑制作用。该发明可以提供一种天然除草剂，代替现有的化学除草剂，在农药安全性方面有较大提升；这样既能消除薇甘菊的危害，又为农药研究开辟了新的资源，不论从经济效益还是社会效益上，都具有十分重要的意义。

附图说明

图1本发明薇甘菊化感活性成分的分离流程

具体实施方式

实施例1本发明薇甘菊天然除草剂的制备工艺

处方：

制法：

取干薇甘菊，粉碎成粗粉，加8倍量95%乙醇回流提取2次，每次1小时，合并乙醇液，减压回收乙醇，所得浸膏用正丁醇浸提3次，每次200ml，合并正丁醇液，减压回收完正丁醇，减压干燥成干浸膏，即得正丁醇提取物。

取上述正丁醇提取物，研细后，加入吐温80，搅拌均匀，并在不断搅拌的情况下，加纯化水至1000ml，继续搅拌至混合均匀，滤过，即得。

使用方法：

使用前，将上述除草剂用纯化水稀释200倍，搅匀，装入喷雾器，喷于杂草表面即可。

质量控制方法：

其有效成分的测定方法如下（高效液相色谱法）：

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.4%磷酸溶液（20:80）为流动相；检测波长为327nm。理论板数按绿原酸峰计应不低于1000。

对照品溶液的制备：取绿原酸、阿魏酸对照品适量，精密称定，置棕色瓶中，加50%甲醇制成每1ml含40μg的溶液，即得。（10℃以下保存）。

供试品溶液的制备：取正丁醇干浸膏粉末约0.1g，精密称定，置棕色瓶中，加50%甲醇100ml，称定重量，超声处理30分钟，冷却，再称定重量，加50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

测定法：取上述溶液各10μl，注入液相色谱液，测定，即得。

本品按干燥品计，含绿原酸（C₁₆H₁₈O₉）不得少于4%，含阿魏酸（C₁₀H₁₀O₄）不得少于4%。

实施例2本发明薇甘菊中化合物提取分离方法

薇甘菊茎叶干粉6千克，在自制的索氏提取器中用95%乙醇回流提取4次,每次5d。过滤，合并浸提液，减压浓缩得浸膏830克。将浸膏拌少量硅胶，依次分别用2000mL石油醚、乙酸乙酯、正丁醇各浸泡3次，每次2小时。抽滤，各个部分滤液合并，正丁醇部分进行生测。结果表明，正丁醇部分滤液对受体（水稻和稗草）幼苗生长具有强烈的抑制作用。浓缩正丁醇部分滤液，得到浸膏102克，将浸膏进行硅胶柱层析(乙酸乙酯/甲醇为淋洗剂)得到A₁、A₂、A₃、A₄、A₅、A₆、A₇共7个组分,分别再次进行生物活性测定，取其中对受体抑制作用最强的两组分(A₃和A₆)进一步柱层析,乙酸乙酯-甲醇为淋洗剂，梯度洗脱，洗脱部分再进行生物活性测定，取对受体植物抑制作用最强的组分再次分别进行柱层析，直至获得单体化合物，其分离步骤见图1。

薇甘菊乙醇提取物正丁醇部分化感物质的结构鉴定

化合物Ⅰ：152mg，淡黄色针状晶体，m.p.170-172℃。IR（KBr）cm^-1：3476，3316，2970，2844，1691，1624，1602，1516，1466，1376，1308，1284，1250，1192，1045，976。EI-MS（m/z）：194（M⁺），179（M⁺-CH₃），177（M⁺-OH），161（M⁺-CH₃-H₂O），150（M⁺-CO₂），145，133（M⁺-CH₃-H₂O-CO），117，105（133-CO），89，77（105-CO），51（77-C₂H₂），39。¹HNMR（CD₃COCD₃）：δ：3.92（3H，s，3-OCH₃），4.96（1H，s，4-OH），6.38（1H，d，J=15.98Hz，9-H），6.86（1H，d，J=8.44Hz，5-H），7.09（1H，d，J=8.44Hz，6’-H），7.23（1H，s，J=8.68Hz，2-H），7.65（1H，d，J=15.44Hz，10-H）。¹³CNMR（CD₃COCD₃）：δ：126.8(C-1)，110.9(C-2)，148.5(C-3)，149.9(C-4)，116.1(C-5)，123.2(C-6)，145.9(C-7)，115.3(C-8)，169.7(-COOH)。结合熔点、红外、质谱、核磁碳谱和氢谱综合分析，并与波谱学数据对照，确定化合物Ⅰ为阿魏酸。

化合物Ⅱ：123mg，淡黄色粉末，m.p.205-207℃，溴酚蓝反应为阳性，FeCl₃反应为阳性，提示可能为酚酸类物质。IR（KBr）cm^-1：3342(OH)，3500～2500(COOH)，2924(CH)，1680(C=O)，1633，1596，1524(Ar)。EIMS（m/z）：354（M⁺），180（咖啡酸），163（咖啡酰基），136。¹HNMR（DMSO-d₆）：δ：3.61（1H，brs，H-2），4.04（1H，brs，H-5），5.25（1H，m，H-3），6.33（1H，d，J=16.22Hz，H-8），6.89（1H，d，J=8.58Hz，5’-H），7.13（1H，dd，J=8.62Hz，6’-H），7.25（1H，d，J=2.56Hz，2’-H），7.58（1H，d，J=16.26Hz，H-7）。¹³CNMR（DMSO-d₆）：δ：38.35(C-15)，38.97(C-13)，71.53(C-12)，72.07(C-11)，73.63(C-10)，76.53(C-14)，115.45(C-6)，115.59(C-8)，116.65(C-3)，123.08(C-2)，127.96(C-1)，147.10(C-7)，147.28(C-5)，168.92(C-9)，177.54(C-16)。结合熔点、红外、质谱、核磁碳谱和氢谱综合分析，并与文献波谱学数据对照，确定化合物Ⅱ为绿原酸。

以下通过具体化感试验证明本发明的有益效果。

试验例1薇甘菊不同极性溶剂萃取部分化感作用

1材料与方法

1.1试验材料

薇甘菊地上部分采自中山市五桂山办事处大尖山,采样时为盛花期,选用健康成熟期地上部分,自然阴干，粉碎，备用。受试植物水稻种子购于广州市种子公司门市部,稗草种子采自中山市南朗镇崖口村。

1.2试剂与仪器

1.2.1试剂

95%乙醇，石油醚，乙酸乙酯，正丁醇，均为市售分析纯。

1.2.2仪器

Buchi R-210型真空旋转蒸发仪，瑞士步琪有限公司。

1.3试验方法

1.3.1提取液的制备

采集薇甘菊新鲜茎叶5kg,然后在45℃左右烘干,用植物试样粉碎机粉碎,在自制的索氏提取器中用95%乙醇回流提取4次,每次5d,提取液合并浓缩得浸膏。依次分别用1000mL石油醚、乙酸乙酯、正丁醇各浸泡3次，每次2小时。抽滤，各个部分滤液合并，各部分滤液分别浓缩后，再分别用对应溶剂准确定容至0.1g/ml(即100mL溶剂中含有10g植物干物质),冷藏待用。

1.3.2薇甘菊提取物对植物根长和苗长的影响试验

分别取底部直径为9cm的玻璃培养皿,垫上2层滤纸,加入2.5ml不同浓度的薇甘菊乙醇提取物各种溶剂萃取部分的稀释液,待溶剂挥干后，于玻璃培养皿中加入2.5毫升0.1%的土温-20（助溶作用）水溶液，对照组中加入等量的蒸馏水,选取刚发芽(露白)的受试植物种子30粒,均匀地放在培养皿中,26～31℃下暗培养,每个处理设3个重复。幼苗生长过程中,适当补加清水,使滤纸保持湿润。5d后分别测量幼苗的根长和苗高。

1.3.3数据分析与处理方法

利用化感作用效应指数（RI）进行活性跟踪，RI=1-C/T（当T≥C时）或RI=T/C-1（当T＜C时），其中C为对照值，T为处理值。RI＞0为促进作用，RI＜0为抑制作用，RI绝对值的大小与作用强度一致。按照文献[8]方法测定分离物质对2种受试植物的化感作用。按照下式计算幼苗的相对根长和相对庙高：

相对根长（或苗高）=处理根长（或苗高）/对照根长（或苗高）×100%

试验结果进行进行邓肯氏分析。

各处理植株数据取3个重复样的平均值,试验结果用DPSwin软件进行邓肯氏分析。

2薇甘菊乙醇提取物各种溶剂萃取部分化感作用测定结果

表1薇甘菊乙醇提取物各种溶剂萃取部分化感作用测定结果%

1）表中数据为3个重复的平均数，同种溶剂萃取部分同列数据后面字母相同者，经邓肯氏检验(p=0.05)差异不显著

3、结论

薇甘菊各极性部位的化感实验结果表明，正丁醇部位对稗草的抑制效果最好，但对水稻的正长生长影响不大，最低的抑制浓度为0.005g/ml。

试验例2薇甘菊中化合物绿原酸和阿魏酸的化感活性检测

1材料与方法

1.1试验材料

薇甘菊地上部分采自中山市五桂山办事处大尖山,采样时为盛花期,选用健康成熟期地上部分,自然阴干，粉碎，备用。受试植物水稻种子购于广州市种子公司门市部,稗草种子采自中山市南朗镇崖口村。

1.2试剂与仪器

1.2.1试剂

95%乙醇，羧甲基纤维素钠（CMC）,薄层层析硅胶（GF254），磷钼酸，柱层析硅胶（200～300目），石油醚，乙酸乙酯，正丁醇，均为市售分析纯。

1.2.2仪器

Buchi R-210型真空旋转蒸发仪，瑞士步琪有限公司；ZF-1型三用紫外分析仪，上海市宝山区顾村电光仪器厂；Brucker DRX-400核磁共振仪,TMS为内标，美国布鲁克-道尔顿公司；MFB-595显微熔点测定仪，英国Gallenkamp公司，温度计未校正；Perkin-Elmer-577型红外光谱仪（Kbr压片），美国铂金-埃尔默公司；Thermo Finnigan4510型质谱仪，美国热电公司。

1.3试验方法

1.3.1化感活性成分的分离方法：按实施例2的方法分离

1.3.2化感物质生物活性测定方法

分别取底部直径为9cm的玻璃培养皿,垫上2层滤纸,加入2.5ml含有化感物质的溶液,待溶剂挥干后，于玻璃培养皿中加入2.5毫升0.1%的土温-20（助溶作用）水溶液，对照组中加入等量的蒸馏水,选取刚发芽(露白)的受试植物种子30粒,均匀地放在培养皿中,26～31℃下暗培养,每个处理设3个重复。幼苗生长过程中,适当补加清水,使滤纸保持湿润。5d后分别测量幼苗的根长和苗高。

1.3.3数据分析与处理方法

利用化感作用效应指数（RI）进行活性跟踪，RI=1-C/T（当T≥C时）或RI=T/C-1（当T＜C时），其中C为对照值，T为处理值。RI＞0为促进作用，RI＜0为抑制作用，RI绝对值的大小与作用强度一致。按照文献[8]方法测定分离物质对2种受试植物的化感作用。按照下式计算幼苗的相对根长和相对庙高：

相对根长（或苗高）=处理根长（或苗高）/对照根长（或苗高）×100%

试验结果进行进行邓肯氏分析。

注：其中生测RI值为两种受体苗高和根长4个测试项目RI值的平均值，图中的编号顺序与柱层析时洗脱顺序一致

2结果与分析

2.1薇甘菊乙醇提取物正丁醇部分各分离组分的化感活性

薇甘菊乙醇提取物正丁醇部分各分离组分的RI值如图1所示。在第一次柱层析所得各组分A₁～A₇中，A₃和A₆的化感作用效应指数均小于-0.600，抑制作用最强，对这两个组分进一步进行柱层析，分别得到A₃₁～A₃₄和A₆₁～A₆₄，其中A₃₃和A₆₃的化感活性最强，RI值分别达到-0.584和-0.678，分别对A₃₃和A₆₃进行进一步分离，其中A₃₃组分分离得到A₃₃₂，重结晶后得到化合物Ⅰ，A₆₃组分分离得到A₆₃₃，重结晶后得到化合物Ⅱ。

2.2化合物Ⅰ和Ⅱ的化感作用

用不同浓度化合物Ⅰ处理受试植物幼苗，结果（表1）发现，在1.00、0.50和0.25mg/mL三种浓度下，化合物Ⅰ对两种受试植物的根长和苗高的抑制作用都达到了显著水平；在低浓度0.01mg/mL浓度下，对稗草两个测试项的抑制作用达到了显著水平，而对水稻苗高反而有促进作用，表现出化感作用的典型特征—低促高抑效应。

表1不同浓度的化感物Ⅰ和化感物Ⅱ的化感作用测定结果（%）

1）表中数据为3个重复的平均数，同种化合物同列数据后面字母相同者，经邓肯氏检验(p=0.05)差异不显著

用不同浓度化合物Ⅱ处理受试植物幼苗，结果（表1）发现，在1.00、0.50、0.25和0.01mg/mL四种浓度下，化合物Ⅱ对两种受试植物的根长和苗高都表现出抑制作用，其中在1.00、0.50和0.25mg/mL三种浓度下，对根长和苗高的抑制作用都达到了显著水平；其中稗草根部比苗高对化合物Ⅱ的化感作用更敏感，而水稻苗高比根部对化合物Ⅱ的化感作用更敏感。

上述试验表明，从薇甘菊正丁醇极性部份分离得到两个具有化感活性化合物——阿魏酸和绿原酸。结果表明，分离得到的两个化合物均具有较强的化感活性。且通过试验数据对比，薇甘菊正丁醇提取物在同等剂量下，优于两个分离的化合物。本发明可替代现有的化学除草剂，在农药安全性方面有较大提升，既能消除薇甘菊的危害，又为农药研究开辟了新的资源，不论从经济效益还是社会效益上，都具有十分重要的意义。

Claims (9)

1.一种薇甘菊正丁醇提取物，其特征在于：它含有阿魏酸的重量百分含量为：阿魏酸4-10%，绿原酸4-10%。

2.根据权利要求1所述的薇甘菊正丁醇提取物，其特征在于：它来源于薇甘菊Mikania micrantha的茎叶提取物。

3.根据权利要求2所述的薇甘菊正丁醇提取物，其特征在于：它是由薇甘菊95%的乙醇提取物，加入正丁醇提取，得正丁醇提取物。

4.根据权利要求2所述的薇甘菊正丁醇提取物，其特征在于：它是由薇甘菊95%的乙醇提取物，依次分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇提取，收取正丁醇部位，得正丁醇提取物。

5.一种制备权利要求1-4任意一项所述的薇甘菊正丁醇提取物的方法，它包括如下步骤：

a、取干燥薇甘菊，粉碎成粗粉；

b、加入95%乙醇回流提取，提取液回收乙醇，得浸膏；

c、将浸膏用正丁醇浸提，减压回收正丁醇，减压干燥成干浸膏，得薇甘菊正丁醇提取物。

6.权利要求1-4任意一项所述的薇甘菊正丁醇提取物在制备除草剂中的用途。

7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于：所述的除草剂为稻田除草剂。

8.一种除草剂，它包含权利要求1-4任意一项所述的薇甘菊正丁醇提取物为有效成分。

9.根据权利要求8所述了除草剂，其特征在于：它是由所述的薇甘菊正丁醇提取物为有效成分，加入其它辅助性成分制备成的液体制剂。

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