CN102985547A - 一种在解脂耶罗维亚酵母中制备多肽的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种在hp4d启动子调节下在解脂耶罗维亚酵母中制备蛋白质、优选外源蛋白质的方法。具体而言，本发明描述了一种通过调节碳的供应和/或氮的供应而调节解脂耶罗维亚酵母的生长速率的方法。发现生长速率小于0.045h″l对于增加解脂耶罗维亚酵母生物质和增加所生产的感兴趣的外源蛋白质的量而言是最优的。
Description
背景技术
本发明涉及一种在解脂耶罗维亚酵母(Yarrowia lipolytica)中制备多肽的方法。特别地，本发明涉及一种通过操控酵母的生长条件并由此操控所述酵母的生长过程，对使用hp4d启动子在解脂耶罗维亚酵母(Y.lipolytica)中表达感兴趣的多肽进行优化的方法。
解脂耶罗维亚酵母是一种用于生产柠檬酸的非常规酵母，其已被美国食品和药物管理局(American Food and Drug Administration，FDA)确定为公认安全(GRAS)状态(Fickers et al.,2005)。许多分子工具均可用于外源蛋白质在解脂耶罗维亚酵母中的表达，因为该酵母具有高的分泌能力。多拷贝带载体(Multi-copy vector)含有ura3d4标记，其在多拷贝互补中是需要的，以允许对带多个插入的转化株进行筛选(Madzak et al.,2004)。所述ura3d4筛选标记确保对带10–13个完整表达盒(integrated cassette)拷贝的转化株的筛选(Juretzek et al.,2001)。
所述hp4d启动子是用于在解脂耶罗维亚酵母中表达外源多肽的最常用的启动子(Madzak et al.,2004)。该启动子由XPR2启动子的上游激活序列1的四个串联重复拷贝组成，并且其表达不受环境条件的显著影响。但是，其调节作用是未知的，并且据报道其对蛋白质的生产是半组成型(quasi constitutive)的，且调节作用仅发生在早期生长稳定期中。
因此需要对hp4d启动子获得更多的理解，以确定该启动子是否可用于操控并最终增加蛋白质在宿主细胞中的表达。
发明内容
根据本发明，提供了一种在解脂耶罗维亚酵母中表达多肽的方法，该方法包括步骤：
使解脂耶罗维亚酵母发酵，该酵母已经多核苷酸转化，所述多核苷酸在hp4d启动子的控制下编码多肽；和
在发酵期间将解脂耶罗维亚酵母的生长速率限制为低于0.045h-1。
所述生长速率可以限制为约0.023h-1至约0.040h-1，更优选约0.035h-1至约0.039h-1。甚至更优选，所述生长速率可以限制为约0.035h-1。
所述生长速率可以通过控制加入至含解脂耶罗维亚酵母的发酵溶液中的食物源(例如碳源和/或氮源)的量进行限制。所述碳源可为葡萄糖，所述氮源可为酵母提取物。
所述多肽可为蛋白质，例如酶，如脂肪酶或甘露聚糖酶。
所述发酵可为分批发酵法、分批进料发酵法、反复分批进料发酵法或连续发酵法。
优选地，所述方法增加了多肽产量，相比于生长速率不受限制的对照组解脂耶罗维亚酵母。
在本发明的另一个实施方案中，提供了一种在上述方法中使用的转化了多核苷酸的解脂耶罗维亚酵母，所述多核苷酸在hp4d启动子的控制下编码多肽。
在本发明的又一个实施方案中，提供了一种含有用于实施上述方法的解脂耶罗维亚酵母的试剂盒(kit)。
附图说明
图1：显示了葡萄糖峰值对稳定解脂耶罗维亚酵母Po1f 413-5发酵的pO2、残余葡萄糖和生物质浓度的影响。
图2：显示了稀释速率对在稳定连续发酵中的解脂耶罗维亚酵母Po1f413-5的生物质、残余葡萄糖和酶体积活性(volumetric enzyme activity)的影响。
图3：显示了稀释速率对在稳定连续发酵中通过解脂耶罗维亚酵母Po1f413-5生产脂肪酶的响应程度的影响。生长速率如数据记录单中所给出的。
图4：显示了稀释速率对在稳定连续发酵中通过解脂耶罗维亚酵母Po1f413-5生产脂肪酶的体积速率和比速率的影响。
图5：显示了在二次分批发酵中的解脂耶罗维亚酵母Po1f 413-5的生长情况。
图6：显示了在二次分批发酵中通过解脂耶罗维亚酵母Po1f 413-5生产脂肪酶。
图7：显示了指数全培养基进料(exponential full medium feed)对解脂耶罗维亚酵母Po1f413-5的生长的影响。全培养基以0.029h-1(开符)和0.041h-1(闭符)的指数进料速率进料。
图8：显示了指数全培养基进料对通过解脂耶罗维亚酵母Po1f 413-5生产脂肪酶的影响。全培养基以0.029h-1(开符)和0.041h-1(闭符)的指数进料速率进料。
图9：显示了指数全培养基进料对通过解脂耶罗维亚酵母Po1f 413-5对生产脂肪酶的速率影响。全培养基以0.029h-1(开符)和0.041h-1(闭符)的指数进料速率进料。
图10：显示了在二次分批发酵中Y.lipolytica ManA:HmA(Roth等,2009)的生长情况。
图11：显示了指数全培养基进料对Y.lipolytica ManA:HmA的生长的影响。全培养基以0.035h-1(开符)和0.045h-1(闭符)的指数进料速率进料。
图12：显示了指数全培养基进料对通过Y lipolytica ManA:HmA生产甘露聚糖酶的影响。全培养基以0.035h-1(开符)和0.045h-1(闭符)的指数进料速率进料。
图13：显示了指数全培养基进料对通过Y lipolytica ManA:HmA生产甘露聚糖酶的速率的影响。全培养基以0.035h-1(开符)和0.045h-1(闭符)的指数进料速率进料。
具体实施方式
现将在下文参照附图对本发明进行更充分描述，其中仅说明了本发明的几个但不是所有的实施方案。
本发明公开了一种在解脂耶罗维亚酵母中表达多肽的方法，其中使解脂耶罗维亚酵母发酵，所述酵母经多核苷酸转化，所述多核苷酸在hp4d启动子的控制下编码多肽，并在发酵期间限制解脂耶罗维亚酵母的生长速率低于0.045h-1。
所述生长速率可限制为约0.023h-1至约0.040h-1，更优选约0.035h-1至约0.039h-1。例如，所述生长速率可限制为约0.023、0.024、0.027、0.029、0.035或0.039h-1。
所述生长速率可通过控制加入至发酵溶液中的碳源、氮源和/或其他源例如葡萄糖或酵母提取物的量进行限制。
所述发酵可为分批发酵法、分批进料发酵法或连续发酵法。
所述多肽可为外源或同源的多肽、蛋白质或酶。在下述实施例中，使用脂肪酶和甘露聚糖酶作为通过解脂耶罗维亚酵母表达的示例酶。
在半组成型的hp4d启动子的调节下通过解脂耶罗维亚酵母进行的酶的生产始于生长稳定期开始时。使用在葡萄糖受限制条件下的连续发酵来确定生长速率对在hp4d启动子调节下生产的脂肪酶的影响。
Lip2基因，其在解脂耶罗维亚酵母中编码细胞外的脂肪酶和来自棘孢曲霉(Aspergillus aculeatu)的内切-1,4-β-D-甘露聚糖酶(β-甘露聚糖酶)在半组成型的hp4d启动子调节下用多拷贝LIP2表达框在Y lipolytica Polf中进行过表达(MatA,Leu2-207,ura3-302,xpr2-322,axp-2)。
生产的最大脂肪酶体积活性13014nkat.ml-1是在生长速率为0.024h-1时，该速率为估算的最低生长速率。但是，脂肪酶生产的最大速率在生长速率大于0.035h-1时得到。脂肪酶生产的临界生长速率在0.035h-1和0.039h-1之间。连续发酵中脂肪酶生产的比速率28nkat.mg-1.h-1是分批发酵中脂肪酶生产的比速率7nkat.mg-1.h-1的4倍，这表明对于通过解脂耶罗维亚酵母生产酶而言连续发酵可能是一个可行的选择。利用由连续发酵得到的数据，开发了在hp4d启动子调节下通过解脂耶罗维亚酵母来生产蛋白质的分批进料法并对脂肪酶和甘露聚糖酶的生产进行了评价。
与在分批发酵中的得到的脂肪酶的最大滴定度为8374(±671)nkat.ml-1，以及在较高生长速率0.040h-1得到的脂肪酶的最大滴定度为5910(±524)nkat.ml-1相比，在发酵的分批进料阶段中生长速率为0.027h-1时得到脂肪酶的最大滴定度为22508(±4219)nkat.ml-1。通过限制解脂耶罗维亚酵母的生长速率，我们能够同时生产生物质和酶，从而增加发酵的生产率。与0.040h-1的指数生长速率期间脂肪酶体积活性生产率为133nKat.ml-1.h-1相比，在较慢的生长速率期间脂肪酶体积活性生产率为357nkat.ml-1.h-1。
与在分批发酵中甘露聚糖酶的最大滴定度为14253(±2807)nkat.ml-1，以及当培养基以0.045h-1指数进料速率进料，甘露聚糖酶的最大滴定度31 479(±1819)nkat.ml-1相比，当培养基以0.035h-1呈指数进料时得到的甘露聚糖酶的最大滴定度为40835(±2536)nkat.ml-1。指数进料法能将生物质和酶的生产相结合，从而增加发酵的生产率。与0.045h-1的指数进料速率期间和分批生产期间酶体积活性生产率分别为850nkat.ml-1.h-1和346nkat.ml-1.h-1相比，在较慢的进料速率期间酶体积活性生产率为913nkat.ml-1.h-1。该进料方法使用碳料作为例进行评价。
所述的本发明不应限制为所公开的具体实施方式，改进及其他实施方案也意欲包括在本发明范围内。
虽然本说明书中使用了特定术语，但是它们仅以宽泛意义和描述意义使用，不作为对本发明的限制。例如术语“蛋白质”应解读为包括“肽”和“多肽”，反之亦然。此外，蛋白质的定义包括“酶”。
实施例
材料和方法
微生物体的保存和接种的菌株
Y.lipolytica Po1f 413-5(MatA,Leu-2-207,ura3-302,xpr2-322,axp-2)和Y.lipolytica ManA:HmA(Roth et al.,2009)在-80°C进行冷冻保藏和储存。用于发酵的培养液通过对100ml由15g.l-1酵母提取物、8.9g.l-1麦芽提取物和6.67g.l-1葡萄糖组成的培养基在1L Erlenmeyer烧瓶中于121°C灭菌15min而制得。在灭菌之前用25%m.v-1NH4OH or 25%m.v-1H2SO4将pH调节至5.5。使用单个冷冻小瓶中的内容物接种到烧瓶中。将该烧瓶在30°C于轨道式振荡器上以180rpm培育18h。
解脂耶罗维亚酵母的连续发酵
在一个2L的连续发酵罐(BioFlo 3000,New Brunswick,USA,)——其含有1.5L改良的由20g.l-1酵母提取物和20g.l-1葡萄糖组成的CSIRman培养基，其接种了100ml的菌液。用NH4OH(25%m.v-1)或H2SO4(25%m.v-1)控制pH为pH 6.8。温度控制在28°C，在3slmp通风，并在800rpm搅拌。在每段保持时间之后取5ml试样测量钙生物质(Cal biomass)和光学密度(OD)来确定稳定期。一旦达到稳定期，其表现为在三段保留时间恒定的OD和生物质，取出一个试样，测定生物质、OD、酶活性和残余葡萄糖浓度。
分批脂肪酶发酵和分批进料脂肪酶发酵
在工作体积为2L，含有1.5L由20g.l-1酵母提取物和40g.l-1葡萄糖组成的培养基的Labfors(Infors AG-Bottmingen/Switzerland)生物反应器中进行两次分批发酵。在同一发酵罐中以1.3L由10g.l-1酵母提取物和24g.l-1葡萄糖组成的初始装料体积进行分批进料发酵。在进料桶中接种100ml菌液。用25%m.v-1NH4OH或20%m.v-1H2SO4控制pH为pH 6.8。温度控制在28°C，通风设定为1v.v-1.m-1。初始搅拌为500rpm并手动加强，来控制pO2的饱和度大于30%。进料由83.6g.l-1葡萄糖和40g.l-1酵母提取物组成。当通过Accutrend(Boehringer Mannheim)测得初始装料的葡萄糖耗尽时，开始进料。初始进料速率为1.1g.h-1并分别以0.029h-1和0.041h-1的指数速率每10秒钟增加一次。
分析
每个3小时取10g试样测定生长速率、生物质、酶产量和葡萄糖利用率。通过在660nm测定OD来测量生长，使用Accutrend(Boehringer Mannheim)测量残余葡萄糖。将3份2ml的等分试样离心并将上清液在-20°C贮存用于分析细胞外的脂肪酶活性。沉淀在110°C干燥至恒定重量来测定细胞干重量。
通过向9ml、pH 8.0的100mM磷酸盐或Tris-HCl的缓冲液中逐滴添加在异丙醇中制备的1ml 8mM对-硝基苯基棕榈酸酯(pNPP)，来制备用于脂肪酶试验的底物。通过添加25-50μl酶试样开始反应，在410nm、37°C监测pNP的释放。酶的活性计算如下：
U.ml-1=(V/v xεx d)X A/min
其中V=最终体积，
v=试样体积，
ε=410nm下p-NP的消光系数，
pH 8.0(15Mol-1xcm-1=mlxμmol-1xcm-1),
d=比色皿中的光程，
A.min-1=每分钟吸光率的变化
生产的甘露聚糖酶的活性通过使用0.25%半乳甘露聚糖(Sigma)的0.05M柠檬酸磷酸盐缓冲液，根据Bailey et al.,(1992)的描述来确定。甘露聚糖降解过程释放的还原性糖的量通过二硝基水杨酸法使用甘露糖作为标准物来确定(Miller et al.,1960)。一个单位的酶定义为在最佳试验条件下在甘露糖等同物中每分钟生产1mmol还原性糖的活性。酶体积活性报道为每ml发酵培养液中酶的单位，而酶的比活性报道为发酵培养液中每mg干细胞重量的酶单位。
结果和论述
连续发酵
在连续发酵中评价0.024h-1和0.058h-1之间的生长速率对生物质和脂肪酶酶的生产的影响。通过将浓缩的葡萄糖溶液(50%m/m)加入(spike)发酵罐使发酵罐中得到5g.l-1的最终葡萄糖浓度，测得葡萄糖为限制生长的营养物质。pO2响应葡萄糖的增加立即降低，且生物质经过1.5小时由9.9g.l-1增加至10.8g.l1(图1)。
在估算的稀释速率下维持11.4(±0.4)g.l-1的恒定生物质，并且残余葡萄糖保持在检测水平以下(图2)。在最低0.024h-1的稀释速率下，得到最高13014nkat.ml-1的酶体积活性。用493nkat.ml-1的酶体积活性估算的最高稀释速率为0.058h-1。
脂肪酶生产对生长速率增加的响应值，通过酶活性的成倍减少值除以稀释速率的成倍增加值计算得到。当生长速率由0.039h-1增加到0.044h-1时，增加的生长速率对脂肪酶生产的影响最高，得到的响应值为4，该值标志着在hp4d启动子调节下通过解脂耶罗维亚酵母Po1f 413-5生产脂肪酶的临界生长速率(图3)。
脂肪酶生产的体积速率和比速率分别在稀释速率为0.024h-1和0.035h-1时达到它们的最高值314nkat.ml-1.h-1和28nkat.mg-1.h-1(图4)。稀释速率增加至大于0.035h-1时导致脂肪酶生产速率减少，当稀释速率增加到大于0.039h-1时，生产速率急剧降低。稀释速率为0.044h-1时，脂肪酶生产的体积速率为1463nkat.ml-1.h-1，并且脂肪酶生产的比速率为6nkat.mg-1.h-1。在生长速率大于0.039h-1时脂肪酶生产率的降低支持了所述结果，表明hp4d启动子是通过生长速率进行调节的，且其在生长速率低于0.035h-1时被完全表达，0.039h-1为用于调节hp4d启动子的临界生长速率。
与分批发酵中脂肪酶生产的最大比速率为7nkat.mg-1.h-1相比，在连续发酵中脂肪酶生产的最大比速率为28nkat.mg-1.h-1，使得连续发酵成为酶生产的一个可行选择。
为利用生长速率对脂肪酶生产的影响，对通过解脂耶罗维亚酵母Po1f413-5生产脂肪酶的分批进料的策略进行测定。测得生物质对葡萄糖的产率为0.59g.g-1。由所述数据，使用下式计算分批进料发酵中用于酶生产的葡萄糖进料速率：
((dcwt0+(dcwt0x((2/td)))-dcwt0)x Yx/s)/dcwt0
其中dcwt0=起始dcw
td=倍增时间
Yx/s=产率
在生长速率为0.039h-1时，计算得葡萄糖进料速率为0.07g.g-1.h-1。
测试分批进料发酵中的进料速率。
分批发酵
脂肪酶发酵
实施分批发酵来测定在hp4d启动子调节下通过解脂耶罗维亚酵母Po1f413-5在最大生长速率下进行的脂肪酶酶的生产。解脂耶罗维亚酵母Po1f413-5在0.14h-1的最大生长速率下生长，并在26h后达到16(±0.36)g.l-1的生物质浓度(图5)。生物质对消耗的葡萄糖的产率为0.67g.g-1。
到指数生长阶段结束时生产的脂肪酶体积活性为1274(±377)nkat.ml-1，并且在38小时后增加了4.6倍达到5 910(±524)nkat.ml-1的最大脂肪酶活性(图6)。脂肪酶比活性生产遵循类似的趋势，且在指数生长阶段结束时，脂肪酶比活性为75(±44)nkat.mg-1，但在接下来的24小时，增加了5倍，达到390(±35)nkat.mg-1。
使用由全培养基进料组成的分批进料法来限制生长速率。葡萄糖耗尽之后，开始所述进料。在分批阶段中最大生长速率为0.13(±0.01)h-1(图7)。
分别以0.029h-1和0.041h-1指数进料速率进行培养基进料，在进料开始后的指数生长速率分别为0.027h-1和0.40h-1。在发酵的分批阶段中，生产出724(±13)nKat.ml-1的脂肪酶。大部分脂肪酶是在指数进料期间生产出，在以0.40h-1进料速率生产出的脂肪酶为7545(±246)nKat.ml-1，相比于在0.027h-1进料速率生产出的脂肪酶为17152(±410)nKat.ml-1(图8)。
在较低生长速率下生长期间达到的最大脂肪酶体积活性为22508(±4219)nKat.ml-1是在较高生长速率时得到的最大脂肪酶体积活性8374(±671)nKat.ml-1的2.7倍。脂肪酶比活性对生长速率的响应与脂肪酶体积活性对生长速率的响应类似，在较低生长速率时得到2.8倍高的活性。与生长速率为0.040h-1时最大脂肪酶比活性为452(±352)nkat.mg-1相比，生长速率为0.027h-1时最大脂肪酶比活性为1281(±311)nkat.mg-1。
生产率不受较慢生长速率的影响，在0.027h-1的生长速率下得到的最大的体积生产率和比生产率为357nkat.ml-1.h-1和20.3nkat.mg-1.h-1。在生长速率为0.040h-1时，体积生产率为133nKat.ml-1.h-1，比生产率为7.2nkat.mg-1.h-1(图9)。
甘露聚糖酶发酵
实施分批发酵来确定在hp4d启动子调节下通过解脂耶罗维亚酵母在最大生长速率下进行的甘露聚糖酶的生产。解脂耶罗维亚酵母在0.23h-1的最大生长速率下生长，在0.68g.g-1葡萄糖产率下在25h后达到27(±0.74)g.l-1的生物质浓度(图10)。甘露聚糖酶活性仅可在葡萄糖耗尽之后确定，因为残余葡萄糖会干扰酶试验。因此在葡萄糖耗尽并且再过16小时时确定甘露聚糖酶。但是，葡萄糖耗尽时的活性是最重要的，因为它指示了在无限制的生长速率期间生产的酶的量。在葡萄糖耗尽时，甘露聚糖酶的体积活性和比活性分别为10427(±967)nkat.ml-1和386(±13)nkat.mg-1，但在接下来的十六个小时期间，它们增加至14253(±2807)nkat.ml-1和527.9(±88)nkat.mg-1。
使用分批进料策略来限制最大生长速率，全培养基进料——以葡萄糖作为如在连续发酵中确定的限制性营养物——在葡萄糖耗尽时(16h后)以0.1g(葡萄糖).l-1.h-1的速率开始，并分别以0.035和0.045h-1的指数速率增加(图11)。在分批阶段中生长速率为0.24h-1，以0.63g.g-1的产率实现15(±0.3)g.l-1的生物质。应用的指数进料速率将在发酵的分批进料阶段中的生长速率分别限制为0.033h-1和0.044h-1，在分批进料阶段结束时，得到的最终生物质为28(±0.6)g.l-1。
进行两组发酵试验，每组重复三次，在分批阶段结束时，甘露聚糖酶的平均体积活性和比活性分别为5211(±602)nkat.ml-1和436(±47)nkat.mg-1(图12)。相比于当解脂耶罗维亚酵母被以0.045h-1的指数速率进料培养基时生产的最大酶体积活性为31479(±1819)nkat.ml-1，以0.035h-1指数速率进料培养基时生产的最大酶体积活性为40480(±1268)nkat.ml-1。
酶比活性由当所述培养基以0.045h-1的指数进料速率进料时的1 109(±60)nkat.mg-1到当对发酵罐以0.035h-1的指数速率进料时的1 533(±83)nkat.mg-1，增加了1.4倍。较低的进料速率不会导致较低的甘露聚糖酶生产率，且酶在0.035h-1和0.045h-1的指数进料速率下以913nkat.ml-1.h-1生产。这是在分批发酵中达到的346nKat.ml-1.h-1的生产率的2.6倍。
结论
这是第一个报道的有关通过解脂耶罗维亚酵母在连续发酵中的生产外源酶的数据。酶生产的临界生长速率位于0.035h-1和0.039h-1之间，由该数据可计算分批进料发酵中的葡萄糖的进料速率。在分批进料发酵中对该进料策略进行评价，该分批进料发酵用于在hp4d启动子调节下在解脂耶罗维亚酵母中生产酶。
为评价生长速率对脂肪酶生产的影响，用全培养基指数进料基于进料中的葡萄糖浓度以0.029h-1和0.041h-1的速率进行两次分批进料发酵，分别得到0.027h-1和0.040h-1的生长速率。当生长速率限制为0.027h-1时，酶的体积活性和比活性是分批发酵时的3.8和3.3倍。在生长速率为0.027h-1时脂肪酶的体积活性是生长速率为0.040h-1时得到的脂肪酶的体积活性的1.7倍。与在连续发酵中，当生长速率由0.039h-1降至0.024h-1时，得到的脂肪酶体积活性增加1.9倍相比，上述结果是有利的。
当生长速率通过0.035h-1的指数进料进行限制时，甘露聚糖酶的体积活性和比活性是分批发酵时的2.7倍和2.9倍。利用低于0.045h-1的指数进料速率将酶的比活性最大化的能力可通过一旦达到高的生物质浓度时将进料速率由0.056h-1降低至0.035h-1时而开发出。这将使得在hp4d启动子调节下在解脂耶罗维亚酵母中得到高的酶的比生产率和体积生产率。
在该报道中呈现的数据表明，在hp4d启动子调节下进行的酶的生产可以在生产生物质期间而启动，通过使用指数进料策略限制生长速率。
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Claims (13)
1.一种在解脂耶罗维亚酵母中表达多肽的方法，该方法包括步骤：
使解脂耶罗维亚酵母发酵，该酵母已经多核苷酸转化，所述多核苷酸在hp4d启动子的控制下编码多肽；和
在发酵期间将解脂耶罗维亚酵母的生长速率限制为低于0.045h-1。
2.权利要求1所述的方法，其中所述生长速率限制在约0.023h-1至约0.040h-1的范围内。
3.权利要求2所述的方法，其中所述生长速率限制在约0.035h-1至约0.039h-1的范围内。
4.权利要求3所述的方法，其中所述生长速率限制在约0.035h-1。
5.权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述生长速率通过控制加入至含解脂耶罗维亚酵母的发酵溶液中的食物源的量进行限制。
6.权利要求5所述的方法，其中所述食源为碳酸源和/或氮源。
7.权利要求1-6中任一项所述的方法，其中发酵通过分批发酵、分批进料发酵、反复分批进料发酵或连续发酵中的任意一种而进行。
8.权利要求7所述的方法，其中所述发酵为分批进料发酵。
9.权利要求7所述的方法，其中所述发酵为反复分批进料发酵。
10..权利要求7所述的方法，其中所述发酵为连续发酵。
11.权利要求1-10中任一项所述的方法，其中多肽的生产水平与生长速率不受限制的对照组解脂耶罗维亚酵母相比而言增加。
12.用于在如权利要求1-11中任一项所述的方法中使用的解脂耶罗维亚酵母，该酵母已经多核苷酸转化，所述多核苷酸在hp4d启动子的控制下编码多肽。
13.一种试剂盒，含有如权利要求12所述的解脂耶罗维亚酵母，所述试剂盒用于实施如权利要求1-11中任一项所述的方法。
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