CN102980854A - 一种植酸酶的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物检测领域，涉及一种用于检测样品中植酸酶的方法。主要是利用羧基-氨基化学偶联法偶联分散型纳米微球和植酸分子，在溶剂相中形成植酸酶与植酸结合的表面快速反应体系，产物正磷酸直接进入溶剂相，而未反应的肌醇衍生物仍滞留于固相微球。通过低温和高速离心去除微球，在酸性条件下在溶剂相中加入显色剂生成蓝色复合物，在波长700nm比色测定。该方法在实现植酸酶活力快速测定的同时，使未反应的肌醇衍生物仍滞留于固相微球，避免了常规方法中未完全反应的植酸分子与显色剂反应所造成的背景值干扰，使得痕量测定成为可能。适用于特定环境样品如土壤、水体和根际残留物中的痕量植酸酶样品测定。

Description

一种植酸酶的检测方法

技术领域

本发明属于生物检测领域，涉及一种用于检测样品中植酸酶的方法。

背景技术

植酸酶广泛存在于植物、动物组织和微生物中。植酸酶分为3类：肌醇六磷酸-3-磷酸水解酶，肌醇六磷酸-6-磷酸水解酶和非特性的正磷酸盐单酯磷酸水解酶。目前发现的植酸酶有3种来源：一是存在于植物中的天然植酸酶，如小麦、大麦、黑麦等谷物籽粒及其加工副产物中含有的天然植酸酶；二是微生物来源的植酸酶，也是目前认为最有潜力的植酸酶；三是从牛瘤胃中分离出的一种可以产生植酸酶的细菌，同时还可以产生有营养功能的其他酶类。

植酸酶能催化植酸及其盐类水解为肌醇与磷酸（盐），具有特殊的空间结构，能够依次分离植酸分子中的磷，将植酸（盐）降解为肌醇和无机磷，同时释放出与植酸（盐）结合的其它营养物质。

由于植酸酶能够分解饲料的植酸为肌醇和无机磷，提高饲料中磷的利用率，减少无机磷的用量；降低植酸及其植酸盐对蛋白质、矿质元素的螯合作用，提高饲料中矿质元素和营养物质的利用率，并减少植酸对动物肠胃内相关消化酶的活性的抑制作用，最终提高动物的生产性能，降低磷对环境的污染作用。因此植酸酶制剂广泛应用于饲料工业，同时在食品工业、环境保护等领域亦发挥积极作用。

在植酸酶活性测定中，一般利用植酸酶在一定温度和pH条件下，水解植酸钠形成正磷酸和肌醇衍生物，在酸性环境中与底物反应生成蓝色络合物，通过比色测定和标准曲线，最终换算成植酸酶活力单位。然而，该方法的主要问题是未完全反应的底物亦与显色剂反应，造成背景值干扰，从而影响到植酸酶活力的精确定量，对于特定环境样品如土壤、水体和根际残留物中的痕量植酸酶测定并非合适。

发明内容

本发明的目的是为了克服上述缺点，通过纳米微球的快速反应和离心去除，排除背景值的干扰，从而提供一种样品中植酸酶的检测方法。

一种植酸酶的检测方法，示意图见图4，利用羧基-氨基化学偶联法偶联分散型纳米微球和植酸分子，在溶剂相中形成植酸酶与植酸结合的表面快速反应体系，产物正磷酸直接进入溶剂相，而未反应的肌醇衍生物仍滞留于固相微球，通过低温和高速离心去除微球，在酸性条件下在溶剂相中加入显色剂生成蓝色复合物，在波长700nm比色测定，通过制定的标准曲线，最终换算成植酸酶活力单位。

所述的分散型纳米微球为单分散羧基化聚苯乙烯微球，粒径<50nm，表面载基团为羧基。

所述的利用羧基-氨基化学偶联法偶联分散型纳米微球和植酸分子是将单分散羧基化聚苯乙烯微球用碳化二亚胺活化20~40min，然后加入N-羟基硫代琥珀酰亚胺15min使微球形成稳定的活泼酯中间体，再加入植酸钠30℃温育1-2小时，洗涤后收集偶联植酸分子的纳米微球；其中所述的单分散羧基化聚苯乙烯微球、碳化二亚胺、N-羟基硫代琥珀酰亚胺以及植酸钠的用量为1g：0.01~0.1mol∶0.005~0.1mol∶0.001~0.01mol；优选1g：0.05mol：0.01mol∶0.002mol。

本发明植酸酶的检测方法中，纳米微球和植酸分子偶联后，在37°C、pH4.5~5.5条件下加入植酸酶样品进行反应，未反应的肌醇衍生物仍滞留于固相微球；通过4℃低温和高速离心20~30min去除微球，于酸性条件（即pH4.5~5.5）下在溶剂相中加入显色剂生成蓝色复合物，在波长700nm比色测定。

本发明植酸酶的检测方法中，采用植酸酶纯蛋白为标准样品，测定标准曲线，然后再根据样品比色值结果测算实际植酸酶含量。

根据权利要求1或4所述的植酸酶的检测方法，所述的高速离心为15,000×g。

所述的植酸酶1个酶活力单位（U）定义为在37°C、pH4.5~5.5条件下，每分钟从5mM的植酸钠溶液中释放出1μmol的无机磷所需要的酶量定义为。

本发明的有益效果在于，通过纳米微球的高效表面反应体系可以实现植酸酶活力的快速测定；同时，未反应的肌醇衍生物仍滞留于固相微球，避免了常规方法中未完全反应的植酸分子与显色剂反应所造成的背景值干扰，使得痕量测定成为可能。适用于特定环境样品如土壤、水体和根际残留物中的痕量植酸酶样品测定。

附图说明

图1是羧基化聚苯乙烯分子式(A)和羧基化聚苯乙烯微球扫描电镜(B)图

图2是活化剂EDC（碳化二亚胺）分子式（A）和保护剂Sulfo-NHS（N-羟基硫代琥珀酰亚胺）分子式图

图3是植酸酶测定标准曲线

图4是纳米微球和植酸分子偶联、催化反应和比色测定示意图

具体实施方式

实施例1

如图1所示，纳米微球为单分散羧基化聚苯乙烯微球，粒径<50nm，表面载基团为羧基。微球和植酸分子偶联过程采用的是羧基-氨基化学偶联法，包括将单分散羧基化聚苯乙烯微球5mg用5ml50mM活化剂EDC（碳化二亚胺）（图2A）活化30min，然后加入1ml50mM保护剂Sulfo-NHS（N-羟基硫代琥珀酰亚胺）（图2B）15min使微球形成稳定的活泼酯中间体，再加入2ml5mM植酸钠30℃温育1-2小时，洗涤后收集偶联植酸分子的纳米微球。

实施例2

如表1所示，将偶联植酸分子的纳米微球用0.1M乙酸缓冲液配制成2.5%(w/v%,重量/体积百分比，具体指g/100ml)的悬浮液，调整pH5.0。取80μl微球，加入样品或植酸酶标准品20μl。以植酸酶纯蛋白为标准品，设立8个浓度梯度（2U/ml，1U/ml，0.5U/ml，0.25U/ml，0.125U/ml，0.0625U/ml，0.03125U/ml和0U/ml）。在37℃预热5min后，混匀5min，于37℃保温30min。在4℃、15,000×g条件下离心20min，收集上清。接着，依次加入5%(w/v%,具体指g/100ml)三氯乙酸100μl（终止液）和显色剂100μl（1.5%(w/v%,具体指g/100ml)钼酸钠和2.7%(w/v%,具体指g/100ml)硫酸亚铁按4:1的比例，现配现用），混匀后立即在波长700nm比色测定。酶活力单位定义：在37°C、pH5.0条件下，每分钟从5mM的植酸钠溶液中释放出1μmol的无机磷定义为1个酶活力单位（U）。

如图3所示，根据植酸酶标准品测定的标准曲线，相关系数R²=0.993，测定的最低浓度0.03125U/ml。对植酸酶样品1-4的吸光度值进行换算后，获得样品的植酸酶实测结果，如表2所示。

表1

表2植酸酶样品实测结果

Claims (7)

1.一种植酸酶的检测方法，其特征是利用羧基-氨基化学偶联法偶联分散型纳米微球和植酸分子，在溶剂相中形成植酸酶与植酸结合的表面快速反应体系，产物正磷酸直接进入溶剂相，而未反应的肌醇衍生物仍滞留于固相微球，通过低温和高速离心去除微球，在酸性条件下在溶剂相中加入显色剂生成蓝色复合物，在波长700nm比色测定，通过制定的标准曲线，最终换算成植酸酶活力单位。

2.根据权利要求1所述的植酸酶的检测方法，其特征是所述的分散型纳米微球为单分散羧基化聚苯乙烯微球，粒径<50nm，表面载基团为羧基。

3.根据权利要求2所述的植酸酶的检测方法，其特征是所述的利用羧基-氨基化学偶联法偶联分散型纳米微球和植酸分子是将单分散羧基化聚苯乙烯微球用碳化二亚胺活化20~40min，然后加入N-羟基硫代琥珀酰亚胺反应15min使微球形成稳定的活泼酯中间体，再加入植酸钠30℃温育1-2小时，洗涤后收集偶联植酸分子的纳米微球；其中所述的单分散羧基化聚苯乙烯微球、碳化二亚胺、N-羟基硫代琥珀酰亚胺以及植酸钠的用量为1g：0.01~0.1mol：0.005~0.1mol∶0.001~0.01mol；优选1g：0.05mol：0.01mol∶0.002mol。

4.根据权利要求1所述的植酸酶的检测方法，其特征是分散型纳米微球和植酸分子偶联后，在37°C、pH5.0条件下加入植酸酶样品进行反应，未反应的肌醇衍生物仍滞留于固相微球；通过4℃低温和高速离心20~30min去除微球，于酸性条件下在溶剂相中加入显色剂生成蓝色复合物，在波长700nm比色测定。

5.根据权利要求1或4所述的植酸酶的检测方法，其特征是采用植酸酶纯蛋白为标准样品，测定标准曲线，然后再根据样品比色值结果测算实际植酸酶含量。

6.根据权利要求1或4所述的植酸酶的检测方法，其特征是所述的高速离心为15,000×g。

7.根据权利要求1或4所述的植酸酶的检测方法，其特征是酶活力单位定义：在37°C、pH4.5~5.5条件下，每分钟从5mM的植酸钠溶液中释放出1μmol的无机磷所需要的酶量定义为1个酶活力单位。

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