CN102978199A - 一种hiv-1耐药野生型基因合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种HIV-1耐药野生型基因合成方法,将长目的片段分段合成，并合成错位互补片段，通过运用多次PCR方法合成所需目的基因片段，这一方法既简单又安全，无需复杂的设备，也不需要一个高度管制的实验环境，尤其适用感染性疾病目的基因的研究。本发明的技术方案在功能基因组学等领域有着广泛的应用，比如，在突变，缺失或嵌合基因编码一个特定的蛋白质，具有很大的灵活性。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种HIV-1耐药野生型基因合成方法及引物。
背景技术
基因合成是指在体外人工合成双链DNA分子的技术,与寡核苷酸合成有所不同：寡核苷酸是单链的，所能合成的最长片段仅为100nt左右，而基因合成则为双链DNA分子合成，所能合成的长度范围50bp-12 kb。
基因合成是用人工方法合成基因的技术，是基因获取的手段之一，相对于从已有生物中获取基因来说，基因合成无需模板，因而不受基因来源限制。人类首条人工合成的基因出现在上世纪60年代基因合成是当前合成生物学的主要内容，通过基因合成，可以获得自然界中不存在的基因，为人类改造生物开辟了一个全新的方向，在可预计的将来，基因合成将在生命科学领域发挥巨大作用，在新能源、新材料、人工生命、核酸疫苗、生物医药[1]等领域的作用已初步体现。基因合成也存在潜在的被开发成生物武器的可能，而这个可能性在几个病毒的人工合成之后变得更加突出。
目前基因合成有两种途径，一是向基因合成公司订制，二是作本地基因合成。由于基因合成技术还没有一个统一的方法，基因合成的技能和经验在合成过程中具有决定性的影响，所以大部分基因合成都是在专业人员手中完成的，这也决定了途径一是目前的主要渠道。本地基因合成一般需要参考学术文章，这方面的文章有很多，如【Neves FO, Ho PL, Raw I, Pereira CA, Moreira C, Nascimento AL. Overexpression of a synthetic gene encoding human alpha interferon in Escherichia coli. Protein Expr Purif. Jun;35(2):353-9(2004)】。但大多只是个别基因的合成，只具备有限的参考价值，除非是那些为了研究技术本身而作的基因合成。HIV-1因其为RNA病毒，具有高突变特性。HIV病毒基因突变使药物作用靶点结构发生改变，导致病毒对药物不敏感或敏感性下降。因各种类型HIV耐药相关的基因突变不断发生，因此如何准确测定耐药基因尤为重要。而一般的分子实验室因条件及级别的限定，都是不能直接做艾滋病毒的实验，换而言之，就无法直接从艾滋病毒中获得药物作用的靶点基因，只能通过实验室人工合成耐药突变模板，进行下一步的实验。大部分的实验室主要是通过公司来合成较长的目的片段，因此，需要一种可以在实验室方法来合成想要的片段。
发明内容
本发明所要解决的第一方面的问题在于克服现有技术中HIV-1耐药野生型基因合成困难的问题，提供一种步骤简单、快速、准确、成本低的HIV-1耐药野生型基因合成方法及引物。
为了解决上述的第一方面的技术问题，本发明提供的技术方案为：一种HIV-1耐药野生型基因合成方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1） 把HIV-1耐药野生型基因,分成若干N段（n=20-40）的A碱基片段,即 A1，A2，A3，A4，A5…An,并进行人工合成；
设计并人工合成与上述片段互补的N-1碱基片段，即B1，B2，B3，B4…Bn-1 ；其中，任一Bn碱基片段的5’端比各耐药野生型基因片段的An碱基片段5’端后移20-25bp；Bn碱基片段的端延伸到耐药野生型基因片段的An+1碱基片段5’端20-25bp；
根据上述相互匹配的两两对应互补片段设计并合成正向、反向引物；
（2）将上述相互对应部分互补的碱基片段分别进行PCR扩增，即A1/B1, A2/B2, A3/B3…… An/Bn,使部分互补经PCR扩增后变为完全互补；
（3）再将上述具有互补片段的相邻扩增产物，二次扩增；
（4）以3个A碱基片段为单位分别合成167bp片段，并需要进行琼脂糖凝胶的割胶回收纯化，标记为C1，C2，C4，C5…Cn/3, 最后一个An片段可与Cn/3连接；
（5）再运用PCR分别两两扩增C1和C2；C3和C4，C5和C6，C7和C8，C9和C10各可得到309bp片段，标记为D1，D2，D3，D4，D5；
（6）再运用PCR分别两两扩增D1和D2，D3和D4可得598bp片段，标记为E1，E2，D5跟E2连接可得F1887bp；
（7）最后将E1和F1进行PCR连接就可以得到1508bp的片段；
（8）将片段插入TA载体中，并鉴定野生型模板是否构建正确。
优选地，所述步骤（1）中，把HIV-1耐药野生型基因分成31段并进行人工合成，每段含有44-49个碱基,如Seq No.1～31所示；
设计并人工合成与HIV-1耐药野生型基因互补的碱基片段30段，每段含40个碱基,如Seq No. 32～61所示；
根据上述相互匹配的两两对应互补片段设计并合成正向、反向引物,如Seq No. 62～101所示。
本发明中，HIV-1耐药野生型基因序列来自GenBank，protein_id="AAC82598.2"；把HIV-1耐药野生型基因分成31段，每段含有44-49个碱基,如Seq No.1～31所示，即碱基序列标号1～31所示的片段。
本发明中，序列Seq No.62～91,即碱基序列标号 2-1～2-30所示的片段是分别与序列Seq No. 32～61，即碱基序列标号 1-1～1-30的片段对应的引物。
本发明中，序列Seq No. 92～101，即碱基序列标号 62、62-4、62-7、62-10、62-13、62-16、62-19、62-22、62-25、62-28是大量扩增各个3个片段为单位的正向引物。
本发明将长目的片段分段合成，并合成错位互补片段，通过运用多次PCR方法合成所需目的基因片段，这一方法既简单又安全，无需复杂的设备，也不需要一个高度管制的实验环境，尤其适用感染性疾病目的基因的研究。本发明的技术方案在功能基因组学等领域有着广泛的应用，比如，在突变，缺失或嵌合基因编码一个特定的蛋白质，具有很大的灵活性。
本发明提供的方法可以稳定合成1KB左右的片段。其优点有：
⑴合成周期短，可以保证序列的100%正确无误；
⑵具有很大的灵活性，可以对基因的酶切位点和基因序列进行修改，方便下游的克隆和实验；
⑶研究人员根据自己的意愿设计得到自然界中很难获得甚至不存在的基因。
附图说明:
图1为本发明的HIV-1耐药野生型基因合成方法示意图。
图2为A1和A2连接成功的琼脂糖凝胶电泳图。
图3为A1,A2和A3连接成功的琼脂糖凝胶电泳图。
图4A为野生型模板片段跟TA载体连接后的质粒，目的片段电泳图；其中1~4为野生型质粒电泳图，6-10为引物扩增电泳图；
图4B为野生型模板片段跟TA载体连接后的质粒酶切电泳图。
图5为耐药突变点M41L（ATG-CTG）野生型测序图与突变型测序图之间的比较，进一步证明HIV-1耐药野生型基因构建成功。
图6为耐药突变点K65R（ AAA-AGA）野生型测序图与突变型测序图之间的比较，进一步证明HIV-1耐药野生型基因构建成功。
图7为耐药突变点T69N (ACT-AAT)野生型测序图与突变型测序图之间的比较，进一步证明HIV-1耐药野生型基因构建成功。
图8为耐药突变点M184V(ATG-GTG)野生型测序图与突变型测序图之间的比较，进一步证明HIV-1耐药野生型基因构建成功。
图9为耐药突变点V75T(GTA-ATA)野生型测序图与突变型测序图之间的比较，进一步证明HIV-1耐药野生型基因构建成功。
图10为耐药突变点V82A(GTC-GCC)野生型测序图与突变型测序图之间的比较，进一步证明HIV-1耐药野生型基因构建成功。
图11为耐药突变点L90M(TTG-ATG)野生型测序图与突变型测序图之间的比较，进一步证明HIV-1耐药野生型基因构建成功。
具体实施方式
以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限于限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体厂家的条件做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。其中，实验中，使用到的重要试剂、药品、仪器的厂家及型号如下所述:
实 验 材 料
一、 主要仪器
| AlphalmagerTM2200凝胶成像分析系统 | 美国Alpha innotech |
| 普通梯度PCR仪 | 美国BioRad公司 |
| Air tech净化工作台 | 苏净集团安泰公司 |
| AvantiTM J-25离心机 | Beckman公司 |
| C-0160台式高速离心机 | Labnet公司 |
| DDY-5型稳压稳流电泳仪 | 北京六一仪器厂 |
| DK-600B电热恒温水槽 | 上海佳胜 |
| LRH-250A生化培养箱 | 广东省医疗器械厂 |
| UV/VIS Du640紫外分光光度仪 | Beckman公司 |
| -80℃低温冰箱 | 日本SANYO公司 |
| 电子分析天平 | 美国Sartorius公司 |
| 微量移液器 | 德国Eppendorf公司 |
| 各种离心管等耗材 | 上海生工 |
二、主要试剂
1、菌株与载体
| pMD19-T Vector (TaKaRa Code：D102A) | 日本TaKaRa公司 |
2、试剂盒
| 离心柱型普通DNA产物回收试剂盒 (货号#DP204-02) | 北京天根公司 |
| 离心柱型琼脂糖凝胶DNA产物回收试剂盒 (货号#DP209-02) | 北京天根公司 |
| 离心柱型质粒小提中量试剂盒 (货号#DP106-02) | 北京天根公司 |
3、酶类、Marker
| 2×Taq Master Mix | BIOMIGA(中国) |
| Pfu DNA Polymerase (货号#EP0502) | 美国Thermo公司 |
| dNTP (货号#R0193) | 美国Thermo公司 |
| EcoR I | 美国Thermo公司 |
| 100 bp DNA Ladder（#SM1143） | 美国Thermo公司 |
| 1kp DNA Ladder（#SM0313） | 美国Thermo公司 |
4、其他试剂
氨苄青霉素、Tris、EDTA、DMSO、电泳级琼脂糖、胰酶、胰蛋白胨、酵母提取物、无水乙醇等主要购自上海生物工程公司和衡西化学药品批发市场。
三、相关生物信息学软件及网站
| 1、primerpremier5.0 | 离线引物设计软件 |
| 2、primerpremier3.0 | 在线引物设计软件 |
| 3、MutaPrimer 1.0 | 定点突变的引物设计桌面工具软件 |
| 4、DNAStar5.0 | 同源性分析软件 |
| 5、BioEdit | 综合序列分析软件 |
| 6、ContigExpress | 序列拼接软件 |
| 7、Chromas | 测序结果分析软件 |
实施例1
先以部分片段连接为例，进行连接。
1. 先让两对碱基片段1,1-1；2,1-2分别在两个PCR管中形成双链；其PCR扩增体系都为：2.5μL 的10 X Pfu buffer （Thermo），dNTP 0.4μL ,Pfu酶0.4μL ,1号引物：20 μM ,1-1号引物：20μM ，加水至总体积25μL；PCR扩增反应条件都是:95°C变性10S，56°C退火10S,72°C延伸10S，总共30个循环，反应后产物分别标记为1-1-1和2-1-2。
2. 接下来PCR扩增体系为：2.5μL的10 X Pfu buffer（Thermo），dNTP 0.4μL ,Pfu酶0.4μL，1-1-1产物：10 μM ,2-1-2产物：10μM ，加水至总体积25μL。其PCR扩增反应条件：95°C预变性2min,95°C变性10S，56°C退火10S，72°C延伸10S，总共30个循环,标记为X1。
3. 以2）的扩增后产物X1为模板，62号,2-2号为引物再次扩增，其PCR扩增体系为：2.5μL 的10 X Pfu buffer （Thermo），dNTP 0.4μL, Pfu酶0.4μL ，2-2号引物：10 μM ,62号引物：10μM ，X1：加水至总体积25μL。其PCR扩增反应条件：95°C预变性2min,95°C变性10S，50°C退火10S，72°C延伸10S ，总共30个循环；对扩增产物进行凝胶电泳跑胶，电泳图如图2所示。
4. 对3片段引物按上述1）同样处理后得到3-1-3, 再对X1，3-1-3进行扩增，得到C1 (162bp)，即得到1~3号引物的片段长度，必须进行割胶纯化，跑胶图如图2所示。
5. 每次都以3个片段为单位扩增，再分别把各个3个片段连接起来，合成后用Taq酶扩增，并用PMD-19进行TA连接。
实施例2 鉴定野生型模板是否构建正确
将实施例1中得到的野生模板质粒，酶切后琼脂糖凝胶电泳，如图4所示。
从上面的跑胶图可得野生模板构建是符合理论要求，为进一步验证模板的正确性，对其进行测序，并选取了7个耐药突变点进行比对，得到完全正确的序列图，结果如图5—图11所示。
上述实例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人是能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (2)
1.一种HIV-1耐药野生型基因合成方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1） 把HIV-1耐药野生型基因,分成若干N段（n=20-40）的A碱基片段,即 A1，A2，A3，A4，A5…An,并进行人工合成，
设计并人工合成与上述片段互补的N-1碱基片段，即B1，B2，B3，B4…Bn-1 ；其中，任一Bn碱基片段的5’端比各耐药野生型基因片段的An碱基片段5’端后移20-25bp；Bn碱基片段的端延伸到耐药野生型基因片段的An+1碱基片段5’端20-25bp，
根据上述相互匹配的两两对应互补片段设计并合成正向、反向引物；
（2）将上述相互对应部分互补的碱基片段分别进行PCR扩增，即A1/B1, A2/B2, A3/B3…… An/Bn,由部分互补变为完全互补片段；
（3）再将上述具有互补片段的相邻扩增产物，二次扩增；
（4）以3个A碱基片段为单位分别合成167bp片段，并需要进行琼脂糖凝胶的割胶回收纯化，标记为C1，C2，C4，C5…Cn/3, 最后一个An片段可与Cn/3连接；
（5）再运用PCR分别两两扩增C1和C2；C3和C4，C5和C6，C7和C8，C9和C10各可得到309bp片段，标记为D1，D2，D3，D4，D5；
（6）再运用PCR分别两两扩增D1和D2，D3和D4可得598bp片段，标记为E1，E2，D5跟E2连接可得F1=887bp；
（7）最后将E1和F1进行PCR连接就可以得到1508bp的片段；
（8）将片段插入TA载体中，并鉴定野生型模板是否构建正确。
2.根据权利要求1所述的HIV-1耐药野生型基因合成方法，其特征在于，
所述步骤（1）中，把HIV-1耐药野生型基因分成31段并进行人工合成，每段含有44-49个碱基,如Seq No.1～31所示；
设计并人工合成与HIV-1耐药野生型基因互补的碱基片段30段，每段含40个碱基,如Seq No. 32～61所示；
根据上述相互匹配的两两对应互补片段设计并合成正向、反向引物,如Seq No. 62～101所示。
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Citations (2)
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|---|---|---|---|---|
| WO2010132019A1 (en) * | 2009-05-11 | 2010-11-18 | Agency For Science, Technology And Research | Gene synthesis method |
| CN102321612A (zh) * | 2011-08-29 | 2012-01-18 | 苏州金唯智生物科技有限公司 | 工业化的基因合成方法 |
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2012
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