CN102977113A - 一种检测硫醇的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种检测硫醇的方法，具体地说是基于一种香豆素色烯衍生物检测硫醇的方法。所述的香豆素色系衍生物，它是8,9-dihydro-2H-cyclopenta[b]pyrano[2,3-f]chromene-2,10(7AH)-dione（简称：CPC）。检测方法是基于CPC，在pH为7.4的HEPES溶液中定量地检测硫醇的含量。该检测方法，对硫醇显示了高的灵敏性和选择性，检测过程简便、灵敏、快速，检测结果准确。

Description

一种检测硫醇的方法
技术领域：
本发明涉及检测探针，具体涉及检测硫醇的方法，更具体地说是基于一种香豆素色烯衍生物检测硫醇的方法。
背景技术：
硫醇在生物体系中起着关键作用。三种结构相似的小分子硫醇：半胱氨酸（Cys）、同型半胱氨酸（Hcy）和谷胱甘肽（GSH）在维持生物系统中扮演着至关紧要的的角色。细胞内硫醇浓度的改变与一些疾病紧密相连，如白血球降低、牛皮癣、肝脏损伤、癌症和艾滋病。半胱氨酸（Cys）缺乏会引起很多综合疾病，如儿童生长缓慢、白化病、水肿、嗜睡症、肝脏损伤、肌肉和脂肪消损、皮肤损伤、虚弱。血浆中高水平的同型半胱氨酸（Hcy）是Alzheimer症、叶酸和维生素B12缺乏症和心血管疾病的致病因素之一。血浆中总的同型半胱氨酸（tHcy）浓度与出生缺陷、老年痴呆等疾病有关。谷胱甘肽（GSH）是细胞内含量最高的非蛋白质硫醇（1～10mmol/L），支持许多细胞功能，如维持细胞氧化还原动态平衡、异型生物质的新陈代谢、细胞内的信号传导以及基因调节。更为重要的是，谷胱甘肽能保持蛋白质中半胱氨酸巯基处于还原态，和通过俘获伤害DNA和RNA的自由基保护细胞免受氧化伤害。因此，定量检测生物体系中硫醇的浓度在科研和临床中具有重要意义，建立快速、准确、灵敏的硫醇检测方法，也是预防和监测硫醇所引发的疾病的重要措施之一。
目前已报道的用于检测硫醇的检测方法有：高效液相色谱法、毛细管电泳法、电化学法、傅里叶变换红外光谱、质谱法等。然而这些方法检测过程需要大型仪器、检测过程繁琐、耗时、设备和药品比较昂贵等。小型医院及诊所由于缺乏大型设备，而无法把测定病人体液中硫醇的含量作为临床上的一个常规检验。所以，发展一种检测过程简单、灵敏、成本低、适合临床、科研使用的的检测硫醇的方法非常必要。
发明内容：
本发明的目的是提供一种体系简单、操作方便、选择性高、灵敏度高、水溶性好的定量检测硫醇的方法。
本发明提供的快速检测硫醇的方法，是基于一种香豆素色烯衍生物8,9-dihydro-2H-cyclopenta[b]pyrano[2,3-f]chromene-2,10(7AH)-dione（简称CPC，中文名称为：8，9-二氢-2H-环戊二烯并[b]吡喃并[2,3-f]苯并吡喃-2，10（7AH）-二酮），在pH为7.4的HEPES溶液中定量地检测硫醇的含量。该检测方法，对硫醇显示了高的灵敏性和选择性，
检测过程简便、灵敏、快速，检测结果准确。
本发明首先提供的一种香豆素色烯衍生物，是8,9-dihydro-2H-cyclopenta[b]pyrano[2,3-f]chromene-2,10(7AH)-dione（简称CPC），其结构式是：
Figure BDA00002563479200021
本发明提供的一种香豆素色烯衍生物的合成方法，步骤为：香豆素醛和环戊烯酮按摩尔比1:1.1-3（优选1:1.5）溶解在体积比为1:1的四氢呋喃和水的混合溶液中，在室温下搅拌72小时，用5-10倍体积的1M HCl稀释，并用乙酸乙酯萃取，有机相浓缩并被减压蒸干，然后用体积比1:4的乙酸乙酯和石油醚在硅胶色谱柱淋洗，蒸干即可得产品。其合成路线为：
Figure BDA00002563479200022
CPC检测硫醇的方法：
紫外可见光谱法检测，包括如下步骤：
（1）、配制pH=7.4、浓度为10mM的HEPES缓冲溶液，并用乙醇配制2mM的CPC乙醇溶液；
（2）、按体积比400:7将HEPES缓冲溶液和CPC乙醇溶液加到干净的紫外比色皿中，在紫外可见分光光度仪上检测，随着待测样的加入，372nm出现新的吸收峰并逐渐升高，当吸收峰不再升高时，停止加待测样，此时加入待测样的体积计为V待测样；
（3）、按VCPC×2×10-3/V待测样计算出待测样中硫醇的浓度（mol/L）。
荧光光谱检测，包括如下步骤：
（1）配制pH=7.4、浓度为10mM的HEPES缓冲溶液，并用乙醇配制2mM的CPC乙醇溶液；
（2）按体积比200:1将HEPES缓冲溶液和CPC乙醇溶液加到干净的紫外比色皿中，在荧光分光光度仪上检测，随着待测样的加入，455nm出现明显的荧光增强，且随着硫醇浓度的增大，荧光强度也增大，当强度不再增大时，停止加待测样，此时加入待测样的体积计为V待测样；
（3）按VCPCμl×2×10-3/V待测样μl计算出待测样中硫醇的浓度（mol/L）。
经实验证明，其它离子不干扰体系对硫醇的测定。
本发明的香豆素色烯衍生物还可用于细胞成像。
与现有技术相比，本发明具有如下优点和效果：1、检测体系成本低廉，香豆素色烯衍生物由7-羟基香豆素醛和环戊烯酮，在室温下一步制得，原料便宜，反应条件简单，易于大规模生产；2、本发明的检测方法，对硫醇显示了极高的灵敏性和选择性，其它非巯基氨基酸和体液中的各种阴离子不干扰检测结果；3、检测过程简便、灵敏、快速，有很低的检测限和宽的线性范围，检测结果准确；4、检测手段简单，只需要借助紫外分光光度计即可进行。
附图说明：
图1：在含有35μl CPC和pH7.4HEPES(10mM)缓冲溶液中逐渐加入Cys的紫外可见吸收图。
图2：在含有35μl CPC和pH7.4HEPES(10mM)缓冲溶液中，加入各种氨基酸的紫外可见吸收图。
图3：在含有35μl CPC和pH7.4HEPES(10mM)缓冲溶液中，加入巯基丙酸的紫外可见光谱图。
图4：在含有35μl CPC和pH7.4HEPES(10mM)缓冲溶液中，加入巯基乙醇的紫外可见光谱图。
图5：在含有:10μl CPC和pH7.4HEPES(10mM)缓冲溶液中，加入Cys的荧光发射图。
图6：细胞成像图。
具体实施方式：
实施例1
CPC的合成:
在室温下，称取7-羟基香豆素醛0.380g（2mmol），环戊烯酮0.246g（3mmol）和咪唑0.204g（3mmol）于50ml圆底烧瓶中，加入3ml四氢呋喃（THF）和3ml去离子水，在室温下搅拌72小时，加入10ml、1M HCl稀释，用乙酸乙酯（3×30ml）萃取，减压浓缩有机相。然后用乙酸乙酯和石油醚（1：4）作为洗脱液，用柱色谱分离，减压蒸发溶剂得到纯净的CPC，产率46℅。
CPC的表征:
1H NMR(300MHz,25℃,CDCl3):δ7.74(s,1H),7.63(d,1H),7.60(m,1H),6.84(d,1H),5.36(t,1H),2.58-2.80(m,2H),2.21-2.44(m,2H),;13C NMR(75MHz,CDCl3):δ28.70,37.65,75.91,111.56,114.06,114.74,121.80,131.59,131.94,143.93,153.02,157.58,158.70,160.63,201.05;元素分析(calcd.%)C15H10O4:C,70.86;H,3.96.测得:C,70.82;H,3.99.电喷雾质谱数据(ESI-MS)m/z255.0660,[CPC+H]+.
实施例2用紫外可见光谱测定Cys
配制pH=7.4的的HEPES（10mM）缓冲溶液，用乙醇配制2mM的CPC溶液，并配制2mM的Cys水溶液待测样；把2ml的HEPES缓冲溶液和35μl的CPC溶液加到干净的紫外比色皿中，在紫外可见分光光度仪上检测，320nm有最大吸收；取Cys溶液，逐渐用微量进样器加到此比色皿中，边加样边在紫外可见分光光度仪上检测，随着Cys的加入，最大吸收峰由320nm逐渐变为372nm，当372nm吸收峰达到最大值时，此时加入Cys的体积计为V待测；按35μl×2×10-3/V待测μl计算出Cys的含量为35mol/L。紫外可见吸收图见图1。
实施例3
把2mL pH7.4HEPES(10mM)的缓冲溶液和浓度为2mM﹑35μL的CPC乙醇溶液分别加到23个不同的紫外比色皿中，再分别加入1摩尔当量Cys、Hc y、GSH和20摩尔当量的其他氨基酸，在紫外可见光谱仪上检测，紫外可见吸收图见图2。
实施例4紫外可见光谱检测巯基丙酸（MPA）的方法：
配制pH=7.4的的HEPES（10mM）缓冲溶液，用乙醇配制2mM的CPC溶液，并配制2mM的MPA水溶液待测样；把2ml的HEPES缓冲溶液和35μl的CPC溶液加到干净的紫外比色皿中，在紫外可见分光光度仪上检测，320nm有最大吸收；取MPA溶液，逐渐用微量进样器加到此比色皿中，边加样边在紫外可见分光光度仪上检测，随着MPA的加入，最大吸收峰由320nm逐渐变为372nm，当372nm吸收峰达到最大值时，此时加入MPA的体积计为V待测；按35μl×2×10-3/V待测μl计算出MPA的含量为35mol/L。紫外可见吸收图见图3。
实施例5紫外可见光谱检测巯基乙醇（ME）的方法
配制pH=7.4的的HEPES（10mM）缓冲溶液，用乙醇配制2mM的CPC溶液，并配制2mM的ME水溶液待测样；把2ml的HEPES缓冲溶液和35μl的CPC溶液加到干净的紫外比色皿中，在紫外可见分光光度仪上检测，320nm有最大吸收；取谷胱甘肽，逐渐用微量进样器加到此比色皿中，边加样边在紫外可见分光光度仪上检测，随着谷胱甘肽的加入，最大吸收峰由320nm逐渐变为372nm，当372nm吸收峰达到最大值时，此时加入谷胱甘肽的体积计为V待测；按35μl×2×10-3/V待测μl计算出ME的含量为35mol/L。紫外可见吸收图见图4。
实施例6用荧光光谱测定Cys
配制pH=7.4的的HEPES（10mM）缓冲溶液，用乙醇配制2mM的CPC溶液，并配制2mM的Cys水溶液待测样；把2ml的HEPES缓冲溶液和10μl的CPC溶液加到干净的紫外比色皿中，取Cys溶液，逐渐用微量进样器加到此比色皿中，边加样边在荧光分光光度仪上检测，随着Cys的加入，455nm处荧光强度逐渐增强，当荧光强度不再变化时，停止加待测样。此时加入待测样的体积计为10μL；按10×2×10-3/10计算出Cys的含量为2×10-3（mol/L）。荧光发射图见图5。
实施例7细胞中荧光成像
用乙醇配制2mM的CPC乙醇溶液；将CPC乙醇溶液加入肝癌细胞培养液中，使得其浓度为50μM，与肝癌细胞HepG2在37°C下，反应0.5小时，体系在荧光共聚焦成像仪下显示了强的蓝色荧光，即为CPC与细胞中的硫醇作用发出了荧光。图6为荧光共聚焦成像仪下原始的肝癌细胞A和与CPC作用后的细胞B成像图,E和F分别为A和B的明场图像。

Claims (6)

1.一种香豆素色烯衍生物，其特征在于它是8,9-dihydro-2H-cyclopenta[b]pyrano[2,3-f]chromene-2,10(7aH)-dione，其结构式为：
Figure FDA00002563479100011
2.如权利要求1所述的一种香豆素色烯衍生物的合成方法，其特征在于，步骤为：香豆素醛和环戊烯酮按摩尔比1:1.1-3溶解在体积比为1:1的四氢呋喃和水的混合溶液中，在室温下搅拌72小时，用5-10倍体积的1M HCl稀释，并用乙酸乙酯萃取，有机相浓缩并被减压蒸干，然后用体积比1:4的乙酸乙酯和石油醚在硅胶色谱柱淋洗，蒸干即可得产品。
3.如权利要求2所述的一种香豆素色烯衍生物的合成方法，其特征在于，所述的香豆素醛和环戊烯酮按摩尔比为1:1.5。
4.一种检测硫醇的方法：其特征在于，步骤为：
（1）、配制pH=7.4、浓度为10mM的HEPES缓冲溶液，并用乙醇配制2mM的CPC乙醇溶液；
（2）、按体积比400:7将HEPES缓冲溶液和CPC乙醇溶液加到干净的紫外比色皿中，在紫外可见分光光度仪上检测，随着待测样的加入，372nm出现新的吸收峰并逐渐升高，当吸收峰不再升高时，停止加待测样，此时加入待测样的体积计为V待测样；
（3）、按VCPC×2×10-3/V待测样计算出待测样中硫醇的浓度（mol/L）。
5.一种检测硫醇的方法：其特征在于，步骤为：
（1）配制pH=7.4、浓度为10mM的HEPES缓冲溶液，并用乙醇配制2mM的CPC乙醇溶液；
（2）按体积比200:1将HEPES缓冲溶液和CPC乙醇溶液加到干净的紫外比色皿中，在荧光分光光度仪上检测，随着待测样的加入，455nm出现明显的荧光增强，且随着硫醇浓度的增大，荧光强度也增大，当强度不再增大时，停止加待测样，此时加入待测样的体积计为V待测样；
（3）按VCPCμl×2×10-3/V待测样μl计算出待测样中硫醇的浓度（mol/L）。
6.如权利要求1所述的香豆素色烯衍生物在细胞成像中的应用。
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