CN102972351A - 基于微流控芯片的秀丽隐杆线虫单卵捕获及培养方法 - Google Patents

Abstract

一种基于微流控芯片的秀丽隐杆线虫单卵捕获及培养方法，该芯片由两层PDMS组成，上层为液路层，用于线虫单卵捕获、长期培养及观测；下层为空白PDMS，与上层PDMS封接。该芯片利用微结构捕获线虫单个卵，并可在单个培养室中对其进行单独培养。所述的微流控芯片平台的线虫单卵捕获方法操作简单，并易于在线虫整个寿命周期内对其进行长期培养；该芯片可以实现营养物质的交换及代谢废物的排出，有利于线虫的长期培养，并可对单个线虫进行行为及成像的长期观察。

Description

基于微流控芯片的秀丽隐杆线虫单卵捕获及培养方法

技术领域

本发明涉及微流控领域，特别提供了一种基于通道微流控芯片的秀丽隐杆线虫单卵捕获及长期培养的方法。

背景技术

秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)是一种经典的模式生物，它被广泛用于现代发育生物学、遗传学、基因组学和神经生物学等领域。目前秀丽隐杆线虫的培养主要在阵列微孔板中或琼脂板上进行，即将线虫培养于96孔板或琼脂板，定期更换培养基或将线虫转移到新的琼脂板上。虽然线虫培养数量多，但是试剂和耗材消耗量大；针对线虫的操作采用手工进行，费时费力，通量低；操作步骤较为繁琐、复杂；难以实现对单个线虫整个生命历程的追踪观察。整体而言，随着线虫相关研究的发展，当前的模式生物技术的发展远不能满足现代生物医药研发的需要。开发一种新的更为高通量、自动化的单线虫培养新平台，实现培养技术的微型化、集成化和成本低廉化是未来发展的必然趋势，也是药物评价研究的发展需要。而近几年发展起来的微流控芯片平台恰恰可以满足这些要求，并已成为重要的单线虫研究工具之一。最近，微流控芯片因其与秀丽隐杆线虫尺寸匹配、环境可控、通量高、易于实现自动化、集成化等特征而成为线虫相关研究的重要平台，但仍为实现从卵开始的线虫整个生命过程的培养。

发明内容

本发明的目的在于提供一种操作简单、通量高的，具体说是一种基于PDMS（聚二甲基硅氧烷）通道微流控芯片的秀丽隐杆线虫单卵捕获及长期培养方法。

本发明提供了一种微流控芯片，该微流控芯片的材料均为PDMS聚合物，采用PDMS软刻蚀及等离子体不可逆封接技术构建，由上、下两层组成，上层为用于线虫单卵捕获及长期培养的液路层，下层为用于封接的空白PDMS层；

其中，液路层由100～200个线虫分析功能单元组成，所有功能单元串联连接；每个分析功能单元由线虫卵及药品入口、线虫培养室组成，每个线虫培养室中含有一个线虫单卵捕获器；

其中，线虫单卵捕获器位于线虫培养室的中心轴上；线虫卵及药品入口通过进样通道与线虫培养室连接，多个培养室由一条主通道连接起来，最后连接到废液池。

本发明提供的微流控芯片，所述线虫培养室为椭圆形，长轴为2mm，短轴为1mm，高度为80μm。

本发明提供的微流控芯片，所述线虫单卵捕获器的尺寸由线虫卵的大小和流体力学特征所决定。所述线虫单卵捕获器前端宽为50μm，后端宽为30μm；结构设计由由流体力学决定，线虫单卵捕获器后端倾斜角度为110°。

本发明还提供了一种基于所述微流控芯片的秀丽隐杆线虫单卵捕获及长期培养方法，线虫进样及培养方法为利用蠕动泵驱动的方式，将虫卵悬浮液引入线虫培养室；在流体力学的作用下，每个线虫培养室可捕获单个卵；在持续灌入培养液的条件下，卵孵化成幼虫并长大，线虫培养室的尺寸可使其在整个生命过程中自由游动。

本发明有以下优点：

(1)本发明采用通道设计，操作简单，且易于实现物质交换，有利于线虫的长期培养。

(2)采用通道灌流的方式进行食物添加及废液排出，操作简单，效率高，有利于线虫的长期培养。

(3)培养室同样作为线虫单卵捕获器，且捕获方式对虫卵无损伤，方法简单，通量高。

(4)单个培养室中培养单个线虫的设计使得每只虫的寿命、运动行为及生理特征得到实时及长期追踪，可满足生物研究的需要。

附图说明

图1芯片设计图，从上到下依次为液路层、空白PDMS层；其中1为线虫卵及药品入口，2为废液口；

图2单个线虫培养室放大图，其中虚线框中3为线虫单卵捕获器，箭头指示液流方向；

图3线虫单卵捕获多单元示意图；

图4线虫单卵捕获放大图；

图5捕获后第1天芯片上线虫（野生型N2）的生长(L1期)；

图6捕获后第3天芯片上线虫（野生型N2）的生长(L3期)；

图7捕获后第5天芯片上线虫（野生型N2）的生长(L4期)；

图8捕获后第7天芯片上线虫（野生型N2）的生长(Adult期，并产卵)。

具体实施方式

下面的实施例将对本发明予以进一步的说明，但并不因此而限制本发明。

实验室自行设计并制作的微流控芯片：制备用于秀丽隐杆线虫单卵捕获及长期培养的微流控芯片材料为PDMS聚合物，等离子体不可逆封接，该芯片由两层，上层为液路层，下层为用于封接的空白PDMS。

液路层由100～200个线虫分析功能单元组成，所有功能单元串联连接；每个线虫培养室为椭圆形，长轴为2mm，短轴为1mm，高度为80μm，(图2)可捕获单个卵，其中线虫单卵捕获器3(图2)位于线虫培养室的中心轴上，其尺寸由线虫卵的大小和流体力学特征所决定；线虫卵及药品入口1(图1)通过进样通道与线虫培养室连接，多个培养室由一条主通道连接起来，最后连接到废液池2(图1)。

使用前事先灌好线虫培养液K Medium。秀丽隐杆线虫野生型虫株N2在琼脂板上培养至大虫后，进行bleach操作将大量卵取出，并使加入到KMedium中形成虫卵悬浮液。

实施例1

利用实验室自行设计并制作的微流控芯片系统，构型如图1、2所示，利用蠕动泵将线虫卵悬浮液进样到培养室中。芯片共100～200个单元，各个单元相互独立，进样互不干扰，可达到单个培养室都只有单个卵。

实施例2

利用实验室自行设计并制作的微流控芯片系统，将线虫野生型N2拟合至成虫期后进行bleach操作得到大量卵，将卵分散在K Medium中引入芯片中，单个线虫卵被捕获在单个培养室中，如图3和图4所示。捕获后第1天，卵在K Medium培养基中孵化成L1期幼虫，见图5。经过培养，在第3天长到L3期，第5天长到L4期，第7天长成成虫并产卵。线虫在芯片上生长、运动、产卵等生理行为正常，显示该芯片微环境适于线虫长期培养，验证了该平台可行性。

Claims (6)

1.一种微流控芯片，其特征在于：该微流控芯片由上、下两层组成，上层为液路层，下层为空白PDMS层；

其中，液路层由100～200个线虫分析功能单元组成，所有功能单元串联连接；每个分析功能单元由线虫卵及药品入口、线虫培养室组成，每个线虫培养室中含有一个线虫单卵捕获器；

其中，线虫单卵捕获器位于线虫培养室的中心轴上；线虫卵及药品入口通过进样通道与线虫培养室连接，多个培养室由一条主通道连接起来，最后连接到废液池。

2.按照权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于：所述线虫培养室为椭圆形，长轴为2mm，短轴为1mm，高度为80μm。

3.按照权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于：所述线虫单卵捕获器的尺寸由线虫卵的大小和流体力学特征所决定。

4.按照权利要求3所述的微流控芯片，其特征在于：所述线虫单卵捕获器前端宽为50μm，后端宽为30μm；结构设计由流体力学决定，线虫单卵捕获器后端倾斜角度为110°。

5.按照权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于：所述微流控芯片的材料均为PDMS聚合物，采用PDMS软刻蚀及等离子体不可逆封接技术构建。

6.一种基于权利要求1所述的微流控芯片的秀丽隐杆线虫单卵捕获及培养方法，其特征在于：线虫进样及培养方法为利用蠕动泵驱动的方式，将虫卵悬浮液引入线虫培养室；在流体力学的作用下，每个线虫培养室可捕获单个卵；在持续灌入培养液的条件下，卵孵化成幼虫并长大，线虫培养室的尺寸可使其在整个生命过程中自由游动。

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