CN102970996A - 用于减轻汞毒性的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了包含褪黑激素和锌的组合物。还提供了包含所述组合物的剂型和所述组合物和剂型的制备方法。提供了从受试者体内除去汞的方法，作为治疗和/或预防与汞毒性相关的一些病症的方法。

Description

用于减轻汞毒性的组合物和方法

相关申请的交叉参考

本申请要求2010年5月25日提交的美国临时申请号US 61/347,819的利益，将该文献的公开内容完整地引入本文参考。

发明背景

孤独性谱群疾病(autism spectrum disorder,“ASD”)是一系列心理性病症，其特征在于社会关系和沟通广泛异常以及受限的兴趣和反复性行为。ASD的5种形式包括典型孤独症、阿斯波哥尔综合征（Asperger syndrome）、未有特殊说明的广泛性发育障碍(PervasiveDevelopmental Disorder,“PDD-NOS”)、雷特综合征和童年瓦解性障碍。孤独症形成了孤独性谱群疾病的核心。阿斯波哥尔综合征在体征和有可能的原因方面最接近孤独症，然而，不同于孤独症，患有阿斯波哥尔综合征的人在语言发展方面没有显著的迟缓。当标准不满足更具体的障碍时，诊断为PDD-NOS。一些来源还包括雷特综合征和童年瓦解性障碍，其与孤独症共有几个体征，但可能具有不相关的原因，其他来源将ASD与这两种病症合并成广泛性发育障碍。根据英国国家孤独症协会(National Autistic Society)的规定，病理性要求回避综合征属于并且正在逐步地被视为孤独性谱群。

孤独症是特征在于社会关系和沟通受损以及受限的和反复性行为的神经发育障碍。这些体征均在儿童3岁以前开始。孤独症通过改变神经细胞及其突触如何连接和组织化影响脑中的信息加工，这种情况是如何发生的尚不了解。

褪黑激素是在动物、植物和微生物中发现的天然存在的化合物。在动物中，激素褪黑激素的循环水平在每日周期中可变，由此能够传输几种生物学功能的昼夜节律。褪黑激素的许多生物效应通过活化褪黑激素受体产生，而其他效应是因其作为普遍的和强有力的抗氧化剂的作用导致，其中在保护核和线粒体DNA中具有特别的作用。

在哺乳动物中，褪黑激素由脑中的松果腺分泌入血液。它还可以由各种周围细胞例如骨髓细胞、淋巴细胞和上皮细胞产生。通常褪黑激素在这些细胞中的浓度远高于在血液中发现的浓度，但其似乎不通过光周期调节。

此外，褪黑激素在整个胃肠道（GI）中产生。不同于在松果体中，在其中褪黑激素的产生和释放由环境光的减少刺激（即“睡眠”信号），GI褪黑激素的释放由食物的存在刺激。褪黑激素与细胞传导有两种主要机制。一种是直接，通过其与膜与核受体的相互作用。此外，数据表明，褪黑激素是所谓核的“类视黄醇的孤儿受体”（retinoid orphanrececeptor,ROR）的内源性激动剂。受褪黑激素刺激，ROR是调节许多生化过程的重要组成部分。从ROR开始，过多的基因被激活/调节，因此，激素、细胞因子、神经递质和生物学相关的大分子以协调的、周期性的（昼夜）方式在白天/晚上整个过程中产生和释放。总之，大脑松果体褪黑激素所发挥的作用是以胃肠系统为中心的更大的系统的一部分。

汞(由符号Hg表示)是毒性重金属。卫生和人类服务部(Department of Health and Human Services)内的毒性物质和疾病登记联邦管理局(The federal Agency for Toxic Substances andDisease Registry)(ATSDR)举出了汞作为在美国最具有毒性的物质。它并非罕见或分离出的化合物，就绝对量而言，它被分类为位于铅和砷之后的第三最普遍的环境毒物。它所呈现出的危险是通过以下事实多次倍增的：几乎任何和所有类型的在其自身食物来源中摄入低水平汞的鱼、家禽和家畜类将汞集中于其肉和/或脂肪沉积中。这导致大量类型的主要是人类膳食成分的肉中汞处于潜在危险的水平。

简言之，汞主要通过两种不同机制杀伤细胞。

(i)它可以使几乎所有类型的蛋白质“变性”(且由此使其失活)；和

(ii)它生成“活性氧”(ROS)，其然后攻击和损伤或破坏大量类型的生物分子。

此外，研究已将汞毒性与一些病症关联起来，包括但不限于孤独性谱群疾病。

发明概述

在一些方面，本发明涉及包含褪黑激素和锌的组合物。

在其他方面，本发明涉及包含所述组合物的剂型。

本发明的另外的方面涉及从受试者体内除去汞的方法。

本发明的其他方面涉及治疗和/或预防与汞毒性相关的病症的方法。

本发明的其他方面涉及本文所述组合物和剂型的制备方法。

发明详述

本发明的一些实施方案涉及用于从受试者体内除去汞的组合物和方法。在本发明的一些实施方案中，提供了治疗和预防与汞毒性相关的病症的营养方法。

研究证明在GI道中，存在生成和维持的平衡，其中肠的肠嗜铬细胞产生的褪黑激素进入内脏循环并且转运至肝；由此肝将褪黑激素分泌入胆汁，转运回肠以重复该循环。这种所谓的″肠肝循环″是GI道中褪黑激素的主要间接激素作用的基础。在这种肠肝循环内，褪黑激素在它与痕量金属(主要是锌和铜)复合时作为″金属伴侣″（″metallochaperone″）起作用，有利于其从GI道中吸收且递送至肝。一旦在肝内，则褪黑激素-金属复合物解离，以释放脱辅蛋白质附近的金属，最终产生全功能金属蛋白质。锌金属蛋白质包括大量重要的大分子；例如，基质金属蛋白酶（matrixmetalloprotinase）、DNA/RNA聚合酶和修复酶、碳酸酐酶、氨基/羧基转肽酶和醇脱氢酶。

作为二价阳离子，汞有效地与锌(和铜)竞争结合褪黑激素，当汞结合褪黑激素时，相对重的复合物不被重吸收和转运至肝，而是保留在肠的粪便内容物中，以便消除。通过防止汞(和其他重金属)对GI道的有害效应，使褪黑激素从体内消失，这就必须产生更多的褪黑激素以维持内源性浓度。尽管不期望受到任何操作理论约束，但是由于多种原因，所以一种或多种亚群可能缺乏再生足量褪黑激素以维持平衡的能力，且由此代表了倾向于发生疾病(包括但不限于孤独症、阿尔茨海默病和帕金森病)的那些群体，它们部分是因环境重金属所致。这种亚群还代表了那些可以得益于给予包含褪黑激素的组合物的那些群体。

摄入本文所述的包含褪黑激素的组合物可以：(a)给治疗的受试者提供有效的螯合汞和除去汞的化合物；和/或(b)给治疗的受试者提供足够供给的胃肠褪黑激素以恢复适当和健康的胃肠褪黑激素功能和活性，它们可以与锌和一些其他矿物质发生相互作用。照此，本发明的一些实施方案涉及使用褪黑激素治疗和/或预防一些病症的组合物和方法。这样的组合物和方法可以恢复褪黑激素在胃肠道内的天然和健康浓度。

在一些实施方案中，褪黑激素可以与一些另外的成分结合使用。另外的成分包括但不限于锌和铜。不同的实施方案可以包括褪黑激素与矿物质以特定比例的组合。

一些实施方案提供了包含褪黑激素-锌复合物的组合物。另外，在一些实施方案中，所述的组合物还可以包含益生菌材料。

因此，本发明的一个实施方案包括包含褪黑激素和锌的组合物。优选锌可以作为至少一种其药学可接受的盐提供。在优选的实施方案中，锌的形式可以选自锌、乙酸锌、葡糖酸锌、柠檬酸锌、氯化锌及其组合。在一个优选的实施方案中，褪黑激素和锌以约1:1－约1:1.2的摩尔比(即二价锌的可能的摩尔过量)混合。优选褪黑激素和锌以约1:1的摩尔比存在。

在一个优选的实施方案中，褪黑激素和锌是粉末形式且混合成粉状混合物。可以将所述粉状混合物与足以产生颗粒的量的至少一种赋形剂配制。可以用于该目的的常用赋形剂包括但不限于碳水化合物材料。优选碳水化合物材料是粉末形式。可以用于该目的的碳水化合物的一个实例是乳糖(lactose)，也称作乳糖(milk sugar)。另外的实例包括但不限于纤维素衍生物和马铃薯淀粉。应关注将肌醇六磷酸也称作植酸(或作为其离子化形式，植酸盐)的存在减至最少。已知该化合物与锌和其他二价阳离子形成复合物，且由此可以干扰其生物利用度。由于这一原因，一些材料可能较不适合于该目的，例如，玉米淀粉，因为已知肌醇六磷酸由玉米产生且可以作为污染物存在于玉米中。

优选可以用肠溶衣给所述颗粒包衣。在一些实施方案中，可以将肠溶包衣颗粒包囊在胶囊内。优选明胶胶囊可以用于包囊。

在一些实施方案中，将锌和褪黑激素彼此预混合，然后使其变得有效地彼此结合。在一个优选的实施方案中，用肠溶衣给所述混合物包衣，能够无损地通过胃酸，然后在小肠内吸收，这可以防止褪黑激素受到胃酸降解，还可以将胃中酸驱动的锌离子与褪黑激素解离减少到最低限度。

“肠溶衣”是指施加于口服药物上的屏障，它能够控制在其被吸收所在的消化系统中的位置。“肠”是指小肠，由此肠溶衣防止药物在其达到小肠前释放。

大部分肠溶衣通过提供一种表面起作用，该表面在胃中发现的高度酸性pH下稳定，而在酸性较低(相对更碱性)pH下快速崩解。例如，它们在酸性胃液(pH~3)中不溶解，而小肠中存在的碱性(约pH 5-9)环境中溶解。就本发明的实施方案而言，用于肠溶衣的材料可以包含任何适合的包衣衣料，其优先在肠中溶解(即在高于胃内容物的pH下)。这种材料包括但不限于脂肪酸、蜡、虫胶、塑料、植物纤维、聚合物及其组合。优选的材料是pH-敏感性丙烯酸聚合物树脂的分散体；例如EASTACRYL

(Eastman Chemical Co.)。

在一些实施方案中，所述的组合物还可以包含治疗有效量的铜。

因此，本发明的另一个实施方案涉及包含褪黑激素、锌和铜的组合物。在不同的实施方案中，褪黑激素、锌和铜成分的摩尔比分别为约5:5:1；约6:6:1、约7:7:1、约8:8:1、约9:9:1或约10:10:1。优选分别以约5:5:1的摩尔比混合褪黑激素、锌和铜成分。

在另一个优选的实施方案中，褪黑激素、锌和铜成分是粉末形式且混合成粉状混合物。可以将所述粉状混合物与足以产生颗粒的量的至少一种赋形剂配制。优选可以用肠溶衣给所述颗粒包衣。优选肠溶衣包含优选肠溶衣还可以包含另外的溶于小肠上部的包衣衣料。

在一个优选的实施方案中，将包肠溶衣的颗粒包囊在胶囊中，优选包囊在明胶胶囊中。可以将足量的颗粒放入每粒胶囊中以维持最终的褪黑激素、Zn和Cu的摩尔比。在一个优选的实施方案中，当作为元素重量测定时，基于其分子量，递送适合的摩尔比的相应的褪黑激素、乙酸锌和Cu的量分别为约50mg、约15mg和约3mg。在其他实施方案中，可以调整这些重量，以补偿可以用于所述组合物的各种锌盐的分子量差异。

当用肠溶衣配制本文所述的组合物时，肠溶衣防止组合物中的成分受到胃的有害酸性环境影响。在通过胃输送后，肠溶包衣颗粒进入十二指肠(小肠的上部)，在那里它们遇到胆汁分泌物。胆汁分泌物富含碳酸氢盐，它中和从胃中出现的来自胃内容物的酸，并且导致十二指肠的腔中的物质变成弱酸性，其中pH大于约5。因此，在这种相对较高pH下，肠溶衣溶解，从而能够溶解颗粒，导致从小肠腔中吸收例如褪黑激素、Zn和Cu这样的成分。

在本发明另外的实施方案中，组合物中提供的褪黑激素和锌可以是褪黑激素-锌复合物形式。适合于口服给药的稳定的含锌复合物的实例是美国专利US4,981,846中所述的聚普瑞锌（polaprezinc）。在一个优选的实施方案中，可以通过在过量碱的存在下将可溶性锌盐加入到褪黑激素的碱性溶液中形成褪黑激素-锌复合物。尽管不期望受到任何操作理论以约束，但是这种复合物可以如下形成。褪黑激素的结构具有氮和氧原子，它们因非共享电子对而是负电性的。在褪黑激素结构中，氧上的电子对可用于与其他分子发生相互作用(例如与水分子的氢键合)，并且通过离子相互作用形成共振结构。然而，二价锌带有两个正电荷，且为了形成共振-稳定复合物，它需要两个与大分子发生相互作用的位点。就褪黑激素而言，与锌相互作用的第二个位点由附近杂环中的仲氮的电子提供。不同于稳定双键中的这些电子的氧，氮以质子化形式存在(即带有氢原子，其与氮共有离子键)。为了暴露这些电子以便为锌提供停泊位点（docking site），氢需要从氮上除去，且这一过程通过将褪黑激素溶于碱性介质(即含有氢氧化钠、氢氧化钙或其他适合的碱性物质的水溶液)来进行。在这种环境中，碱有效地从氮上除去氢，由此暴露了可用于与随后加入的锌发生相互作用的电子。

另外的实施方案包括从受试者体内除去汞的方法。

在其他实施方案中，本发明涉及使用益生菌营养补充剂的组合物和治疗方法，所述益生菌营养补充剂包含或表达一些类型的微生物酶，这些酶能够将有害的汞离子形式(Hg⁺和Hg²⁺)转化成不带电荷的汞原子(Hg⁰)，其可以被身体以气态形式排出，例如从肺中排泄在空气中。在一些实施方案中，组合物可以包含酶制剂，其具有防止酶受到胃酸降解的肠溶衣。在另外的实施方案中，组合物可以包含在小肠内再生并且表达解汞毒的酶的活肠细菌细胞。

已经鉴定了特定群体的细菌酶，它们由称作“mer操纵子”的一组基因产生。由该操纵子编码的一种酶是“汞还原酶”(“MR”)。它催化高度毒性的二价离子Hg ²⁺还原成不带电荷和毒性远低的Hg⁰。MR酶由命名为merA的基因表达。

此外，一些类型的细菌还表达称作有机汞裂解酶(“OL”)的酶。该酶将裂解汞的有机形式，例如甲基汞，以释放Hg²⁺阳离子，其然后可以被汞还原酶转化成Hg⁰。OL由merB基因编码和表达。

mer操纵子内的一些其他基因编码移位酶蛋白质，包括命名为merB和merC的蛋白质，它们有利于汞化合物移动通过细胞膜，由此促进它们与OL和MR酶的相互作用。因此，由merB和merC基因表达的蛋白质通过多步骤过程对MR活性提供协同作用支持，包括：(i)汞化合物的细胞吸收增加；(ii)有机汞化合物裂解以释放Hg²⁺离子；和(iii)将毒性Hg²⁺离子还原成毒性远低的Hg⁰元素形式，它可以被身体以气态形式从肺排泄在空气中。

本发明的一些实施方案包括包含褪黑激素、锌和益生菌材料的组合物。益生菌材料可以包括但不限于细菌和/或酵母的天然、半合成或转基因菌株。益生菌材料可以包含或表达一些解汞毒性的酶，例如但不限于有机汞裂解酶和汞还原酶。

在一些实施方案中，提供了包含褪黑激素、锌、铜和益生菌材料的组合物。另外的实施方案提供了包含褪黑激素-锌复合物和益生菌材料的组合物。

在一些实施方案中，本发明提供了包含本文所述的组合物的剂型。用于口服给药的固体剂型可以包括但不限于胶囊、片剂、丸剂和颗粒。

优选将颗粒用于一些患者，例如儿童，他们对较大剂型可能存在吞咽困难。在一个优选的实施方案中，为了便于精确给药，将所需数量的颗粒转入标准胶囊，并且在摄入时，患者可以选择打开胶囊并且将内容物分散于适合的食物，例如苹果沙司，其具有足够的酸性以便在摄入前即刻保护颗粒肠溶衣。或者，可以将具有颗粒内容物的完整的标准胶囊作为单剂量摄入，从而推定该患者不存在吞咽胶囊的困难。

在一个优选的实施方案中，所述的剂型包含胶囊内包含的活性成分的组合。优选胶囊包含明胶。所述胶囊可以是硬胶囊或软胶囊。

本发明的其他实施方案包括治疗和/或预防与汞毒性相关的病症的方法。这种病症可能与褪黑激素和/或锌耗尽相关。实施方案包括治疗和/或预防受试者病症，所述的病症选自孤独症、孤独性谱群疾病、阿尔茨海默病和帕金森病。另外的实施方案包括治疗和/或预防选自炎症、线粒体功能障碍和锌缺乏的病症的方法。本发明的另一个实施方案包括治疗和/或预防与接触环境重金属相关的病症的方法。

上述治疗/预防方法可以包括对有此需要的受试者给予治疗有效量的本文公开的任意组合物。

本文所用的术语″受试者″用于指动物，包括但不限于鱼、鸟类和哺乳动物，包括人。术语″患者″和″受试者″可以互换使用。

另外，本文所用的“治疗有效量”应指对有这种治疗需要的大量受试者给予的活性剂或成分的提供特定的药理学响应的剂量。需要强调的是，在具体情况中对特定受试者给予的“治疗有效量”并非始终在治疗或预防本文所述的病症中有效，即使本领域技术人员认为这种剂量是“治疗有效量”。

本申请的治疗组合物的配制和给药技术可以在最新版“Remington′s Pharmaceutical Sciences,”Mack Publishing Co.,Easton,Pa中找到。当以单独给药的方式给个体施用各活性成分或活性剂时，治疗有效剂量是指该单独的成分。当应用于组合时，治疗有效剂量是指产生治疗效果的活性成分的合并用量，无论是以组合方式、依次方式还是同时方式给药。

当治疗或预防任意举出的病症或症状时，可以优选通过口服给予本文所述的组合物。优选可以每日一次、两次、三次或四次给予所述组合物。优选与膳食一起口服摄入所述组合物，以模拟在GI道中食物的存在下褪黑激素的生理释放。优选的剂量为每日四次；优选与每次膳食一起一次和在睡时一次。

在不同的实施方案中，可以对受试者给予本文所述剂量的组合物，根据每剂量每kg重量受试者的组合物中褪黑激素的量计算的其用量至少为约0.01mg；例如，提供每剂量约0.01mg/kg－约10mg/kg褪黑激素或约0.02mg/kg－约0.5mg/kg褪黑激素的组合物的剂量范围。优选的剂量是提供约0.1mg/kg褪黑激素。根据提供的摩尔比，在本文所述的组合物中可以包括一种或多种另外的成分(例如锌、铜)。优选可以将所述剂量每日给予一次、两次、三次或四次。例如，正如根据医师所确定的，确切剂量方案依赖于个体患者的响应。

本发明的其他实施方案包括本文所述的不同组合物和剂型的制备方法。优选通过一种方法制备剂型，该方法包括组合粉末形式的褪黑激素和锌以形成粉状混合物。摩尔比可以在约1:1－约1:1.2。优选褪黑激素和锌之比为约1:1。优选可以将所述粉状混合物与足以形成颗粒的量的至少一种惰性赋形剂组合。优选可以用在大于或等于约5的pH下的介质中溶解的材料给所述颗粒包衣。在一些实施方案中，可以将包衣颗粒包囊在胶囊中。优选胶囊包含明胶。

下文举出的下列非限制性实施例示例本发明的一些方面。

实施例

实施例1.褪黑激素和锌在ASD患者中的效力评价方案

本实施例包括可以基于在提交本申请时本领域技术人员对本说明书的描述进行的模拟试验和预测结果。患有孤独症或ASD的年龄在3－10岁之间的具有父母或教师关注表面行为和父母或临床医师关注胃肠病学问题的男性和女性儿童用于本预示性实施例。特别地，儿童显示如下特征：(1)儿童年龄在3－10岁且被诊断为ASD；(2)父母或教师关注表面行为(具有CBCL外表表现t分数>65)；(3)父母或临床医师具有胃肠病学方面的关切(便秘、腹泻、恶心、呕吐、腹部疼痛、低体重指数、食物耐受不良)；(4)1周膳食日志启示年龄典型的纤维、蛋白质、脂肪、卡路里和营养摄入(没有数值超过2的来自平均值的标准偏差)。

通过使用由标准行为测试方法确定的从基线－第7周/终止的行为评价观察受试者中的行为改变测定褪黑激素和锌组合物的效力，所述的测试方法包括：(1)CBCL；(2)孤独症治疗评价清单(AutismTreatment Evaluation Checklist)(ATEC)(Lonsdale,D.,Shamberger,R.J.,and Audhya,T.(2002).Treatment of autismspectrum children with thiamine tetrahydrofurfuryl disulfide:apilot study.Neuro.Endocrinol.Let t.23,303-308.;Charman,T.,Howlin,P.,Berry,B.,and Prince,E.(2004).Measuringdevelopmental progress of children with autism spectrum disorderon school entry using parent report.Autism.8,89-100;Ratliff-Schaub,K.,Carey,T.,Reeves,G.D.,and Rogers,M.A.(2005).Randomized controlled trial of transdermal secretin onbehavior of children with autism.Autism.9,256-265;Coben,R.,and Myers,T.E.(2010).The relative efficacy of connectivityguided and symptom based EEG biofeedback for autistic disorders.Appl.Psychophysiol.Biofeedback.35,13-23;Meiri,G.,Bichovsky,Y.,and Belmaker,R.H.(2009).Omega 3 fatty acid treatment inautism.J.Child Adolesc.Psychopharmacol.19,449-451)；(3)行为-严重性的临床综合印象(Clinical Global Impressions ofBehavior Severity)(CGI-S)和(4)行为-改善的临床综合印象(Clinical Global Impressions of BehaviorImprovement)(CGI-I)。二次结果测定包括基线至第7周/终止值的改变，所述的改变为如下的值：(1)通过测定单一口服剂量的这些碳水化合物后尿乳果糖:甘露糖醇比例的改变评价的G I通透性(D′Eufemia,P.,Celli,M.,Finocchiaro,R.,Pacifico,L.,Viozzi,L.,Zaccagnini,M.,Cardi,E.,and Giardini,O.(1996).Abnormalintestinal permeability in children with autism.Acta Paediatr.85,1076-1079);(2)通过测定粪便钙网蛋白水平评价的GI炎症(Boso,M.,Emanuele,E.,Minoretti,P.,Arra,M.,Politi,P.,Ucellidi,N.S.,and Barale,F.(2006).Alterations of circulatingendogenous secretory RAGE and S100A9 levels indicatingdysfunction of the AGE-RAGE axis in autism.Neurosci.Lett.410,169-173;deMagistris,M.L.,Familiari,V.,Pascotto,A.,Sapone,A.,Frolli,A.,Iardino,P.,Carteni,M.,De,R.M.,Francavilla,R.,Riegler,G.,Militerni,R.,and Bravaccio,C.(2010).Alterations of the Intestinal Barrier in Patients With AutismSpectrum Disorders and in Their First-degree Relatives.J.Pediatr.Gastroenterol.Nutr.)；(3)喂养和胃肠病学清单的总体和次级分数改变；(4)高度百分数改变；(5)重量百分数改变；(6)体重指数百分数改变；(7)临床化学参数，包括血清锌、血浆铜的浓度和血浆5’-核苷酸酶活性；ASMT基因中的特异性单核苷酸多态性(SNPs)的基因组评价。

筛选/基线评估包括神经发育/精神病的总的评价；身体障碍的评价；药物和补充治疗史；孤独症诊断的确认(使用孤独症诊断观察方案(Autism Diagnostic Observation Schedule))；行为测定；特异性实验室测试；胃肠道问题评价；膳食评价；自杀性评价；日间嗜睡确定。

一旦确定儿童满足必要的标准，则将其指定入治疗组(1组)或安慰剂组(2组)。1组中的受试者接受0.10mg褪黑激素+0.03mg二水合乙酸锌/kg/每日四次剂量的目标剂量，而2组中的受试者接受每日四次安慰剂。将药物作为肠溶包衣颗粒提供，其可在口服给药前分散于食物中。

就第1周而言，对儿童在每日睡时给予单剂量的研究药物，持续1周。在7天间隔(±2天)进行剂量按比例增加的随访评价，持续至少3周；在每周随访时，评价儿童间隔期行为、胃肠病学和医疗改变；引出、记录和控制不良反应；引出和记录伴随的药物；完成行为清单；任何自杀性趋向评价；日间嗜睡评价。

在每次随访时，根据治疗效果确定最适合的剂量调整：

(1)不耐受：与研究干预相关的6或7的CGI-I分数或存在不具有可利用的研究允许的补救的不良反应(例如需要不允许的药物)。基于研究人员的临床决定，降低研究药物剂量或中断研究药物。

(2)可治疗：与短暂或可医治的关切相关的6或7的CGI-I分数或短暂或具有可利用的研究允许的药物的不良反应。研究药物可以根据研究人员的判断减少、中断或维持。

(3)不足：胃肠病学或行为状态改变程度最低或没有显著改变(在喂养和胃肠病学清单中没有临床显著性改善与3、4或5的CGI-I分数)，没有临床显著的不良反应。将研究药物增加至下一个可利用的剂量，不超过治疗组的最大剂量。

(4)充足：胃肠病学或行为状态临床显著改善(在喂养和胃肠病学清单中临床显著性改善和/或2的CGI-I分数)，没有临床显著的不良反应。根据研究人员的判断，可以将研究药物维持在目前剂量或可以增加(试图达到最佳状态)至下一个可利用的剂量，不超过治疗组的最大剂量。

(5)最佳：胃肠病学或行为状态临床显著改善(在喂养和胃肠病学清单中临床显著性改善和1的CGI-I分数)，没有临床显著的不良反应。维持研究药物。

当研究人员评价儿童符合分类(2)的可医治标准时，可以将逐步递增的方法（titration process）再延长1周以允许最佳的递增。例如，如果在第2周增加研究药物且儿童显示适度的日间催眠状态，则研究人员可以将治疗分类评价为(2)可医治，并且可以将当前剂量再持续一周以确定当儿童变得“适应”药物时日间催眠状态是否解决。

预期的给药方案.在基线，在睡时给予儿童0.1mg/kg(1组)或安慰剂(2组)，持续1周。然后在第1周随访时，在早晨和在睡时给予儿童0.1mg/kg或安慰剂，持续1周。在第2周随访时，在早晨、午餐时间和在睡时给予儿童0.1mg/kg或安慰剂，持续1周。在第3周随访时，在早晨、午餐时间、晚餐时间和在睡时给予儿童0.1mg/kg或安慰剂。

表2:研究活动计划表

基线

第1周

第2周

第3周

第4周

第7周

期限后

研究后

VS

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DEval

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MEval

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PriorP

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PriorG

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ADOS

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ABC

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CGI-S

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CGI-I

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F-cal

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M:L

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Labs

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SNPs

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Diary

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FGC

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C-SSRS

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CHQ

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ESS

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MedDisp

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MedColl

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AE

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ConMed

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TE

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-生命体征、生长参数、体重指数计算(VS)

-神经发育、发育-行为或儿童精神病学评价(DEval)

-具有全身、医学史和身体检查综述的儿科综合医学评价(MEval)

-心理和精神药理学治疗前综述(PriorP)

-胃肠病治疗前综述(PriorG)

-孤独症诊断观察方案(ADOS)

-异常行为清单(ABC)

-行为-严重性的临床综合印象(CGI-S)

-行为-改善的临床综合印象(CGI-I)

-粪便钙网蛋白水平(F-cal,隔周2次（two times one weekapart）)

-尿甘露糖醇/乳果糖之比(M:L)

-实验室(血清[Zn]、血浆[Cu]、血浆5′核苷酸酶活性、血清脂质过氧化)。

-与褪黑激素生物化学相关的基因中的单核苷酸多态性(SNPs)分析

-食物日志和建立、随后由合乎标准的营养学家确定的咨询/评价(Diary)

-喂养和胃肠病学清单(FGC)

-Columbia自杀严重性等级量表(C-SSRS)

-儿童健康问卷-父母表格50(CHQ)

-Epwor th睡眠评分法(ESS)

-调配研究药物(MedDis)

-收集研究药物

-引出和记录不良反应(AE)

-引出和记录伴随的药物(ConMed)

-治疗效果评价(TE:不耐受、可医治、不足、充足、最佳)

如果儿童在较低剂量下达到其最佳的有益性或最大耐受剂量(即在较早的一周)，则将该剂量持续至递增期结束时。维持期开始于该剂量下的第4周。

维持期开始于第4周评价，其包括：评价间隔行为、胃肠病学和医学改变；引出、记录和控制不良反应；引出和记录伴随的药物；完成行为清单；得到特定实验室测试，包括峰值谷值pK褪黑激素水平；评价胃肠病学问题；评价膳食；评价任何自杀趋向；确定日间嗜睡。

维持期结束于第7周/终止评价，其包括：评价间隔行为、胃肠病学和医学改变；引出、记录和控制不良反应；引出和记录伴随的药物；完成行为清单；得到特定实验室测试，包括峰值谷值pK褪黑激素水平；评价胃肠病学问题；评价膳食；评价任何自杀趋向；确定日间嗜睡。

在第7周/终止评价时，提供给家庭中断研究药物的方案：在第7周/终止随访后的1–3天，在早晨、午餐时间、晚餐时间和在睡时给予儿童0.1mg/kg(1组)或安慰剂(2组)。在第7周/终止随访后的4–6天，在早晨和在睡时给予儿童0.1mg/kg或安慰剂。在第7周/终止随访后的7–9天，在睡时给予儿童0.1mg/kg或安慰剂。在第7周/终止随访后的第10天，第一次终止研究药物。在终止给药和无标签剂量组时，作为可选的方案，患者可以选择在本研究的标签公开期中持续使用研究药物治疗。在选择这种选择的情况下，患者持续接受预先给予的剂量方案(每日4次剂量)。

在终止后的随访(在第7周/终止随访后的第13天±2天)时，评价儿童的行为、医学和胃肠病学改变，引出、记录和控制不良反应，引出和记录伴随的药物。最后剂量的研究药物后35天±5天，进行研究后电话访问或研究随访。此时，评价儿童的行为、医学和胃肠病学改变，引出、记录和控制不良反应，引出和记录伴随的药物。

统计学.就个体治疗分支而言，对最初的端点计算从基线到第1、2、3、4和7周的中位值和平均值改变的点评估值与相关的置信区间。由此主要根据期望的端点的参数评估值的精确值及其相关的变异值启动计划的样品大小。

临床化学评价.基于分别通过ELISA和AAS测定的血浆和尿浓度评价MEL和锌的全身生物利用度。根据是脂质过氧化作用标志的丙二醛（MDA）产生的改变以实验方式测定MEL和锌的药效学和效力，作为其抗氧化剂活性的证据(Kedziora-Kornatowska,K.,Szewczyk-Golec,K.,Czuczejko,J.,van Marke de,L.K.,Pawluk,H.,Motyl,J.,Karasek,M.,and Kedziora,J.(2007).Effect ofmelatonin on the oxidative stress in erythrocytes of healthyyoung and elderly subjects.J.Pineal Res.42,153-158;Velkov,Z.A.,Velkov,Y.Z.,Galunska,B.T.,Paskalev,D.N.,and Tadjer,A.V.(2009).Melatonin:Quantum-chemical and biochemicalinvestigation of antioxidant activity.Eur.J.Med.Chem.44,2834-2839)。此外，还评价了锌补充对血浆中锌-依赖性酶5’-核苷酸酶活性的效应(Bales,C.W.,DiSilvestro,R.A.,Currie,K.L.,Plaisted,C.S.,Joung,H.,Galanos,A.N.,and Lin,P.H.(1994).Marginal zinc deficiency in older adults:responsiveness of zincstatus indicators.J.Am.Coll.Nutr.13,455-462)。通过ELISA、使用商购测试试剂盒测定粪便钙网蛋白。

通过测定口服给药后乳果糖和甘露糖醇的尿回收，评价肠通透性。尿中乳果糖与甘露糖醇之比被广泛接受为肠通透性的测量值(Camiller i,M.,Nadeau,A.,Lamsam,J.,Nord,S.L.,Ryks,M.,Burton,D.,Sweetser,S.,Zinsmeister,A.R.,and Singh,R.(2010).Understanding measurements of intestinal permeability in healthyhumans with urine lactulose and mannitol excretion.Neurogastroenterol.Motil.22,e15-e26;Benjamin,J.,Makharia,G.K.,Ahuja,V.,Kalaivani,M.,and Joshi,Y.K.(2008).Intestinal permeability and its association with the patient anddisease characteristics in Crohn′s disease.WorldJ.Gastroenterol.14,1399-1405;Vilela,E.G.,Torres,H.O.,Ferrari,M.L.,Lima,A.S.,and Cunha,A.S.(2008).Gutpermeability to lactulose and mannitol differs in treated Crohn′sdisease and celiac disease patients and healthy subjects.Braz.J.Med.Biol.Res.41,1105-1109)，并且是儿科患者充分耐受的(Hamilton,I.,Hill,A.,Bose,B.,Bouchier,I.A.,and Forsyth,J.S.(1987).Small intestinal permeability in pediatric clinicalpractice.J.Pediatr.Gastroenterol.Nutr.6,697-701)。简言之，对受试者单一口服给予包含5g乳果糖和2g甘露糖醇的100ml溶液，并且在摄入后采集尿5小时。如上所述通过高效液相色谱法测定尿中乳果糖和甘露糖醇的浓度(Vilela,E.G.,Torres,H.O.,Ferrari,M.L.,Lima,A.S.,and Cunha,A.S.(2008).Gut permeability tolactulose and mannitol differs in treated Crohn′s disease andceliac disease patients and healthy subjects.Braz.J.Med.Biol.Res.41,1105-1109)。研究显示，作为组，具有正常GI功能的健康儿童典型地显示出低于0.035的乳果糖:甘露糖醇之比的尿平均值。

基因组学评价.基因组学评价评估可能在患有ASD的患者中的特异性甲基转移酶基因的表达(Ca i,G.,Edelmann,L.,Goldsmith,J.E.,Cohen,N.,Nakamine,A.,Reichert,J.G.,Hoffman,E.J.,Zurawiecki,D.M.,Si lverman,J.M.,Hollander,E.,Soorya,L.,Anagnostou,E.,Betancur,C.,和Buxbaum,J.D.(2008).Multiplexligation-dependent probe amplification for genetic screening inautism spectrum disorders:efficient identification of knownmicroduplications and identification of a novel microduplicationin ASMT.BMC.Med.Genomics.1:50.,50)。这些评估利用已经在ASMT基因中观察到的特异性单核苷酸多态性(SNP)(Melke,J.,Goubran,B.H.,Chaste,P.,Betancur,C.,Nygren,G.,Anckarsater,H.,Rastam,M.,Stahlberg,O.,Gillberg,I.C.,Delorme,R.,Chabane,N.,Mouren-Simeoni,M.C.,Fauchereau,F.,Durand,C.M.,Chevalier,F.,Drouot,X.,Collet,C.,Launay,J.M.,Leboyer,M.,Gillberg,C.,and Bourgeron,T.(2008).Abnormal melatonin synthesis inautism spectrum disorders.Mol.Psychiatry.13,90-98;Jonsson,L.,Ljunggren,E.,Bremer,A.,Pedersen,C.,Landen,M.,Thuresson,K.,Giacobini,M.,and Melke,J.(2010).Mutationscreening of melatonin-related genes in patients with autismspectrum disorders.BMC.Med.Genomics.3:10.,10)。

上述实施例和优选实施方案的描述应视为示例性的而非限制性的，本发明由权利要求定义。正如易于理解的，可以在不脱离如权利要求举出的本发明的情况下使用上述举出的特征的大量变化形式和组合。这种变化形式不被视为脱离本发明的精神和范围，并且所有这种变化形式均预以包括在如下权利要求范围内。

将本文引述的全部参考文献完整地引入本文参考。

Claims (26)

1.包含褪黑激素和锌的组合物。

2.权利要求1的组合物，其中锌的形式选自锌、乙酸锌、葡糖酸锌、柠檬酸锌、氯化锌及其组合。

3.权利要求1的组合物，其中所述褪黑激素和锌以约1:1－约1:1.2的摩尔比存在。

4.权利要求1的组合物，其中所述褪黑激素和锌以约1:1的摩尔比存在。

5.权利要求4的组合物，其中所述褪黑激素和锌是粉末形式并且混合成粉状混合物。

6.权利要求5的组合物，其中将所述粉状混合物与足以产生颗粒的量的至少一种赋形剂配制。

7.权利要求6的组合物，其中用肠溶衣给所述颗粒包衣。

8.权利要求7的组合物，其中所述肠溶衣选自脂肪酸、蜡、虫胶、塑料、植物纤维、聚合物及其组合。

9.包含褪黑激素-锌复合物的组合物。

10.权利要求9的组合物，其中所述褪黑激素-锌复合物通过在过量碱的存在下将可溶性锌盐加入到褪黑激素的碱性溶液中形成。

11.权利要求1或9的组合物，其中所述组合物还包含益生菌材料。

12.权利要求11的组合物，其中所述益生菌材料包含细菌的至少一种天然、半合成或转基因菌株。

13.权利要求11的组合物，其中所述益生菌材料包含酵母的至少一种天然、半合成或转基因菌株。

14.权利要求11的组合物，其中所述益生菌材料包含细菌和酵母。

15.包含权利要求1-14任一项的组合物的剂型。

16.权利要求15的剂型，包含所述组合物的颗粒。

17.权利要求16的剂型，其中用肠溶衣给所述颗粒包衣。

18.权利要求17的剂型，其中将所述包衣颗粒包囊。

19.治疗或预防汞毒性的方法，包含对有此需要的受试者给予治疗有效量的权利要求1-14任一项的组合物。

20.治疗或预防选自孤独症、孤独性谱群疾病、阿尔茨海默病和帕金森病的病症的方法，包括对有此需要的受试者给予治疗有效量的权利要求1-14任一项的组合物。

21.治疗或预防选自炎症、线粒体功能障碍和锌缺乏的病症的方法，包括对有此需要的受试者给予治疗有效量的权利要求1-14任一项的组合物。

22.治疗或预防与接触环境重金属相关的病症的方法，包括对有此需要的受试者给予治疗有效量的权利要求1-14任一项的组合物。

23.权利要求20-22任一项的治疗方法，其中通过口服给予所述组合物。

24.权利要求20-22任一项的治疗方法，其中给予所述受试者所述组合物，所提供的用量约为0.01mg/kg－约10mg/kg褪黑激素，每日1－4次。

25.权利要求20-22任一项的治疗方法，其中给予所述受试者所述组合物，所提供的用量约为0.1mg/kg褪黑激素，每日4次。

26.剂型的制备方法，包括下列步骤：组合褪黑激素和锌，形成混合物；向所述混合物中加入至少一种赋形剂，其用量足以形成颗粒；用肠溶衣给所述颗粒包衣；和包囊所述包衣颗粒。