CN102943123A - 糖尿病病理演变前期APOA2基因的mRNA水平原位杂交检测试剂盒及检测方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针和标记物。还公开使用本试剂盒原位杂交检测与糖尿病病理演变前期密切相关的APOA2基因mRNA的方法，包括以下步骤：（1）在杂交探针与靶序列可形成稳定杂交复合体的条件下，将底物中待测RNA与杂交探针接触，形成杂交复合体；和（2）检测所述杂交复合体。本发明的试剂盒和检测方法可在mRNA水平上检测APOA2基因表达量，比现有的临床生化检测指标更早期，能实现真正的糖尿病病理演变前期mRNA水平筛查，做到糖尿病的预防性诊治，将糖尿病消灭在萌芽状态。同时，本发明的检测方法简单方便，成本低,便于医院推广应用。

Description

糖尿病病理演变前期APOA2基因的mRNA水平原位杂交检测试剂盒及检测方法和应用

技术领域

本发明涉及生物检测领域，更具体地说，是涉及与糖尿病病理演变mRNA表达改变(病理演变过程)的相关检测技术。  

背景技术

   2011年统计的最新数据显示全国已经确诊的糖尿病有9240万，糖尿病前期的人群有1.48亿。糖尿病并发症是一种常见的慢性并发症，是由糖尿病病变转变而来，后果相当严重，如足病（足部坏疽、截肢）、肾病（肾功能衰竭、尿毒症）、眼病（模糊不清、失明）、脑病（脑血管病变）、心脏病、皮肤病、性病等是糖尿病最常见的并发症，是导致糖尿病患者死亡的主要因素。糖尿病的病理生理变化是由于胰岛素分泌不足和组织糖利用障碍，导致血糖过高代谢障碍。糖尿病有原发性与继发性两种。原发性病因尚未清楚;，可能与遗传等因素有关，继发性见于慢性胰腺炎、癌症、血色病、胰大部分手术切除、脑垂体前叶机能亢进、促肾上腺皮质机能亢进、肾上腺嗜铬细胞瘤、胰岛α细胞瘤、妊娠糖尿病等。近来科学家们都把糖尿病的发病机制的放在基因病理生理学水平进行深入研究，发现了一些与糖尿病发病有关一些基因，如APOA2基因是近来发现与汉族人患糖尿病有关，发现APOA2蛋白在糖尿病患者体内的水平明显增高，研究人员认为这一指标可以通过简单的血液测试，指示正常体重的中年人患糖尿病的风险。这将给他们更强的动力来尽早改善生活方式，以预防糖尿病。临床上当患者被确诊为二型糖尿病时，往往这一疾病早已在患者体内发展了多年，而且已经对血管和眼部造成了伤害，及早筛查出糖尿病的早期风险是很有价值的，这样人们就可以尽早采取预防性疗法。

   本发明人在长期研究中发现，导致重大疾病死亡率不降的重要原因是不能做到真正的早期诊治。因此，开发出用于糖尿病发病前期的相关基因水平筛查试剂盒有非常大的临床价值。

 随着分子生物技术日益完善，功能基因组学，疾病基因组学等研究的深入展开，为了寻求更早期的诊断糖尿病、治疗糖尿病、以及预防糖尿病，已取得长足进步。至今，我们已有可能在基因的一级转录功能产物mRNA水平上做更精确的早期筛查和诊断，在糖尿病前期做预测和筛查，这样就能将糖尿病的发病率降下来，可以大大降低社会成本，进一步提高国民的健康体质。

发明人在研究中发现用双标记技术，同步检测蛋白质与检测mRNA，有时候mRNA有表达，但蛋白质有时候没有转录出来，它们有时候存在表达时空不对应现象，检测mRNA会更准确。

本发明人在研究中发现APOA2基因在糖尿病患者、高危人群、正常对照人有明显的表达量变化，将APOA2作为筛查糖尿病病变前期有非常重要的临床意义。APOA2在糖尿病患者病变中高表达。他作于糖尿病预警有非常重要的临床意义。

发明人在长期的研究中，得出了一种新理念，重大疾病的临床诊治模式一定要改变，不能只停留现在治已病（发病后诊治），要做到预防性诊治，做到治已病，只有这样才能降低重大疾病的发病率和死亡率，降低社会成本和医疗成本。因此，发明人在开发和生产重大疾病的mRNA水平筛查试剂盒及治疗药物中，在理论和技术上都做了创新。特别是筛选临床标本（正常人群、高危人群、疾病患者），突破了正常组织与病理组织比较的一贯性研发思路，来寻找和开发病变前期的mRNA水平，与疾病早期基因病理生理学演变密切相关，而且临床意义非常重要mRNA靶标，将临床上疾病形成后诊治模式变成重大疾病的预防性诊治，争取了疾病诊治的时间和空间，达到预防疾病。

根据现有的文献资料采用原位杂交技术和组化免疫方法检测APOA2基因mRNA水平表达量的检测技术及试剂盒未见报道。

本发明人在针对创新性发明的要求，设计了（糖尿病患者、高危人群、正常对照）不同数据例组，用原位杂交技术进行检测，结果表明以上糖尿病病人高表达，高危人群有不同程度表达10-20%,正常对照都是不表达。表明APOA2基因是糖尿病病变前期筛查的重要标志物。

原位杂交技术（in situ hybridization）是将分子生物学与细胞化学技术结合起来，以标记的核酸分子为探针，在组织细胞原位检测特异性核酸分子的技术。其原理是使含有特异序列、经过标记的核酸单链（即探针），在适宜条件下与组织细胞中的互补核酸单链即靶核酸发生杂交，再以放射自显影或免疫细胞化学方法对标记探针进行探测，从而在细胞原位显示特异的DNA或RNA分子。

原位杂交的探针是已知序列的分子或序列未知但分子已知的核酸分子（虽不明确该分子全部序列，但已知其针对何靶分子），探针的种类按核酸性质不同又可分为DNA探针、cDNA探针、cRNA探针和合成寡核苷酸探针。为了便于示踪，探针必须用一定的手段加以标记，以利于以后的检测。常用的标记物包括放射性核素和非放射性标记物两大类。常用的同位素标记物有³H、³⁵S、¹²⁵I和³²P。同位素标记物虽然有灵敏性高、背底较为清晰等优点，但是由于放射性同位素对人和环境均会造成伤害，近来有被非同位素取代的趋势。非同位素标记物中目前最常用的有生物素、地高辛和荧光素三种。检测这些标记物的方法都是极其灵敏的。

根据所用探针及所要检测核酸的不同又可分为DNA-DNA,RNA-DNA, RNA-RNA杂交。但不论哪一种形式的杂交，都必须经过五大过程，即组织细胞的固定，预杂交、杂交、冲洗和显示。本发明采用RNA-RNA的杂交方式，合成的探针（RNA）和检测的靶RNA是采用碱基互补（杂交互补）的原理，同时经过长时间研究和观察，启动和中止处得残基对检测的结果没有影响。

鉴于目前临床上人类重大疾病诊断大部分是晚期，治疗也是晚期，导致死亡率不降的诊治模式。本发明的初衷是想改变目前临床上重大疾病的诊治模式，从治已病变成预防性治未病，达到重大疾病预防性诊治目的，在理念和技术做出了创新性的突破，提供疾病变化mRNA水平筛查技术，使临床上有了一项新的疾病变化前期mRNA水平筛查的技术，为临床重大疾病的诊治争取时间和空间，实现重大的预防。

综上所述，本发明的目的首先是提供一种原位杂交检测试剂盒，其包含原位杂交检测探针和标记物。其次，本发明还要提供上述试剂盒用于与糖尿病前期筛查及早期预警相关的原位杂交检测方法。

发明内容

为实现本发明的目的，本发明的技术方案如下：

本发明首先提供一种原位杂交检测试剂盒，其包括杂交探针和标记物，其中，所述的杂交探针序列为序列表SEQ ID NO.1所示序列，473bp，APOA2基因位于染色体1p23.3"上。

本发明试剂盒的一个优选方案是，所述的标记物选自放射性物质、化学发光或显色物质、生物素、金属鲎、荧光素、酶及纳米材料。

本发明试剂盒的一个优选方案是还包括杂交液。

本发明试剂盒的一个优选方案是还包括增强剂。

本发明试剂盒的一个优选方案是还包括显色剂。

本发明的糖尿病病变前期APOA2筛查试剂盒应用价值在于，对糖尿病前期筛查及预警有非常重要临床意义，进一步配合临床做预防性治疗。

本发明还提供一种APOA2基因原位杂交的检测方法，包括以下步骤： 

（1）在上面所述的杂交探针与靶序列可形成稳定杂交复合体的条件下，将底物中待测RNA与杂交探针接触，形成杂交复合体；和

（2）检测所述杂交复合体。

本发明所述的检测方法，其中优选地是，所述的可形成稳定杂交复合体的条件为：核酸杂交的温度为42℃；核酸杂交的时间为16－24小时。

本发明所述的检测方法，其中优选地是，所述的底物选用人的血液细胞标本或其它器官组织细胞标本。更优选地是，所述的血液标本或其它器官组织细胞标本来自糖尿病患者、高危人群、健康正常人群。

本发明的检测试剂盒是采用核酸杂交技术和组化免疫方法相结合，以APOA2为检测对象，合成探针为序列表SEQ ID NO.1所示序列，是APOA2基因序列，473bp，检测的底物是人体血液标本白细胞或组织细胞的RNA的表达量。原位杂交技术的显示方法能提供APOA2的半定量或定量表达程度判定。根据杂交后免疫组化显色判定以上RNA的表达量，正常人APOA2基因不表达，即无显色，在糖尿病病人高度表达，大量染色，高危人群有轻度染色。

本发明的诊断试剂盒的组份是由杂交探针，杂交液，显色剂，增效剂等组成。本试剂盒的核酸杂交原理是分子生物学业内人士均熟知，具体操作步骤是标本处理、预杂交、杂交、免疫组化染色、镜下进行定量分析、结果报告，其中杂交的具体步骤包括：

1).将待测标本放入反应槽中；

2).仪器自动弃去液体，自动加消化液； 

3).仪器自动弃去液体，自动后固定；

4).仪器自动弃去液体，自动预杂交（42℃）；

5).仪器自动弃去液体，自动清洗；

6).仪器自动弃去液体，自动杂交（42℃）；

7).仪器自动弃去液体，自动清洗；

8).仪器自动弃去液体，自动与DIG抗体培养（室温）；

9).仪器自动弃去液体，自动清洗，显色；

10).取出封片镜检。

本发明的一个优选实施例的方案是：以APOA2合成的核酸探针用地高辛标记（地高辛标记的cDNA、RNA和寡核苷酸探针，不但探针的具有生物素标记优点，还克服了生物素标记的探针在原位杂交过程中受组织内源性生物素干忧等缺点），将该杂交探针与人体血液白细胞的待测RNA核酸进行杂交，再用免疫组化的方法显色，在光镜下观察RNA的存在和定位,根据染色的细胞数，判断目的RNA的表达量。

本发明方法是目前常用的核酸原位杂交技术，该方法通过检测底物细胞中的APOA2表达量，用来确定糖尿病病理演变前期的mRNA变化量，预警糖尿病基因病理生理学变化。因为APOA2在正常人中不表达，在糖尿病患者高表达，如果高危人群有表达表明有发生糖尿病的风险，及时进行（介入）预防性治疗。

一个试剂盒可以多人份使用或一人份使用。

本发明具有如下有益效果：

本发明的临床意义是更早期跟踪检测糖尿病发生的风险。在生化指标未产生异常之前，及早做到以上基因mRNA表达异常的信息采集，给临床医生一个真正的早期预警和预防性治疗参考和指导。

此外，本发明提供的试剂盒具有灵敏度高、特异性强的特点，同时，本发明的检测方法操作方便、简单，能在区级以上医院普遍使用和推广。

附图说明

图1是本发明APOA2基因原位杂交技术流程图。

图2是本发明实施例中糖尿病病人APOA2表达图片。

图3是本发明实施例中轻度血糖升高的高危人群图片。

图4是本发明实施例中正常人APOA2表达图片。

具体实施方式

下面结合实施例，更具体地说明本发明的内容。应该理解，下面的实施例用于说明而非限定本发明内容，任何形式上的改变或变通将落入本发明的保护范围。

实施例1

按照常规方法制备本实施例的原位杂交试剂盒，该试剂盒包括以APOA2基因设计的杂交探针、标记物、说明书，其中：

本实施例的探针标记物选用地高辛。

试剂盒杂交液组成：

消化液	100μL/管	1管/盒	无色透明液体
				保护液	100μL/管	1管/盒	无色透明液体
预杂交液	1300μL/管	2管/盒	无色透明液体
				正义杂交液	10μL/管	1管/盒	无色透明液体
反义杂交液	10μL/管	1管/盒	无色透明液体
				封闭液	1000μL/管	1管/盒	无色透明液体
碱性磷酸酶抗体	1μL/管	1管/盒	无色透明液体
				显色剂A	175μL/管	1管/盒	黄色液体
显色剂B	320μL/管	1管/盒	无色透明液体
				缓冲液Ⅰ	90mL/瓶	1瓶/盒	浅黄色或无色透明液体
缓冲液Ⅱ	80mL/瓶	1瓶/盒	浅黄色或无色透明液体
				缓冲液Ⅲ	20mL/瓶	3瓶/盒	浅黄色或无色透明液体
缓冲液Ⅳ	90mL/瓶	1瓶/盒	浅黄色或无色透明液体
				固定液	90mL/瓶	1瓶/盒	无色透明液体
阳性对照标本	6片/盒

配制试剂使用浓度

1).将10×缓冲液Ⅰ用三蒸水按1:10稀释成1×缓冲液Ⅰ；

2).将20×缓冲液Ⅱ用三蒸水按1:10稀释成2×缓冲液Ⅱ；

按1:100稀释成0.2×缓冲液Ⅱ; 按1:200稀释成0.1×缓冲液Ⅱ；

3).将10×缓冲液Ⅲ用三蒸水按1:10稀释成1×缓冲液Ⅲ；

4).10×缓冲液Ⅳ用三蒸水按1:10稀释成×缓冲液 Ⅳ (取1#，2#，3#各10mL, 加水至100mL既可)。

实施例2

应用核酸原位杂交检测方法对各组血液标本APOA2基因表达量的实施过程：

1).取待测标本两张；

2).在玻璃缸里加入消化液(消化液100μL加1×缓冲液Ⅰ99.9ml，即为使用浓度)50 ml，37℃水浴预热10min，放进16张玻片，37℃处理12 min, 再用1×缓冲液Ⅰ洗5min；

3).用0.2%的保护液(保护液1ml加1×缓冲液                                                

, 99ml即为使用浓度)洗10min, 三蒸水洗5min（以上过程都在玻璃缸进行），取出玻片，让其自然干燥；

4).将玻片放入保湿盒内, 加预杂交液25μL/片（加在有细胞的地方），盖上盖玻片，盖紧保湿盒，放在42℃恒温水浴箱中3h以上；

5).取出玻片,弃去盖玻片，将玻片放入玻璃缸内,用70%、90%、95%的乙醇各洗2min，取出，自然干燥；

6) .将玻片放入保湿盒内，一张加正义杂交液25μL/片，另一张加反义杂交液25μL/片，盖上盖玻片, 盖紧保湿盒，放在42℃恒温水浴箱中16-24h；

7).取出玻片,弃去盖玻片, 将玻片放入玻璃缸内：

  在42℃恒温水浴箱中用2×缓冲液Ⅱ洗两次,每次15min；

  在42℃恒温水浴箱中用0.2×缓冲液Ⅱ洗一次,每次15min； 

  在42℃恒温水浴箱中用0.1×缓冲液Ⅱ洗两次,每次15min；

8).用1×缓冲液Ⅲ洗30s,取出玻片,自然干燥；

9).将玻片放入保湿盒内,加0.5%封闭液（1ml封闭液加5ml 1×缓冲液Ⅲ）100μL/片, 盖紧保湿盒，在室温下作用30min。（此步骤不需加盖玻片）；

10).取出玻片,用1×缓冲液Ⅲ洗30s,自然干燥；

11).将玻片放入保湿盒内, 加X-AP抗体(取一管碱性磷酸酶抗体，向其中加入1.8ml 1×缓冲液Ⅲ)100μL/片,盖紧保湿盒在室温下作用30min，时间不能过长，否则会产生假阳性（此步骤不需加盖玻片）；

12).取出玻片，用1×缓冲液Ⅲ洗3次, 每次15min；

13).用1×缓冲液Ⅳ洗2min，加显色剂(显色剂A73.3μL，显色剂B157.5μL加到30mL 1×缓冲液Ⅳ中,混匀)，室温避光16h到18h以上；

14).用三蒸水洗5min，自然干燥，（用甘油加10%的1×缓冲液Ⅰ混匀）封片镜检。

本发明的核酸原位杂交检测方法将目的基因用地高辛标记，成为RNA核酸探针，将探针与人体白细胞的待测RNA核酸进行杂交，再用免疫组化的方法显色，因此在光镜下观察RNA的存在和定位,根据染色的细胞数，判断目的RNA的表达量。

糖尿病病人20名，高危人群（轻度血糖升高人）20名，正常对照组20名。抽所有待检人的外周血3-5毫升（分离白细胞）做原位杂交。结果表示，所有糖尿病患者APOA2基因mRNA表达量高，细胞染色深；高危人群表达稍降低，小数染色；正常对照组APOA2基因不表达，细胞不染色，具体结果见图2、图3、图4。

糖尿病人数	表达量%	高危人数	表达量%	正常人数	表达量%
						1	65	1	10	1	0
2	60	2	12	2	0
						3	70	3	20	3	0
4	62	4	8	4	0
						5	76	5	13	5	0
6	68	6	10	6	0
						7	63	7	13	7	0
8	72	8	15	8	0
						9	70	9	17	9	0
10	66	10	16	10	0
						11	62	11	15	11	0
12	66	12	13	12	0
						13	70	13	14	13	0
14	72	14	20	14	0
						15	62	15	15	15	0
16	74	16	11	16	0
						17	71	17	16	17	0
18	65	18	18	18	0
						19	76	19	12	19	0
20	62	20	18	20	0

。 

SEQUENCE LISTING

 

<110>   芮屈生物技术（上海）有限公司

 

<120>  糖尿病病理演变前期APOA2基因的mRNA水平原位杂交检测试剂盒及检测方法

       和应用

 

<130>  。

 

<160>  1    

 

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  473

<212>  DNA

<213>  Homo sapiens

 

<400>  1

aggcacagac accaaggaca gagacgctgg ctaggccgcc ctccccactg ttaccaacat       60

 

gaagctgctc gcagcaactg tgctactcct caccatctgc agccttgaag gagctttggt      120

 

tcggagacag gcaaaggagc catgtgtgga gagcctggtt tctcagtact tccagaccgt      180

 

gactgactat ggcaaggacc tgatggagaa ggtcaagagc ccagagcttc aggccgaggc      240

 

caagtcttac tttgaaaagt caaaggagca gctgacaccc ctgatcaaga aggctggaac      300

 

ggaactggtt aacttcttga gctatttcgt ggaacttgga acacagcctg ccacccagtg      360

 

aagtgtccag accattgtct tccaacccca gctggcctct agaacaccca ctggccagtc      420

 

ctagagctcc tgtccctacc cactctttgc tacaataaat gctgaatgaa tcc             473   

Claims (9)

1.一种原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针和标记物，其特征在于，所述的杂交探针为序列表SEQ ID NO.1所示的序列。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的标记物选自放射性物质、化学发光或显色物质、生物素、金属鲎、荧光素、酶及纳米材料。

3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括杂交液。

4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括增效剂。

5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括显色剂。

6.一种APOA2基因原位杂交检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

（1）在权利要求1所述的杂交探针与靶序列可形成稳定杂交复合体的条件下，将底物中待测RNA与杂交探针接触，形成杂交复合体；和

（2）检测所述杂交复合体。

7.如权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述的可形成稳定杂交复合体的条件为：核酸杂交的温度为42℃；核酸杂交的时间为16－24小时。

8.如权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述的底物选用人的血液细胞标本。

9.APOA2基因在制备检测糖尿病原位杂交试剂盒中的应用。

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