CN102940895A - 一种纳米泡溶液及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种纳米泡溶液，即双功能荧光-超声纳米泡，可作为造影对比剂，在小鼠皮下肿瘤活体模型中，能显著地提高超声对肿瘤的成像性，增强效果持续2小时以上，同时在荧光成像中，明确显示肿瘤的位置和大小，24小时后对肿瘤影像效果依然显著。代谢实验表明，双功能荧光-超声纳米泡造影对比剂主要分布在小鼠的膀胱和肿瘤中，肝脏无明显分布，其潜在毒性低。双功能荧光-超声纳米泡作为造影对比剂对肿瘤组织的范围和位置显示明确，与没有术中荧光的成像对比有其无法比拟的明显优势。因此，本发明的双功能荧光-超声纳米泡溶液作为肿瘤诊断对比剂，药物共输送和药物动力学研究,以及术中荧光的影像对比剂有着独特的创新性和应用前景。
Description
技术领域
本发明属于医药及化学领域，涉及荧光-超声影像对比剂，具体涉及一种双功能荧光-超声影像对比剂的制备方法和其医学诊断之用途，特别涉及其作为影像对比剂在肿瘤诊断中的应用。
背景技术
超声对比剂是一种在临床肿瘤诊断中提高超声影像诊断效果的静脉注射剂。目前常用的超声对比剂包括微泡超声造影剂和纳米泡超声造影剂。近年研究表明，粒径在500纳米以下的纳米级脂质体造影剂能通过肿瘤血管间隙达到靶部位，其造影增强效果优于微泡造影剂。同时，超声对比剂在药物共输送的应用有着较大的前景。但是，已有的纳米泡和微泡超声造影剂成像时间都小于30分钟，其在体内对肿瘤选择的特异性不理想。同时磷脂质体的纳米泡对肾脏和肝脏都有潜在毒性，并且存在安全性问题。肿瘤靶向的超声造影剂主要是通过对泡的包膜表面进行肿瘤靶向分子的特异性修饰，从而可以与特定肿瘤组织受体紧密结合，实现超声的组织特异性成像。但是，由于肿瘤血管在不同生长阶段表现不同结构特性，需要对包膜表面进行多种配体修饰以达到有效的增强效果，因此实际临床应用不高。
近年来，荧光成像方法因其在外科手术中的术中荧光应用而迅猛发展。在术中荧光应用中，肿瘤特异性的荧光探针成像可以准确显示肿瘤位置和大小，从而为切除潜在肿瘤组织提供了有效的方案并提高了患者的生存率。除此之外，荧光成像在动物模型中研究药物动力学如分布，吸收和代谢等提供了新的方法学手段。因此，新型双功能荧光-超声纳米泡作为影剂影像对比剂如能实现肿瘤特异性成像，其作为肿瘤诊断，药物共输送和动力学研究，以及术中荧光的影像对比剂有着极大的意义和前景。
发明內容
本发明的任务是提供一种纳米泡溶液，提供一种新的双功能荧光-超声纳米泡，使其作为影像对比剂在体内具有肿瘤选择性的造影成像功能，并提供该纳米泡的制备方法。
实现本发明的技术方案是：
本发明提供的纳米泡溶液，由以下百分重量比的组分组成：
中榈酸抗坏血酸酯：0.10-0.50％
1，2-十六烷二醇：0.002-0.02％
吐温60：0.03-0.15％
羟乙基淀粉及其类似葡聚糖：1.0-3.0％
壳聚糖：0.0005-0.0015％
荧光染料：0.0001-0.0004％
五聚乙二醇N-羟基琥珀酰亚胺酯：0.0001-0.0006％
磷酸盐缓冲溶液96-99％，
在所述的纳米泡中含由全氟丙烷气体。
各组分优选的百分重量比为：
中榈酸抗坏血酸酯：0.37％
1，2-十六烷二醇：0.01％
吐温60：0.1％
羟乙基淀粉及其类似葡聚糖：2％
壳聚糖：0.00125％
荧光染料：0.00024％
五聚乙二醇N-羟基琥珀酰亚胺酯：0.0003％
磷酸盐缓冲溶液97％。
所述的荧光染料可以是青色素(Cyanine)、得克萨斯红(Texas red)或阿历克斯荧光团系列(Alexa Fluor)。
本发明提供的纳米泡溶液的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、配制混悬液：
称取羟乙基淀粉、中榈酸抗坏血酸酯、1，2-十六烷二醇，羟乙基淀粉与中榈酸抗坏血酸酯和1，2-十六烷二醇的重量比为：200∶37∶1，加入到磷酸盐缓冲溶液中，磷酸盐缓冲溶液与羟乙基淀粉、榈酸抗坏血酸酯和1，2-十六烷二醇的重量比为48∶1；再加入吐温60，吐温60与羟乙基淀粉的重量比为1∶20，加氢氧化钠溶液调节PH为7，制成混悬液；
步骤二、超声处理：
将制成的混悬液放置于冰浴中使其温度降至10摄氏度，向体系通入经过2μm滤膜过滤的全氟丙烷气体10分钟即开始超声，超声中保持持续通全氟丙烷气体至超声结束，超声条件：使超声变幅杆置于反应液液面2毫米深以保证反应物和气体充分混合，于540瓦超声功率下超声80个周期，其中每一周期的超声工作时间为5秒、间歇时间为10秒，整个超声过程使溶液温度维持在15摄氏度以下，超声80个周期完成后，加入低分子量壳聚糖溶液，壳聚糖溶液与吐温60的重量比为1∶80；再进行第二次超声，超声条件为：36瓦超声40周期，其中每一周期的超声时间为5秒、间歇时间为10秒，得到乳白色溶液；所述的低分子量壳聚糖溶液的配置方法是：取0.5克低分子量壳聚糖和0.5克乙酸，加入99克水配置而成；
步骤三、离心：
将得到的乳白色溶液于4摄氏度下250g离心45分钟，溶液分为三层，最下层为未形成纳米泡的膜材料沉淀，中间层为纳米泡溶液，最上层为粒径较大的微米泡，收集中间层的纳米泡溶液，然后加入作为荧光染料的cy5.5N-羟基琥珀酰亚胺酯的二甲基亚砜溶液，cy5.5N-羟基琥珀酰亚胺酯与壳聚糖的重量比为1∶5.2，充入全氟丙烷气体保护气并于4摄氏度保存12小时后再加入五聚乙二醇N-羟基琥珀酰亚胺酯的二甲基亚砜溶液，五聚乙二醇N-羟基琥珀酰亚胺酯与壳聚糖的重量比为1∶4.2，充入全氟丙烷气体保护气并于4摄氏度保存24小时得到含全氟丙烷气体的纳米泡溶液。
上述方法中所述的作为荧光染料的cy5.5N-羟基琥珀酰亚胺酯的二甲基亚砜溶液的浓度可以为20毫克/毫升；所述的五聚乙二醇N-羟基琥珀酰亚胺酯的二甲基亚砜溶液的浓度可以为1.5毫克/毫升。
本发明提供的纳米泡溶液可作为荧光对比剂用于超声及荧光成像。
以本发明提供的纳米泡溶液(又可称为：双功能荧光-超声纳米泡)作为造影对比剂，在小鼠皮下肿瘤活体模型中，能显著地提高超声对肿瘤的成像性，增强效果持续2小时以上，同时在荧光成像中，明确显示肿瘤的位置和大小，24小时后对肿瘤影像效果依然显著。进一步的代谢实验表明，双功能荧光-超声纳米泡造影对比剂主要分布在小鼠的膀胱和肿瘤中，肝脏无明显分布，其潜在毒性低。同时，皮下肿瘤在解剖后，双功能荧光-超声纳米泡作为造影对比剂对肿瘤组织的范围和位置显示明确，其潜在肿瘤组织分布显著，与没有术中荧光的成像对比有其无法比拟的明显优势。因此，本发明的双功能荧光-超声纳米泡溶液作为肿瘤诊断对比剂，药物共输送和药物动力学研究，以及术中荧光的影像对比剂有着独特的创新性。
实验资料
主要化学药品和试剂：美国sigma-Aldrich公司，百灵威科学公司，阿拉丁试剂公司，国药试剂公司等。
肿瘤造模：鼠源性肝癌细胞H22由中国科学院上海生命学院细胞培养中心提供，细胞培养于RPMI-1640培养基(Invitrogen)中，辅以10％热灭活小牛血清(FBS)，25毫摩尔/升HEPE缓冲溶液，2毫摩尔/升L-谷氨酰胺，0.1毫摩尔/升非必需氨基酸，1.0毫摩尔/升丙酮酸钠，50U/mL青霉素，50微克/毫升链霉素。雌性BALB/c裸鼠(SFP级，约20g/只)由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供。动物试验规范由华中科技大学生命科学与技术学院审查委员会提供。鼠源性肝癌细胞H22先于RPMI-1640培养基中培养，然后腹腔接种到BALB/c小鼠中生长。4天后处死小鼠抽取腹水，PBS洗涤一次，皮下接种到BALB/c裸鼠后背部进行肿瘤造模。
主要仪器设备：纳米泡的制备装置为Y99-II DN型超声波细胞粉碎机(选择变幅杆为
中国宁波新芝生物科技股份有限公司)，日本尼康仪器有限公司尼康Eclipse80i显微镜，动态激光散射仪(Nano-ZS90，Malvern)，美国LOGIQ7的超声系统(GE Healthcare)，美国
Lumina XR成像系统(Caliper Life Sciences)等。
双功能荧光-超声纳米泡的粒径分析：使用尼康Eclipse 80i显微镜观察纳米泡的显微形态，物镜为Plan Apochromat VC 100x油镜。双功能荧光-超声纳米泡溶液与磷酸盐缓冲溶液混合后加到载玻片上在100x油镜下采集纳米泡的图片(尼康NIS-Elements BR图像采集软件，实测为400到800纳米的纳米泡(见图1)。双功能荧光-超声纳米泡荧光图像是采取类似的方法获得，使用的是IX71倒置显微镜(Olympus Corporation，Japan)。结果表明，Cy5.5-荧光染料是直接连接在纳米泡的表面(见图2)。双功能荧光-超声纳米泡的水合动力半径使用动态激光散射仪(Nano-ZS90，Malvern)测定，其平均粒径在37摄氏度为394纳米(图3)。
双功能荧光-超声纳米泡溶液的体外超声成像测定：将装有10毫升磷酸盐缓冲溶液的乳胶手套置于水浴中，超声传感器置于水浴装置侧面。超声图像采集系统为LOGIQ7的超声系统(GE Healthcare，USA)，传感器为甲状腺传感器，于B模式室温下分别采集5MHz和12MHz的超声图像(见图4)。采集图像前先保证乳胶手套和水浴中的气泡已排除，再往乳胶手套底部注入150微升纳米泡溶液。结果表明，双功能荧光-超声纳米泡溶液在12MHz的超声波成像探头下，比5MHz的超声波有着显著的超声成像效果(见图4)。
体内超声和荧光成像的测定：在小鼠皮下瘤的超声成像实验中，采用LOGIQ7超声系统和甲状腺传感器，设置超声频率为12MHz。小鼠不需麻醉直接固定在平台上，超声传感器轻轻置于肿瘤表面，采集注射前的超声图像。图像采集后，小鼠尾静脉注射100微升的双功能荧光-超声纳米泡溶液，并在注射后的不同时间点(10，30，60，120，240分钟)采集小鼠皮下瘤的超声图像，每两个时间点间松开小鼠使其自由活动。每次使用4只小鼠，所有小鼠在尾静脉注射双功能荧光-超声纳米泡溶液后的一个星期内没有发现异常或死亡。结果表明，皮下肿瘤在未注射对比剂前，在B超造影图像中，肿瘤的实体为无超声反射区并呈不规则的形状，同时整个肿瘤的周围界面与内脏分界不明显(图5)。在注射双功能荧光-超声纳米泡溶液30分钟后，B超造影图像中整个肿瘤的周围界面显著，和肿瘤实体的无超声反射区呈一个封闭的的内暗外亮不规则的轮廓(图5)。同时，超声造影的增强效果持续保持在2小时以上。然后在4小时后逐渐消失。这一结果表明，肿瘤的超声影像增强效应是与注射了双功能荧光-超声纳米泡溶液后直接导致的。
我们的进一步实验证明，当对正常大鼠微静脉注射双功能荧光-超声纳米泡溶液后，大鼠的正常肝脏组织在B超造影图像中除了血管在注射后2分钟内略有增强外，并无明显超声增强效应，见图6。这一实验结果与上述的肿瘤超声增强效应相对照，表明双功能荧光-超声纳米泡溶液在活体动物肿瘤模型在B对肿瘤组织有一定的靶向性。
在荧光成像实验中，主要使用
Lumina XR成像系统(Caliper LifeSciences，USA)采集荧光图像。cy5.5的荧光成像图是通过设定的535，570，605和640nm四个激发波长，采集一系列图像以消除背景荧光的干扰，然后运用Living
software图像分离处理的方法后得到的图像(由美国Caliper Life Sciences提供)。首先，小鼠用异氟烷(河北九派制药股份有限公司)麻醉后，采集注射前的肿瘤的荧光图像。然后，在肿瘤裸鼠中注射100微升的双功能荧光-超声纳米泡溶液或对照荧光混合液，麻醉后采集注射后的荧光图像，并在注射后的不同时间点(0.5，1，2，4，6，10和24小时)分别采集荧光图像，每两个时间点间使小鼠苏醒。我们的实验结果表明(图7)，双功能荧光-超声纳米泡溶液能在注射后30分钟内，选择性的富集在小鼠的肿瘤中，在注射后4小时后达到最高值。肿瘤中的荧光能持续保持24小时以上。而当小鼠注射了对照的荧光混合液后，我们发现肿瘤中无明显荧光富集，其主要的荧光成像的位置在小鼠的肾脏中。同时，运用荧光成像能研究相关双功能荧光-超声纳米泡溶液在体内分布这一功能，我们研究结果发现，双功能荧光-超声纳米泡溶液还主要分布在小鼠的膀胱中，这一分布在24小时后明显减弱，表明膀胱中的双功能荧光-超声纳米泡溶液通过尿液排除体外。进一步运用荧光成像比较小鼠的肝脏组织和肿瘤组织发现，肝脏中无荧光累积，而肿瘤组织有着很强的荧光发射。这些结果证实了双功能荧光-超声纳米泡溶液在体内具备现有超声纳米泡和微泡无法比拟的肿瘤靶向选择性。
术中荧光图像的对比实验：在肿瘤裸鼠中注射100微升的双功能荧光-超声纳米泡溶液24小时后，生理解剖后将皮下肿瘤部位显示出，采集黑白照片图像和荧光图像。在图像软件中进行图像对比，见图8，结果表明，荧光图像显示的肿瘤位置大小明显要大于黑白照片图像中显示的肿瘤，并且，肿瘤的边界轮廓显示清晰，证明双功能荧光-超声纳米泡溶液能够作为术中荧光对比剂的应用。
以上实验证明，双功能荧光-超声纳米泡溶液是一种新型双功能的超声和荧光的影像对比剂，在体内具有肿瘤选择性的造影成像功能，其体内主要分布在肿瘤和膀胱中，因此其潜在生物毒性低。同时，双功能荧光-超声纳米泡溶液作为术中荧光影像对比剂对肿瘤边界有着明确的定位，在医学应用上有着良好的应用前景。
附图说明
图1：双功能荧光-超声纳米泡溶液在100x油镜下采集纳米泡的图片(尼康NIS-Elements BR图像采集软件，表明纳米泡实测为400到800纳米。
图2：双功能荧光-超声纳米泡的黑白图像(A)和cy5.5荧光图像(B)。图像是采取是IX71倒置显微镜(Olympus Corporation，Japan)，在黑白光以及荧光滤片获得的。结果表明，Cy5.5-荧光染料是直接连接在纳米泡的表面。
图3：双功能荧光-超声纳米泡的水合动力半径使用动态激光散射仪(Nano-ZS90，Malvern)测定，其平均粒径在37摄氏度为394纳米。
图4：双功能荧光-超声纳米泡溶液的体外超声成像测定：装置如图。将装有10毫升磷酸盐缓冲溶液的乳胶手套置于水浴中，超声传感器置于水浴装置侧面。超声图像采集系统为LOGIQ7的超声系统(GEHealthcare，USA)，传感器为甲状腺传感器，于B模式室温下分别采集5MHz和12MHz的超声图像。结果表明，双功能荧光-超声纳米泡溶液在12MHz的超声波成像探头下，比5MHz的超声波有着显著的超声成像效果。
图5：小鼠皮下瘤的超声成像实验结果。图中A：注射前，B：注射后30分钟，C：注射后2小时，D：注射后4小时；超声图像采集在小鼠尾静脉注射100微升的双功能荧光-超声纳米泡溶液前后，采用LOGIQ7超声系统和甲状腺传感器，设置超声频率为12MHz。结果表明，皮下肿瘤在未注射对比剂前，在B超造影图像中，肿瘤的实体为无超声反射区并呈不规则的形状，同时整个肿瘤的周围界面与内脏分界不明显。在注射双功能荧光-超声纳米泡溶液30分钟后，B超造影图像中整个肿瘤的周围界面显著，和肿瘤实体的无超声反射区呈一个封闭的的内暗外亮不规则的轮廓。同时，超声造影的增强效果持续保持在2小时以上。然后在4小时后逐渐消失。
图6：大鼠的正常肝脏组织的超声成像实验结果。图中A：注射前，B：注射后；在当对正常大鼠微静脉注射双功能荧光-超声纳米泡溶液后，大鼠的正常肝脏组织在B超造影图像中除了血管在注射后2分钟内略有增强外，并无明显超声增强效应(A)。这一实验结果与上述的肿瘤超声增强效应相对照，表明双功能荧光-超声纳米泡溶液在活体动物肿瘤模型在B对肿瘤组织有一定的靶向性。
图7：小鼠皮下瘤的荧光成像实验结果，图中A：荧光对照，B：双功能荧光-超声纳米泡；其中a：注射前，b：注射后30分钟，c：注射后4小时，d：注射后6小时；荧光图像采集在小鼠尾静脉注射100微升的双功能荧光-超声纳米泡溶液前后，主要使用
Lumina XR成像系统(Caliper LifeSciences，USA)采集荧光图像；cy5.5的荧光成像图是通过设定的535，570，605和640nm四个激发波长，采集一系列图像以消除背景荧光的干扰，然后运用Living
software图像分离处理的方法后得到的图像。结果表明，双功能荧光-超声纳米泡溶液能在注射后30分钟内，选择性的富集在小鼠的肿瘤中，在注射后4小时后达到最高值。肿瘤中的荧光能持续保持24小时以上。而当小鼠注射了对照的荧光混合液后，我们发现肿瘤中无明显荧光富集，其主要的荧光成像的位置在小鼠的肾脏中。这些结果证实了双功能荧光-超声纳米泡溶液在体内具备现有超声纳米泡和微泡无法比拟的肿瘤靶向选择性。
图8：术中荧光图像的对比实验结果。图中A：黑白照片图像，B：荧光叠加图像；在肿瘤裸鼠中注射100微升的双功能荧光-超声纳米泡溶液24小时后，生理解剖后将皮下肿瘤部位显示出，采集黑白照片图像和荧光图像。结果表明，荧光图像显示的肿瘤位置大小明显要大于黑白照片图像中显示的肿瘤，并且，肿瘤的边界轮廓显示清晰，证明双功能荧光-超声纳米泡溶液能够作为术中荧光对比剂的应用。
具体实施方式
实施例1双功能荧光-超声纳米泡的制备法
称取1.20克羟乙基淀粉200/0.5，220毫克中榈酸抗坏血酸酯，22毫克1，2-十六烷二醇加入到58毫升无菌的磷酸盐缓冲溶液中，加入2毫升3％w/w吐温60的PBS溶液和300微升1N氢氧化钠溶液制成混悬液，放置于冰浴中使其温度降至10摄氏度，向体系通入经过0.2μm滤膜过滤的全氟丙烷气体10分钟，开始超声，超声中保持持续通全氟丙烷气体至超声结束，超声条件：使超声变幅杆置于反应液液面2毫米深以保证反应物和气体充分混合，于540瓦超声功率下超声80个周期，其中每一周期的超声工作时间为5秒、间歇时间为10秒，整个超声过程使溶液温度维持在15摄氏度以下，超声80个周期完成后，加入150微升0.5％w/w低分子量壳聚糖溶液，再进行第二次超声，超声条件为：36瓦超声40周期，其中每一周期的超声时间为5秒、间歇时间为10秒，得到约50mL乳白色溶液；将得到的乳白色溶液于4摄氏度下250g离心45分钟，溶液分为三层，最下层为未形成纳米泡的膜材料沉淀，中间层为纳米泡溶液，最上层为粒径较大的微米泡，收集中间层的纳米泡溶液，然后在每5毫升的纳米泡溶液中加入作为荧光染料的0.6微升cy5.5N-羟基琥珀酰亚胺酯的二甲基亚砜溶液(20毫克/毫升)，充入全氟丙烷气体保护气并于4摄氏度保存12小时后再加入10微升五聚乙二醇N-羟基琥珀酰亚胺酯的二甲基亚砜溶液(1.5毫克/毫升)，充入全氟丙烷气体保护气并于4摄氏度保存24小时得到含全氟丙烷气体的纳米泡溶液。
实施例2双功能荧光-超声纳米泡静脉注射剂
以双功能荧光-超声纳米泡为活性成分的静脉注射剂。以上制备的纳米泡溶液为无菌制备，可以直接作为静脉注射剂。建议的注射剂量为0.05毫升/千克。
实施例3体内超声和荧光成像的测定
在小鼠小鼠尾静脉注射100微升的双功能荧光-超声纳米泡溶液，超声图像采集系统为LOGIQ7的超声系统(GE Healthcare，USA)，传感器为甲状腺传感器，于B模式室温下采集12MHz的超声图像。在荧光成像实验中，主要使用
Lumina XR成像系统(Caliper Life Sciences，USA)采集荧光图像。cy5.5的荧光成像图是通过设定的535，570，605和640nm四个激发波长，采集一系列图像以消除背景荧光的干扰，然后运用Living
software图像分离处理的方法后得到的图像。
实施例4荧光图像对比
在肿瘤裸鼠中注射100微升的双功能荧光-超声纳米泡溶液4-24小时内，进行生理解剖，将皮下肿瘤部位显示出，采集黑白照片图像和荧光图像。主要使用
Lumina XR成像系统(Caliper Life Sciences，USA)采集荧光图像。cy5.5的荧光成像图是通过设定的535，570，605和640nm四个激发波长，采集一系列图像以消除背景荧光的干扰，然后运用Living
software图像分离处理的方法后得到的图像。
Claims (10)
1.一种纳米泡溶液，由以下百分重量比的组分组成：
中榈酸抗坏血酸酯：0.10-0.50％
1，2-十六烷二醇：0.002-0.02％
吐温60：0.03-0.15％
羟乙基淀粉及其类似葡聚糖：1.0-3.0％
壳聚糖：0.0005-0.0015％
荧光染料：0.0001-0.0004％
五聚乙二醇N-羟基琥珀酰亚胺酯：0.0001-0.0006％
磷酸盐缓冲溶液96-99％，
在所述的纳米泡中含由全氟丙烷气体。
2.根据权利要求1所述的纳米泡溶液，其特征在于，各组分的百分重量比为：
中榈酸抗坏血酸酯：0.37％
1，2-十六烷二醇：0.01％
吐温60：0.1％
羟乙基淀粉及其类似葡聚糖：2％
壳聚糖：0.00125％
荧光染料：0.00024％
五聚乙二醇N-羟基琥珀酰亚胺酯：0.0003％
磷酸盐缓冲溶液97％。
3.根据权利要求1或2所述的纳米泡溶液，其特征在于，所述的荧光染料可以是青色素(Cyanine)、得克萨斯红(Texas red)或阿历克斯荧光团系列(Alexa Fluor)。
4.权利要求1所述的纳米泡溶液的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：称取羟乙基淀粉、中榈酸抗坏血酸酯、1，2-十六烷二醇，羟乙基淀粉与中榈酸抗坏血酸酯和1，2-十六烷二醇的重量比为：200∶37∶1，加入到磷酸盐缓冲溶液中，磷酸盐缓冲溶液与羟乙基淀粉、榈酸抗坏血酸酯和1，2-十六烷二醇的重量比为48∶1；再加入吐温60，吐温60与羟乙基淀粉的重量比为1∶20，加氢氧化钠溶液调节PH为7，制成混悬液；
步骤二：将制成的混悬液放置于冰浴中使其温度降至10摄氏度，向体系通入经过2μm滤膜过滤的全氟丙烷气体10分钟即开始超声，超声中保持持续通全氟丙烷气体至超声结束，超声条件：使超声变幅杆置于反应液液面2毫米深以保证反应物和气体充分混合，于540瓦超声功率下超声80个周期，其中每一周期的超声工作时间为5秒、间歇时间为10秒，整个超声过程使溶液温度维持在15摄氏度以下，超声80个周期完成后，加入低分子量壳聚糖溶液，壳聚糖溶液与吐温60的重量比为1∶80；再进行第二次超声，超声条件为：36瓦超声40周期，其中每一周期的超声时间为5秒、间歇时间为10秒，得到乳白色溶液；所述的低分子量壳聚糖溶液的配置方法是：取0.5克低分子量壳聚糖和0.5克乙酸，加入99克水配置而成；
步骤三：将得到的乳白色溶液于4摄氏度下250g离心45分钟，溶液分为三层，最下层为未形成纳米泡的膜材料沉淀，中间层为纳米泡溶液，最上层为粒径较大的微米泡，收集中间层的纳米泡溶液，然后加入作为荧光染料的cy5.5N-羟基琥珀酰亚胺酯的二甲基亚砜溶液，cy5.5N-羟基琥珀酰亚胺酯与壳聚糖的重量比为1∶5.2，充入全氟丙烷气体保护气并于4摄氏度保存12小时后再加入五聚乙二醇N-羟基琥珀酰亚胺酯的二甲基亚砜溶液，五聚乙二醇N-羟基琥珀酰亚胺酯与壳聚糖的重量比为1∶4.2，充入全氟丙烷气体保护气并于4摄氏度保存24小时得到含全氟丙烷气体的纳米泡溶液。
5.根据权利要求4所述的纳米泡溶液的制备方法，其特征在于，所述的作为荧光染料的cy5.5N-羟基琥珀酰亚胺酯的二甲基亚砜溶液的浓度为20毫克/毫升；
6.根据权利要求4或5所述的纳米泡溶液的制备方法，其特征在于，所述的五聚乙二醇N-羟基琥珀酰亚胺酯的二甲基亚砜溶液的浓度为1.5毫克/毫升。
7.权利要求1或2所述的纳米泡溶液在超声或荧光成像中的应用。
8.权利要求1或2所述的纳米泡溶液在制备超声荧光对比剂中的应用。
9.权利要求1或2所述的纳米泡溶液在制备作为用于肿瘤诊断的影像对比剂中的应用。
10.一种组合物，含有权利要求1所述的纳米泡溶液。
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Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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Patent Citations (2)
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| CN101721718A (zh) * | 2008-10-28 | 2010-06-09 | 鲁翠涛 | 脂质微泡及其制备方法 |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104524602A (zh) * | 2014-12-26 | 2015-04-22 | 宁波市第一医院 | 叶酸受体靶向超声造影纳米微泡及其制备方法 |
| CN104587497A (zh) * | 2014-12-26 | 2015-05-06 | 宁波市第一医院 | 叶酸受体靶向超声造影纳米微泡的制备方法 |
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