CN102939371B - 细胞破裂 - Google Patents

Abstract

破裂生物学细胞的方法，其包括使用热电电池冷冻，沸腾或也许交替冷冻及沸腾含有生物学细胞的物质，所述热电电池具有与保持在基本上恒定温度的热汇/源连续的基面和工作面。用于实施破裂过程的设备包含珀耳帖电池，其基面柔性地附接于设置在保持在约50℃的恒定温度的热汇和其工作面与反应容器或反应容器支架连续。珀耳帖电池中电压的反转致使工作面交替达到冷冻温度以下及沸腾温度以上，和/或在容器支架上使用电阻性线用于加热，TEC纯用于冷却。珀耳帖电池基面由趋向于抑制由在热下膨胀和收缩所致的珀耳帖电池的解离的物质构成。

Description

细胞破裂

【技术领域】

本发明涉及通过破裂细胞膜释放细胞的成分的方法和设备。此可进行，以便收获一种或更多细胞成分用于在例如，生物学反应中可能的进一步处理。常常其是需要随后诊断分析的细胞核酸（NA）组分。NA下文指称RNA和DNA组分。方法可容易适应于优先释放细胞基质的蛋白性组分，如果此如此需要。

偶尔必需首先纯化靶NA分子，以便实施生物学反应诸如聚合酶链反应（PCR）。例如NA本身起初含在被细胞膜保护的细胞之内。由此，为对NA实施PCR，必需自其细胞释放NA及进入适合于下游提取和纯化步骤的载体流体。

【背景技术】

许多方法是细胞破裂目前可利用的。这些包括酸/碱，酶促，超声处理（由超声波破裂）或机械分离。但是，这些是耗时，一些是过度损伤及破坏NA本身，风险混杂和可引起不可再现的质量和量的最终纯化的产生的NA。而且许多存在的技术不是自动化灵敏的。

DNA提取常在潜在地危险的化学品诸如苯酚和胍鎓盐的存在下实施，以便移出可干扰随后下游过程的不需要的细胞组分诸如脂肪和蛋白。会期望不依赖于这些毒性添加剂的快速方法。

由温度操作的DNA提取已描述于文献。已描述使用沸腾以物理学破坏释放NA的靶细胞的细胞膜。同样，已关于植物材料特别描述通过使用液氮冷冻，其中冰晶的形成可物理学破坏这些组织类型的细胞膜，它们包含多糖。

此细胞裂解方法会适合于直接包括进许多诊断测定。已之前描述直接自简单靶诸如人血扩增核酸序列的方法。在这些之前工作中细胞类型高度灵敏于裂解，且像这样无需另外的步骤，以优化缓冲流程以最小化由细胞内容物的生物学过程的抑制。未描述更多复合靶，诸如细菌细胞的直接扩增，及会需要添加蛋白酶和长，耗时的下游处理。

有在非常短时期内获得NA释放，同时精确地控制量和质量的纯化的NA是高度期望的环境。能经操作依赖于简单的时间和温度动力学的过程进行此会可有价值。

【发明概述】

根据本发明的第1方面，提供用于细胞破裂的方法，包括放置含有细胞的物质紧邻热电电池的工作面，其基面邻近处于水的冷冻及沸腾温度之间的基本上恒定温度的热源/汇，将电流施加到热电电池以实质上改变物质的温度。

热电电池可为珀耳帖电池。

在一实施方式中，热电电池(TEC)与热汇单独关联，及提供独立的电阻性加热器元件。在此实施方式中，因此单独使用热电电池以提供冷却，因此减少对TEC的热应激。2个独立加热及冷却装置被相同的电子回路有利地控制，从而可达到任何温度设置点。优选的加热器元件可为与容器本身紧密接触的电阻性加热器线，例如包含围绕导热容器支架或中间体和导热支架诸如金属杯电阻线圈。

可替代性地采用UK专利说明书GB1100625.1中所示的加热手段。

本发明的方法可产生非常快速细胞破裂，及灵敏于通过例如改变实施的热循环的循环数，利用的缓冲系统，如果任何，待达到的靶温度及也渐变发生的速度来操作。

在一实施方式中，第1步骤旨在将其工作面的温度降低到冷冻，由此在靶细胞中形成冰晶，然后导致冰解冻。在另一实施方式中，温度首先升高到沸腾，然后允许样品冷却。此后来的实施方式其当细胞相对简单时是有用的。血是此一例。在再一实施方式中，采用热循环，其可包含交替对热电电池逆转电流，其中电池多少循环冷冻及沸腾。需知，当细胞沸腾时发生细胞破裂的温度，通常是75℃以上。

包含冷冻及沸腾的热循环可重复多次。快速热循环，也许甚至热休克，也会在样品的渗透势中实现有用的变化，由此辅助细胞破裂。在特定环境中，方法可包含几个加热及冷却循环，不冷冻，或仅偶然冷冻，或等同地几个冷冻及解冻循环，有仅偶然或无加热。

热循环的时程会依赖于样品的样品体积和容器性质。循环速度可例如涉及冰晶体生成，由于不同冷却速度会创建不同尺寸的冰晶，其会进而不同地影响细胞破裂。方法可个别优化依赖于许多因素，诸如NA释放的特异性靶生物，需要的期望的NA产率，需要的个体NA片段的尺寸及随后实施的任何给定下游诊断测定的物理需求。此优化可取改变温度，时间，循环数和也NA释放进去的载体介质本身的形式。

但是，如果如此需要，可采用方法以释放细胞基质的其他蛋白性组分。

循环过程在靶细胞中具有许多物理效应。首先，加热细胞到沸点导致细胞膜破坏，由此导致细胞组分大规模释放进提取基质。加热，而非冷却是第1步骤的方法对NA被简单脂质膜围绕的血使用可为适合。在此情况中，实际上，在第1加热循环之后，除了冷却之外，裂解的物质，不需要进一步循环。但是，加热单独不足以自许多生物产生高质量NA，由于在这些条件下NA保持与细胞蛋白关联。随后冷冻进一步破坏余下的细胞结构及重复冷冻足以变性与NA关联的蛋白，和因此致使其适合于纯化和随后诊断使用。

提取基质，NA释放的流体，也可为诸如旨在改善提取过程的结果。以其最简单的形式，本领域知道的任何缓冲剂，诸如TRIS EDTA（三氨基甲烷乙二胺四乙酸），可用于实施冷冻/解冻。任何提取的NA会适合于立即下游处理，在此实例中，和像这样，此是优选的实施方式。一些靶细胞可对冷冻/解冻提取方法有抗性，及在这些实例中，包括另外的手段以裂解细胞内容物可为必需。这些可尤其包括初始酶处理，预先的超声处理和酸/碱处理。但是预期，任何其他破裂会通过操作细胞的渗透势，例如通过改变提取基质的盐浓度和成分和还通过 操作热循环步骤来提供。步骤诸如包括酶处理，酸/碱处理，改变提取基质的盐浓度和成分可在本发明的方法之前实施，或可合并进设备和过程。

自由此破坏的细胞的特定成分的纯化可然后通过使用本领域所知的过程实现，诸如简单的基于醇的沉淀方法或经过任何可商购的基于“柱”的系统。此会然后致使所述NA适合于随后生物学过程诸如PCR。

在优选的实施方式中，不会需要该中间步骤，及释放的NA会用于下游生物学过程，诸如聚合酶链反应（PCR），其用对此上清液优化的酶和缓冲剂混合物实施。在此实例中，PCR缓冲剂会是就在多个冷冻解冻循环后无产率损失和另外地待被细胞内容物最低限度抑制优化的裂解培养基。有其他就该直接方法记载的方法，但这些限制于非常容易裂解的样品，诸如血。描述的发明会能自更宽得多范围的复合生物依靠能破坏蛋白和复合多糖细胞器经冷冻解冻方法直接扩增DNA。此会带来能提供在单关闭的管容器中实施的基于快速PCR的诊断学的新优势，其不需求多个步骤，由此本身成为非-专家操作

根据本发明的破裂过程是容易灵敏于自动化及，更特别，作为可包括随后纯化和PCR或其他生物学过程的闭合过程实现。提供用于将以上直接所示的细胞裂解步骤包括进下游过程诸如PCR以便进一步减少该过程的时间和复杂性的方法和设备是本发明的特征。在多数情况中，过程可在单容器诸如管中实施，立即跟随的是无需由PCR或其他生物学反应中间纯化是本发明的特别有价值的特征。

根据本发明的此方面的方法提供快速和有效裂解方法，适合于自广泛的生物，诸如例如，病原性细菌和病毒提取质粒和基因组DNA。本发明的破裂过程可在约1分钟之内，当然在5分钟之内完成，和可优化以释放任何期望的细胞组分，其是DNA，RNA或的确期望蛋白级分。

当将电压施加于TEC时，流过的电流导致其第1面成为更温和第2面成为更冷。逆转电流导致第1面冷却及第2面变热。由此，TEC可用于实施含有待在根据本发明的方法中破坏或裂解的细胞的样品的加热及冷却，只要是第2或基面保持在沸腾及冰点中间的恒定温度而第1或工作面是交替在沸腾及冷冻温度。TEC优选具有施加的电压，使得样品加热到水的沸点(100℃)，在该点，逆转对TEC的电压及将样品冷却到在或小于0℃的温度。

但是，以此方式使用TEC的问题是TEC的构建中使用的不同材料，例如陶瓷和金属的热膨胀系数会，在现有TEC中，或即为可被称的热疲乏，其中工作面作为其温度变化的结果连续旁侧地膨胀及收缩，而基面基本上维持其尺度，导致当重复该大量温度反转时分层。

此问题在本发明的第2方面解决。

根据本发明的此第2方面，用于实施本发明的方法的设备包含具有由柱分离的基面和工作面的TEC，及设置为保持在恒定温度的热源/汇，基面柔性地附接于热源/汇。以此方式，基面可随着工作面扭曲膨胀及收缩，而后者由于其中的温度变化而膨胀及收缩，但就TEC自热源/汇的脱离或TEC解离而言倾向被减少。柱有利地由碲化铋形成。在微量滴定设备的情景中，其柱尽可能短可为重要，在该情况中，电连接可最佳由降额的线形成，且所述线与HRM(热移出模块)尽可能紧密关联，例如设置为由此经过以保持线相对冷。

有利地，基面附接于热汇，下文可能称为HRM，而工作面附接于反应容器，或更可能反应容器支架，在其中，例如，本发明的细胞破裂发生。附接优选由导热柔性的粘合剂实现。粘合剂可具有大于1W/mK，优选超过10W/mK的热传导率。因此，当TEC的面金属化，使用焊剂而将基面附接于热汇是可能的，特别当热汇本身由金属构成时。

优选使用软焊剂，诸如基于铟的焊剂，及焊剂的厚度被制成诸如也足够减少其的热应激，且可为10μm和几个mm之间的任何。为了确保焊剂厚度的一致性，可将间隔物放入焊剂。该间隔物会确保，当焊剂粘合剂取其液相形式时，热汇和TEC之间的间隔由此间隔物控制。

替代性的方法和设备旨在采用仅TEC用于加热或，更可能冷却，及根据情况合并分离的加热器或冷却器。此可避免TEC中无法耐受的应激。在加热的情况中，适合的结构可包含TEC，其具有贯穿其的空穴以接收容器，容器也被加热器围绕。正常情况下，该结构会需要不同电供给，一个用于TEC和另一个用于加热器。

在此专利说明书中，词汇容器指称能保持待处理的物质或样品的任何装置，及反应容器可因此包含孔，管（打开或关闭的）载玻片，也许以硅芯片或托架的形式。本发明特别关乎孔形式的微量滴定容器，尽管创建容器形式的TEC工作面可特别有利。

在本发明中，用来保持待裂解的细胞的反应容器可个别建立，或为线形，矩形，环状阵列或其他阵列。一般，阵列会使得其安装在标准微孔板的足迹之内，其为本领域技术人员熟知的形式。此形式包括但不限于以下阵列：

3×2反应容器，（6反应容器）

6×4反应容器，（12反应容器）

12×8反应容器，（96反应容器）

24×16反应容器和（384反应容器）

48×32反应容器（1536反应容器）

根据本发明的重要特征，可每反应容器提供至少一个珀耳帖，和反应容器可为微量滴定容器，其也可为该容器的阵列之一，一般3×2阵列或其整数倍。

热汇或HRM可包含如描述于PCT专利说明书PCT/GB2007/003564的装置。其可一般包含由金属如铜形成的板，其中具有与由适当的风扇手段保持在恒定温度的液体贮器连接的管迷路。HRM可因此形成容器阵列底，在该情况中，用定位销或垛提供HRM会是方便的。

【附图说明】

现在参照附图以例方式描述本发明的一实施方式：

图1是容器经TEC安装在HRM的示意性模式图；

图2是在HRM上安装TEC阵列的计划视图；

图3是HRM的示意性模式图；以及

图4是合并本发明的闭合回路装置的示意性模式图。

【实施方式】

图1显示经珀耳帖11安装到HRM 12的反应容器10。珀耳帖11包含基板11a，第2板11b，多个柱11c和补给线11d。珀耳帖11用粘合剂13附接容器10和HRM，其厚度由间隔物14控制。补给线11d经过HRM 12，由此它们被导热塑料物质15电绝缘。

如显示于图2，HRM携带多个垛16，其形成安装珀耳帖11的指引。HRM可替代性地具有一系列压凹，诸如在图3中，反应容器可合适地安装于其中。

在以上描述的设备的使用中，用容器中的一些靶生物材料，和保持在50℃量级的温度的热汇，以一个方向应用到TEC的电流将容器之内的温度降低到冷冻以下。此可在特定情况中足以破坏靶材料的细胞。电流可然后逆转，从而容器内的温度上升到沸腾以上。此循环循环性重复以完成生物材料的细胞破裂。然后采用PCR以倍增特定细胞成分用于鉴定。纯化过程可在破裂过程中实施，和从事分离需要的细胞成分，正常情况下为其NA。

在显示的特定例中，珀耳帖11是9mm矩形，及具有碲化铋柱11c。补给线11d是降额的。基于铟的焊剂13用于将珀耳帖11附接到容器10和HRM 12。

在另一实施方式中，容器10不是反应容器，像这样，但是支架，因此，设置为用于微量滴定反应容器的合适的接受。由此，一次性容器的成本可保持低，和标准物该使用的容器。用于此情况的理想的微量滴定反应容器是具有高表面体积比，具有7mm×7mm量级的底和3～5mm的高度，由导热塑料物质形成的容器。

图3例证HRM块原理，其中TEC或加热器和冷却器元件(3)利用例如软，柔性的铟焊剂附接于块(1)。可为水但优选是专利非导电介质的流体诸如‘流体 XP’经入口（2）流过块，以便遍及块均衡温度，因此使得各元件彼此独立，也移出过量热及允许HRM维持在靶温度。加热器冷却器元件然后围绕此预定的温度热循环，以便减少冷冻解冻过程发生的时间和能量需求。

图4例证面对的由热/冷方法NA提取的实施方式，其允许NA提取，纯化和随后扩增及在自含有的盒或“生物芯片”中发生。此实施方式的优势是整个过程可在闭合的管环境中实施，最小化混杂的似然性，及带来相当的及时保存和消费，由于全部步骤可在单仪器和消耗品上实施。涉及的方法在以下凸显；

1．操作者通过一旦拭子已插入便液密性的孔口（6）（理想地利用密封剂膜）插入样品，例如自怀疑患特定疾病的患者取的拭子。系统可适于使用许多不同原材料，例如使用注射器，通过路-洛二氏拟合或‘固体’材料，通过有用于系统压力的适当的密封的漏斗类型孔口。

2．然后利用向反应站（5）正置换自室1向含有样品的密封的隔室冲入缓冲剂，如此进行含有怀疑的病原体细胞的样品作为液体向反应室转移。

3．如之前描述于本申请，由反应室（5）的重复的热循环介导病原体细胞的裂解和随后NA释放，以辅助裂解的过程，室1中含有的流体成分可依赖于靶病原体和待实施的特定测定而改变。

4．在特定实施方式中，室1中含有的缓冲剂流体可含有特异于靶病原体的磁珠，其由抗体介导的手段或由本领域知道的直接寡核苷酸杂交结合。对此步骤的需求依赖于对于以对总NA的偏好优先捕获靶NA或确保每种可能的病原体NA分子作为手段分离，以增加随后分析的灵敏度的需求。

5．在使用捕获用磁珠的实例中磁场可应用于反应室（5），其结合具有结合到它们的靶NA的珠。然后由室2中含有的流体重复漂洗自冷冻/解冻得到的细胞废弃物。将自过程的废弃物冲入室4，从而全体过程是自含有的。

6．最终步骤旨在利用轻轻加温自磁珠释放结合的核酸，及重悬浮 于室3中含有的扩增缓冲剂。当磁分离不是需要的时，将液相中的一部分总细胞NA去除到废弃物，留下仅旨在与由室3供给的扩增组分组合需要的量。室3的内容物可构成对于许多生物学扩增流程必需的试剂，以便检测靶分子的小初始数。在优选的实施方式中，此会是实时PCR，其包括添加特异于目标病原体的荧光标记的引物分子序列。

流体室可由许多手段活化：

●正置换，其中压缩流体室，将流体挤压到反应室。此方法也包括流体可双向地动的益处，如果漂洗或混合步骤需要及需要更少体积以存储废弃物流体。

●正压.以此方式，将空气通过封件注入流体室。在盒插入后，和当需要的空气将流体推出室时由针穿刺此封件。封件应设计使得当盒从仪器除去时其自封。

●负压也可使用。

在优选的实施方式中，设计的性质允许随后利用控制冷冻/解冻过程而实施任何热循环过程，诸如PCR过程的TEC的益处。

Claims (13)

1.破裂生物学细胞而释放其中含有的核酸物质的方法，包括

在反应容器中放置靶生物学细胞，

将所述反应容器放置在附接于热电电池的工作表面的导热支架中，所述热电电池的基面附接于热源/汇，

将所述热源/汇、由此热电电池的基面维持在处于水的冷冻及沸腾温度之间的基本上恒定的中间温度，及

将电流施加到热电电池，由此冷冻靶生物学细胞，

将供应到热电电池的电流的极性逆转，从而解冻，并由此裂解所述靶生物学细胞。

2.权利要求1的方法，其包括在冷冻后使靶细胞经历大于75℃的温度。

3.权利要求1的方法，其包括使靶细胞暴露于热休克，由此实现物质的渗透势的变化。

4.权利要求1的方法，其包括交替冷冻及加热靶细胞经多个循环。

5.权利要求1的方法，其包括改变靶细胞内的渗透压。

6.权利要求1的方法，其为闭合过程中的步骤，其中随后步骤是生物学或化学过程。

7.权利要求1的方法，其为闭合过程中的步骤，其中随后步骤是NA扩增过程。

8.权利要求1的方法，其中细胞含于缓冲剂中。

9.权利要求1的方法，其采用电阻性加热元件以提供另外的加热能力或构成热源/汇。

10.权利要求1的方法，其包括纯化所裂解的靶细胞的步骤。

11.权利要求1的方法，其还包括对于靶生物学细胞的下列中的至少一种：酶处理、酸/碱处理和改变盐浓度。

12.权利要求1的方法，其中所述中间温度是50℃。

13.权利要求1的方法，其中所述反应容器具有微量滴定能力。