CN102919277A - 一种石斛小菇f48复合菌剂及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种石斛小菇F48复合菌剂及应用，所述复合菌剂由如下质量配比的原料组成：石斛小菇F48纯培养物3.5份、木霉菌纯培养物6.5份、占石斛小菇F48纯培养物与木霉菌纯培养物总重量2%的粘合剂；本发明提供的石斛小菇F48复合菌剂不仅促进了石斛苗生长速度，而且还提高了生物活性物质多糖和石斛碱含量，该生物菌剂开发复合可持续农业、生态农业、绿色农业发展要求，适合珍稀药用植物石斛规模化生产。

Description

一种石斛小菇F48复合菌剂及应用

（一）技术领域

本发明涉及一种石斛小菇F48复合菌剂，特别涉及一种由石斛小菇F48（Mycena dendrobii Fan et Guo）和木霉菌（Trichoderma）复合而成的石斛小菇F48复合菌剂及其应用方法，具有促进石斛苗快速生长，提高多糖和石斛碱含量等作用。

（二）背景技术

在珍稀药用植物石斛栽培过程中，由于其生长发育中特有的复杂性使得产业化工作的难度很大。一是石斛开花多，能结果的只占极少数，果实为蒴果，种子细如粉尘，种胚的发育不超过球形阶段，又缺乏胚乳组织，必须飘落到非常适宜的环境与真菌共生才能萌发，自然条件下的发芽率不到5%，而且由种子萌发的植株生长发育十分缓慢。二是石斛几乎都是菌根植物，自然生长状态下，都必须部分或完全依赖与真菌建立共生关系才能完成正常生命活动，人工条件下进行大规模开发和扩繁时，往往因缺少适宜共生菌根真菌的参与，使得其不能正常生长，使得珍稀药用植物石斛产业化难度加大。此外，石斛的组培繁殖技术仍然有较大的困难，能进行组培繁殖的外植体少，目前只有茎尖可以组培成功，叶片、根等外植体还没有成功的报道。靠根状茎方式繁殖，其特点是启动慢、周期长、繁殖系数低，是影响国石斛种苗规模生产的主要原因。另外，石斛组培苗栽培至开花所需时间长，也是组培繁殖的制约因素之一，组培苗出瓶种植一般需5~7年才能开花。这种现状严重影响了我国石斛产业化由数量扩张向质量提高转型，也约束了石斛产业的进一步发展。因此，如何提高石斛种子发芽率和幼苗生长速度已成为石斛产业化急需解决的问题之一。

生物菌剂是近年来发展起来的一种新型栽培基质添加剂，它含有大量活的微生物，其本身无毒、无味、无污染、无公害，以微生物生命活动及其产物来改善作物营养条件和生长环境。生物菌剂具有明显的抗病作用，其包含的微生物能分泌抗菌素，抑制多种致病真菌和细菌的生长，能减少了大量农药的投入，减少了农药给环境及农产品带来的污染。生物菌剂还能够促进土壤团粒结构的形成，改善土壤板结状况，将土壤中大量有效养分吸附、蓄积在土壤团粒中，不仅减少了水土流失，还能缓解化肥特别是氮肥的流失所造成的江、河、湖泊水体的富营养化及饮用水、地下水硝酸盐含量的增高等问题，并减少硝酸盐在农产品中的积累等问题。因此，生物菌剂开发对发展可持续农业、生态农业、绿色农业以及保护人类生存环境都具有深远影响。

（三）发明内容

本发明目的是提供一种促进石斛苗生长的复合菌剂及其应用方法，该复合菌剂促进了石斛苗快速生长，提高了石斛生物活性物质成分多糖和石斛碱含量。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种石斛小菇F48复合菌剂，所述复合菌剂由如下质量配比的原料组成：石斛小菇F48纯培养物3.5份、木霉菌纯培养物6.5份和占石斛小菇F48纯培养物与木霉菌纯培养物总重量2%的粘合剂；所述石斛小菇F48纯培养物是石斛小菇F48（Mycena dendrobii Fan et Guo）经固体发酵培养获得的含石斛小菇F48的菌块粉碎后得到所述石斛小菇F48纯培养物，所述木霉菌纯培养物是木霉菌（Trichoderma）经固体发酵培养获得的含木霉菌的菌块粉碎后得到所述木霉菌纯培养物，所述粘合剂为辽宁众信鱼饵开发中心的众信3A粘粉。

进一步，所述石斛小菇F48纯培养物按如下步骤制备：

（1）斜面培养：将石斛小菇F48接种至PDA固体培养基a，25℃培养14天，获得斜面菌体；所述PDA固体培养基a终浓度组成为：马铃薯300g/L、葡萄糖20 g/L、琼脂15~20 g/L，溶剂为水，pH 7.0；

（2）种子培养：从斜面菌体挑取一接种环接种至PD液体培养基a，在28℃、200r/min条件下振荡培养10 d，获得种子液；所述PD液体培养基a终浓度组成为：马铃薯300g/L、葡萄糖20 g/L，溶剂为水，pH7.0；

（3）发酵培养：将步骤（2）获得的种子液按照20mL种子液/1000g发酵培养基的比例接种至固体发酵培养基a中，25℃发酵培养20 d，获得含石斛小菇F48的固体菌块，将菌块（包括菌体和培养基）粉碎，获得所述石斛小菇F48纯培养物；所述固体发酵培养基a终浓度组成为：木屑820 g/L、麸皮270 g/L、玉米粉270 g/L、稻糠140 g/L、草灰140 g/L、泥炭1360 g/L，溶剂为水，pH 7.0。

进一步，所述木霉菌纯培养物按如下步骤制备：

①斜面培养：将木霉菌接种至PDA固体培养基b，25℃培养14天，获得斜面菌体；所述PDA固体培养基b终浓度组成为：马铃薯300g/L、葡萄糖20 g/L、琼脂15~20 g/L，溶剂为水，pH 7.0；

②种子培养：从斜面菌体挑取一接种环接种至PD液体培养基b，在28℃、200r/min条件下振荡培养10 d，获得种子液；所述PD液体培养基b终浓度组成为：马铃薯300g/L、葡萄糖20 g/ L，溶剂为水，pH 7.0；

③发酵培养：将步骤②获得的种子液按照20mL种子液/1000g发酵培养基的比例接种至固体发酵培养基b中，25℃发酵培养20 d，获得含木霉菌的菌块，将菌块（包括菌体和培养基）粉碎，获得所述木霉菌纯培养物；所述固体发酵培养基b终浓度组成为：木屑820 g/L、麸皮270 g/L、玉米粉270 g/L、稻糠140 g/L、草灰140 g/L、泥炭1360 g/L，溶剂为水，pH 7.0。

本发明还提供一种所述石斛小菇F48复合菌剂在石斛培养中的应用，所述石斛小菇F48复合菌剂的使用量为3g/株石斛苗。

本发明还涉及一种所述石斛小菇F48复合菌剂在石斛培养用肥料中的应用，所述肥料是将泥炭、蛭石和木屑按质量比1:1:1混合成营养土，然后按营养土与石斛小菇F48复合菌剂质量比30:1的比例加入石斛小菇F48复合菌剂组成所述肥料。

本发明所述石斛小菇F48（Mycena dendrobii Fan et Guo）分离自云南省昆明市野生金钗石斛，保存于浙江省药用植物种质改良与质量控制技术重点实验室。

所述木霉菌（Trichoderma）分离自云南昆明市野生金钗石斛，保存于浙江省药用植物种质改良与质量控制技术重点实验室。

所述PDA固体培养基a、PDA固体培养基b均为PDA固体培养基，PD液体培养基a和PD液体培养基b均为PD液体培养基，固体发酵培养基a和固体发酵培养基b均为固体发酵培养基，为便于区分不同菌种所用的培养基而命名，字母本身没有含义。

本发明的有益结果主要体现在：本发明提供的石斛小菇F48复合菌剂不仅促进了石斛苗生长速度，而且还提高了生物活性物质多糖和石斛碱含量，该生物菌剂开发复合可持续农业、生态农业、绿色农业发展要求，适合珍稀药用植物石斛规模化生产。

（四）具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：石斛小菇F48纯培养物的制备

1. 实验材料：石斛小菇F48菌株（Mycena dendrobii Fan et Guo）分离自云南昆明市野生金钗石斛。

2. 液体培养：将石斛小菇F48菌株接种PDA固体培养基，在25℃培养14 d后，切取石斛小菇F48菌株，接种在无菌的盛有100 mL PD液体培养基的500 mL的三角瓶内，置28℃、转速200r/min的摇床上振荡(往复式)培养10 d，得到石斛小菇F48种子液。

3. 固体（3）发酵培养：将步骤（2）获得的种子液按照20mL种子液/1000g发酵培养基的比例接种至固体发酵培养基中，25℃发酵培养20d，获得含石斛小菇F48固体菌块，将菌块粉碎，获得所述石斛小菇F48纯培养物；所述固体发酵培养基终浓度组成为：木屑820 g/L、麸皮270 g/L、玉米粉270 g/L、稻糠140 g/L、草灰140 g/L、泥炭1360 g/L，溶剂为水，pH 7.0。

实施例2：木霉菌纯培养物的制备

1. 实验材料：木霉菌（Trichoderma）分离自云南昆明市野生金钗石斛。

2. 液体培养：将木霉菌接种PDA固体培养基，在25℃培养14 d后，切取木霉菌菌片，接种在无菌的盛有100 mL PD液体培养基的500mL的三角瓶内，置28℃、转速200r/min的摇床上振荡(往复式)培养10d，得到木霉菌种子液。

3. 固体（3）发酵培养：将步骤（2）获得的种子液按照20mL种子液/1000g发酵培养基的比例接种至固体发酵培养基中，25℃发酵培养20 d，获得含木霉菌的固体菌块，将菌块粉碎，获得所述石斛小菇F48纯培养物；所述固体发酵培养基终浓度组成为：木屑820 g/L、麸皮270 g/L、玉米粉270 g/L、稻糠140 g/L、草灰140 g/L、泥炭1360 g/L，溶剂为水，pH 7.0。

实施例3：石斛小菇F48复合菌剂的制备

将实施例1制备的石斛小菇F48纯培养物和实施例2制备的木霉菌纯培养物按照重量比=3.5:7.5混合，然后添加占石斛小菇F48纯培养物和木霉菌纯培养物总重量2%的众信3A粘粉（辽宁众信鱼饵开发中心），混合均匀，获得石斛小菇F48复合菌剂。

实施例4： 石斛小菇F48复合菌剂的应用

1、实验材料：金钗石斛苗，采集自云南，经实验室自行授粉、组织培养至株高5 cm后保持使用；

2、实验操作：将实施例3方法制备的石斛小菇F48复合菌剂按照3g/株打穴接入金钗石斛苗根围，以不接种石斛小菇F48复合菌根菌剂金钗石斛苗作为对照，温室25℃培养60 d。

3、金钗石斛鲜重测定

60 d后，上述施用石斛小菇F48复合菌剂的金钗石斛苗增重为0.19g，对照石斛苗仅增重0.03 g。

4、石斛多糖和总生物碱含量测定

石斛多糖提取及测定：取种植60 d后施用石斛小菇F48复合菌剂的金钗石斛和对照组种植的石斛，80℃烘干研磨成粉末后，分别取0.500g置于圆底烧瓶中，加入石油醚50 ml，65℃回流提取1 h，脱脂，过滤，挥干溶剂，加入体积浓度80%乙醇水溶液50 ml，回流提取1 h，过滤，挥干溶剂，加入蒸馏水20ml于80℃回流提取2 h，趁热过滤，取滤液滴在 ATAGO PAL-1型糖度计上测定可溶性多糖含量。每个处理为15 株苗，每个处理设3个重复。

石斛碱提取及测定：将种植60 d后施用石斛小菇F48复合菌剂的金钗石斛和对照组种植的石斛80℃烘干至恒重，粉碎，精密称取0.500 g置100 ml圆底烧瓶中，加2 ml氨水润湿30 min后，加入氯仿50 ml，称重，65℃回流提取2 h，以氯仿补足失重，减压回收溶剂至干，浓缩物加甲醇超声溶解，定量转入 2 ml容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，吸入注射器，用0.45μm微孔滤膜过滤，滤液注入进样瓶。利用GC测定含量，GC色谱条件为：色谱柱为毛细管柱，19091J-413 HP-5，30.0×320μm×0.25μm，载气为氮气，流速为0.7 ml/min，进样口温度250℃，柱温以5℃/min的速度从120℃升温至150℃(起始温度点和终止温度点均稳定15 min)，氢火焰离子化检测器检测，检测器温度为250℃。每个处理为15 株苗，每个处理设3个重复。

测定结果发现，60 d后，施用石斛小菇F48复合菌剂的金钗石斛苗，其多糖含量为0.141 g/ g干重，石斛碱含量为0.176mg/g 干重，而对照石斛苗多糖含量为0.101 g/g干重，石斛碱含量为0.113mg/g 干重。

实施例5：

1、实验材料：金钗石斛苗，采集自云南，经实验室自行授粉、组织培养至5 cm后保持使用；泥炭、蛭石、木屑（质量比1：1：1）组成营养土，按营养土：石斛小菇F48复合菌剂（实施例3方法制备）=30：1的比例混合均匀，制成石斛培养用肥料。

2、实验操作：利用上述步骤1中石斛培养用肥料栽培金钗石斛苗，温室25℃培养60 d，以泥炭、蛭石、木屑（质量比1：1：1）组成的营养土作为对照。

3、金钗石斛鲜重测定

60 d后，上述施用石斛小菇F48复合菌剂的营养土栽培金钗石斛苗增重为0.18 g，对照石斛苗仅增重0.03 g。

4、石斛多糖和总生物碱含量测定

多糖及总石斛碱含量测定方法同实施例4，每个处理为15 株苗，每个处理设3个重复。测定结果发现，60 d后，施用石斛小菇F48复合菌根菌剂营养土的的金钗石斛苗，其多糖含量为0.149 g/ g干重，石斛碱含量为0.171mg/g 干重，而对照石斛苗多糖含量为0.101 g/g干重，石斛碱含量为0.113mg/g 干重。

Claims (5)

1.一种石斛小菇F48复合菌剂，其特征在于所述复合菌剂由如下质量配比的原料组成：石斛小菇F48纯培养物3.5份、木霉菌纯培养物6.5份和占石斛小菇F48纯培养物与木霉菌纯培养物总重量2%的粘合剂；所述石斛小菇F48纯培养物是石斛小菇F48（Mycena dendrobii Fan et Guo）经固体发酵培养获得的含石斛小菇F48的菌块粉碎后得到所述石斛小菇F48纯培养物，所述木霉菌纯培养物是木霉菌（Trichoderma）经固体发酵培养获得的含木霉菌的菌块粉碎后得到所述木霉菌纯培养物，所述粘合剂为辽宁众信鱼饵开发中心的众信3A粘粉。

2.如权利要求1所述石斛小菇F48复合菌剂，其特征在于所述石斛小菇F48纯培养物按如下步骤制备：

（1）斜面培养：将石斛小菇F48接种至PDA固体培养基a，25℃培养14天，获得斜面菌体；所述PDA固体培养基a终浓度组成为：马铃薯300g/L、葡萄糖20 g/L、琼脂15~20 g/L，溶剂为水，pH 7.0；

（2）种子培养：从斜面菌体挑取一接种环接种至PD液体培养基a，在28℃、200r/min条件下振荡培养10天，获得种子液；所述PD液体培养基a终浓度组成为：马铃薯300g/L、葡萄糖20 g/L，溶剂为水，pH7.0；

（3）发酵培养：将步骤（2）获得的种子液按照20mL种子液/1000g发酵培养基的比例接种至固体发酵培养基a中，25℃发酵培养20天，获得含石斛小菇F48的固体菌块，将菌块粉碎，获得所述石斛小菇F48纯培养物；所述固体发酵培养基a终浓度组成为：木屑820 g/L、麸皮270g/L、玉米粉270 g/L、稻糠140 g/L、草灰140 g/L、泥炭1360g/L，溶剂为水，pH 7.0。

3.如权利要求1所述石斛小菇F48复合菌剂，其特征在于所述木霉菌纯培养物按如下步骤制备：

①斜面培养：将木霉菌接种至PDA固体培养基b，25℃培养14天，获得斜面菌体；所述PDA固体培养基b终浓度组成为：马铃薯300g/L、葡萄糖20 g/L、琼脂15~20 g/L，溶剂为水，pH 7.0；

②种子培养：从斜面菌体挑取一接种环接种至PD液体培养基b，在28℃、200r/min条件下振荡培养10天，获得种子液；所述PD液体培养基b终浓度组成为：马铃薯300g/L、葡萄糖20 g/L，溶剂为水，pH 7.0；

③发酵培养：将步骤②获得的种子液按照20mL种子液/1000g发酵培养基的比例接种至固体发酵培养基b中，25℃发酵培养20天，获得含木霉菌的菌块，将菌块粉碎，获得所述木霉菌纯培养物；所述固体发酵培养基b终浓度组成为：木屑820 g/L、麸皮270 g/L、玉米粉270 g/L、稻糠140 g/L、草灰140 g/L、泥炭1360 g/L，溶剂为水，自然pH值。

4.一种权利要求1所述石斛小菇F48复合菌剂在石斛培养中的应用，其特征在于所述石斛小菇F48复合菌剂的使用量为3g/株石斛苗。

5.一种权利要求1所述石斛小菇F48复合菌剂在石斛培养用肥料中的应用，其特征在于所述肥料是将泥炭、蛭石和木屑按质量比1:1:1混合成营养土，然后按营养土与石斛小菇F48复合菌剂质量比30:1的比例加入石斛小菇F48复合菌剂组成所述肥料。