CN102899315A

CN102899315A - 一种隐性混合池测序基因克隆方法

Info

Publication number: CN102899315A
Application number: CN2011102164549A
Authority: CN
Inventors: 彭海; 张静; 周俊飞; 章伟雄
Original assignee: Jianghan University
Current assignee: Jianghan University
Priority date: 2011-07-29
Filing date: 2011-07-29
Publication date: 2013-01-30

Abstract

本发明公开了一种隐性混合池测序基因克隆方法。此方法包括以下步骤：亲本杂交构建分离群体；按个体目标性状的差异对分离群体分池，通过高通量测序亲本获得显性与隐性亲本特异位点，与隐性混合池测序结果比较获得候选基因；富集隐性混合池中候选基因并重测序克隆目标基因。本发明以测序为基础，可用于任何物种，直接克隆基因本身。采用本发明的方法，工作量大为减少，速度大为加快，而且降低了风险。

Description

一种隐性混合池测序基因克隆方法

技术领域

本发明属于遗传学领域，公开了一种隐性混合池测序基因克隆方法。

背景技术

自然界物种性状丰富多样，如株高、抗病性、产量等。从孟德尔时代起，就逐渐认识到了性状是由遗传因子控制，摩尔根进一步将遗传因子明确为“基因”，并指出基因位于染色体上且呈线性排列。确定基因在染色体上具体的位置(基因定位)是研究性状的基础，也是分离、克隆并利用基因的前提。

经典的基因定位策略源于摩尔根的连锁理论，即染色体上相邻基因(即基因连锁)不能自由分离，而是倾向于整体向后代传递，它们所控制的性状也倾向于同时出现。二者相邻越近，性状同时出现的可能性越大，重组性状越少。因此，由重组性状(配子)的比例可以度量二者间的距离。若已知道其中一个基因在染色体上的位置(我们称这样的基因为标记基因)，就可以根据重组率推断另一个基因的位置。例如，黄色圆粒豌豆品种(基因型分别为YYRR)与绿色皱粒品种(基因型为yyrr)杂交产生F₁(基因型YyRr)，F₁自交可能产生YR、Yr、yR和yr 4种配子，根据F₂代的性状表现可以确定它们的比例，进而计算交换率。若交换率为1％，且已知控制颜色的Y基因位于第3染色体上，那么就可以推测，控制豌豆籽粒形状的R基因位于第3染色体且与Y基因相距1cM。从以上的分析可以看出，经典连锁标记定位的实质是找到与目标性状连锁的已知分子标记，并计算二者的交换率，进而推断目标基因的位置。分离群体分池是基因定位的实际操作策略，仍以上述实例进行说明。以籽粒形状为标准，将F₂群体划分为两个部分(池)：显性池(随机抽取的圆粒单株)和隐性池(随机抽取的皱粒单株)，比较豌豆基因组上已知的1000个SSR标记(SSR1-SSR1000)扩增产物在这两个池间的差异。若标记SSR17与籽粒形状R/r连锁，那么对籽粒形状分池，也就相当于对SSR17分池，因此，SSR17在两个池间的扩增产物是有差异的，相反就没有差异，由此确定目标基因与SSR17处于同一染色体。再分析F₂各个单株的表现，计算R/r与SSR17的遗传距离，即可进一步定位R/r在该染色体上的具体位置。

分子标记连锁定位基因经过几十年的发展，已成为基因定位的经典方法，但该方法依旧存在明显缺陷，主要表现如下：

(1)经典定位方法依赖于分子标记，分子标记分为两种，一种为通用标记，如RAPD、AFLP等，可用于任何物种，但这些标记在染色体上的位置信息不明确，因此，利用它们定位基因极为耗时耗力且十分困难，利用这类标记定位的基因相当有限。另一类标记是已知染色体信息的，如SSR标记。只要找到了与性状连锁的标记，就相当于找到目标基因的大致位置，目前大部分性状是利用此类标记定位的。然而，已开发此类标记的物种只占了很少一部分，绝大部分自然界的有利基因无法通过这一方法定位、克隆和利用。

(2)找到的是与目标基因连锁的分子标记，即得到的是包含目标基因的区段，而不是目标基因本身，还需要基因预测和大量验证工作以排除区段内非目标基因，当区段较大时，该工作十分困难甚至难以完成。而且易漏掉基因，如很小的蛋白分子、非编码基因等。

(3)要求定位群体遗传距离大，找到连锁标记的可能性才大。从而导致一些问题。第一，过大遗传距离常导致性状偏分离，需另建群体调查性状分离比，增加了工作量。第二，远缘杂交难以用于育种，导致基因定位理论研究与育种应用实践脱节，这违背了基因定位的初衷。

(4)精细定位时，连锁标记与目标基因距离很近，发现多态性标记变得越来越难，常出现无标记可用的情况。另外，相邻很近导致交换很难发生，要获得准确的交换率，群体要求很大。而交换率计算是定量分析，需要检查群体每一个单株，工作量十分巨大。

发明内容

本发明实施例的目的是针对上述现有技术的缺陷，提供了一种能够准确、快速克隆目标基因的新方法。

为了实现上述目的本发明采取的技术方案是：

一种隐性混合池测序基因克隆方法，包括以下步骤：亲本杂交构建分离群体；按每个个体目标性状的差异对分离群体分池，获得隐性池，通过对亲本全基因组高通量测序、组装与比对获得显性与隐性亲本特异位点，与隐性混合池全基因组测序结果比较获得候选位点；通过PCR检测隐性池中每一基因型候选位点，或通过富集隐性池中候选位点后重测序的方式确定目标位点；PCR扩增克隆目标基因，并通过遗传互补实验验证所克隆基因的功能。

本发明更具体的技术方案是：

一种隐性混合池测序基因克隆方法，包括以下步骤：

(1)构建分离群体：利用分别含有相对性状的亲本杂交后分离构建分离群体；

(2)隐性池的获得：随机选择分离群体中目标性状为隐性的个体组成隐性池；

(3)DNA提取：取两个亲本的组织，分别提取并获得两个亲本的基因组DNA；同时将隐性池中个体组织等量混合后再提取DNA，或提取DNA后等量混合，获得隐性池DNA；

(4)确定候选位点：按高通量测序流程分别构建亲本与隐性池文库，PCR并高通量测序；按de novo(直接)组装方式，初步构建两亲本与隐性池全基因组，比对两亲本基因组序列，分别获得显性亲本与隐性亲本中的特异片段；进一步分析亲本基因组后，获得特异片段可能的等位关系；将显性亲本中的特有片段与隐性池测序片段对比，获得隐性池中没有出现过的片段，即为候选位点；

(5)目标基因克隆：通过对隐性混合池中每一单株的每一候选位点进行PCR扩增，或在隐性池中富集候选位点后再次高通量测序，检测显性亲本中特有的候选位点是否在隐性池中出现，若没有出现，则为目标性状的基因位点；通过比对亲本基因组的方式获得基因的全长序列，PCR扩增克隆目的基因；

(6)克隆基因的功能验证：按通用遗传互补实验验证所克隆基因的功能。

所述亲本杂交构建分离群体最好利用遗传距离近的纯系亲本构建，且距离越近越好。

本发明实施例的有益效果是：

(1)可应用于任何物种。本发明以测序为基础，不需要分子标记，可应用于任何物种，大大拓宽了对自然界基因利用的范围，对基因克隆产生了实质性的进步。

(2)直接克隆基因本身。传统克隆方法需要定位基因，获得的是包含目标基因的区域。相比较，本发明直接克隆了目标基因。

(3)工作量大为减少，速度大为加快。传统克隆方法耗时数年是很正常的，本发明群体构建完成后，只需要提取3份DNA、富集1份DNA，并进行2次高通量测序即可完成实验，可在数月内完成，工作量大为减少，速度大为加快。

(4)风险大为降低。传统克隆方法常因缺乏足够或合适的标记而失败。本方案中，只要保证测序覆盖度，即可发现目的基因。大部分步骤有概率保证，具有判断的标准。比如，在隐性池中测得的序列，可以与显性亲本或隐性亲本序列组成比较，以排除测序误差、基因突变等偶然因素的影响。

附图说明

图1是本发明实施例1提供的基因克隆方法流程示意图；

图2是本发明实施例2提供的水稻高杆基因克隆方法流程示意图；

图3是本发明实施例2提供的H3与H41位点PCR扩增结果图。

图3中：M：DL2000 Marker。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为对本发明的限定。

实施例1：

一种隐性混合池测序基因克隆方法(参见图1)

(1)构建分离群体

选择具有相对目标性状的两个亲本进行正反交(除目标性状外，其它性状差异越小越好，可通过突变株/野生株或回交育种产生姊妹系等方式创造这样的亲本)。根据F₁的表现判断控制性状的基因座位是显性还是隐性；根据正反交的性状是否有差异，判断是否具有细胞质效应，若没有差异，表明不受细胞质基因影响，否则该性状与细胞质基因相关；F₁自交形成F₂群体。根据相对性状在F₂群体中植株的比例，判断控制目标性状的基因对数，卡方检验若符合3∶1的分离比，则为1对基因控制，否则为多对基因控制。

(2)隐性池的构建与DNA提取。

从F₂群体中随机选择隐性个体构建隐性池(在保证性状鉴定准确的前提下，隐性池中植株数尽可能多)。将选出的每株叶片或其它组织等量混合后，提取获得隐性池基因组DNA，也可将隐性池的单株分别提取DNA后再等量混合获得隐性混合池DNA。同时分别提取2个亲本的基因组DNA。

(3)全基因组高通量测序与候选基因位点的确定。

按高通量测序操作流程，分别构建两个亲本、隐性混和池的DNA文库，然后进行PCR并上机测序。比对2个亲本的测序片段，获得每一亲本的特异位点，对亲本基因组进行初步的组装(忽略重复序列等不能组装的区域，因为这些区域组通常不含编码基因)，比较这些差异位点在组装后的基因组上的位置，判断它们之间的等位关系。将显性亲本中的特异位点按完全匹配的方式在隐性池中进行比对。完全没有的位点为目标性状的候选位点；等位位点比例接近1∶1的为与目标性状无关的非连锁位点；比例介于1∶0和1∶1之间为与目标性状连锁的位点。设测序时基因组被覆盖了n倍，连锁位点与目标座位遗传距离为m cM，则隐性混合池测序中，该连锁位点不能出现的概率(不能与目标座位区分开，因而被列为候选位点)为(1-m％)ⁿ。若n＝40，m＝5，则该连锁位点将被列为候选位点的概率为12.85％。

(4)目标基因的确定与克隆。

具体操作如下：向安捷伦公司提交候选位点的序列，由安捷伦设计探针，在SureSelect平台上，从隐性混合池中富集所有候选位点。在候选位点不多的情况下，也可采用PCR扩增的方式在隐性混合池中富集候选基因。对富集的候选位点进行高通量测序。假设有3000个植株，在95％的概率保证下，只需要覆盖检测20750倍几乎可检测到所有植株(每个植株至少被抽检到1次)。即使是检测10万倍，对高通量测序来说，也是很容易的，因此，可看作所有植株都被抽检到了。即使遗传距离只有0.1cM，在这些隐性混合池中不能检测到显性候选位点(即依旧不能将目标位点与候选位点区分开)的概率仅为(1-0.1％)^2*3000＝0.25％。因此，有99％以上的把握可直接获得目的位点。

本部分的备选方案是：按普通或实时PCR(如高通量的oppenarray或Tagman MGB探针)的方法扩增检测每一候选位点在隐性混合池中的每一单株，对获得的显性亲本中的带型或扩增产物进行普通测序，将测序结果与显性位点的序列比对，若相同，则确认该位点仅为连锁位点，而非目标位点。只有所有隐性混合池单株中都没有出现的显性亲本特有位点才为目标座位。

目标位点获得后，可通过信息学功能预测基因的起始与结束位点，再通过PCR方式克隆获得全长基因。

(5)目标基因功能互补实验。

利用转显性基因于隐性植株或RNAi等经典方法，进行遗传互补实验，验证基因功能，检测所克隆基因的正确性。

实施例2：

下面通过一个具体实施例对本发明作进一步说明：

水稻高杆基因克隆方法(参见图2)：

(1)群体构建

RH23与RS35为育种选育的两个水稻亲本，其中，RH23平均株高为134.56cm，RS35平均株高为87.89cm，二者为姊妹系，除了株高性状外，其余性状基本相同。RH23与RS35进行正反交产生F₁，F₁表现为高杆(平均株高134.49cm)，表明高杆为显性，矮杆为隐性，正反交之间株高没有显著差异，表明株高不受细胞质基因控制。种植F₂共20000株，按株高＞135cm和＜90cm将群体分为高杆和矮杆两个群体，其中高杆13783株，矮杆为4637株，经卡方检验在95％的概率保证下符合3∶1的分离比，表明高杆受一对显性基因控制，定名为HD。从矮杆群体中随机选择3000个植株，每个植株取少许叶片，混合磨样后充分混匀，与亲本RH23和RS35一起分别按植物DNA提取试剂盒(DP305，天更，北京)操作手册分离纯化基因组DNA，利用ND2000超微量分光光度计测定样品浓度与纯度。

(2)亲本、矮杆隐性池测序与候选位点的确定

按高通量测序技术(如Illumina GAIIx或AD/Solid)规程建两个亲本RH23、RS35和矮杆隐性池文库并高通量测序，采用Fragment建库方式，采用条形码对3种基因组DNA进行区分。RH23、RS35和矮杆隐性池测序上样量比例为1∶1∶8。对输出的原始数据进行去除低质量序列等处理后，3个样本的总测序量的Clean data分别为9.3G、7.8G和81.6G。水稻基因组总长约为0.3G，这些测序数据将平均覆盖31，26和272倍水稻基因组，用基因组组装程序ABySS(http://www.bcgsc.ca/platform/bioinfo/software/abyss)对两个亲本RH23和RS35基因组进行初步组装。比较两亲本基因组间的差异，在RH23和RS35基因组间分别有658个特有的差异位点，分别命名为H1，H2，H3……H658和S1，S2，S3……S658。这些特有位点两两之间，除一个碱基外，其余部分均相同，表明它们两两之间可能为等位基因，且均为单碱基点突变位点(因为亲本互为姊妹系，所以差异位点不多，大部分差异位点可能是自然突变后形成，因此为点突变)。将H1，H2，H3……H658与矮杆隐性池的测序数据按完全匹配的原则进行比对，发现其中656个等位位点均出现于矮杆隐性混合池中，表明这些位点没有控制高杆性状。通过比较这56个位点的检测频率与其相对应的隐性亲本的检测频率，发现655个位点比例经均接近于1∶1，进一步证明这些位点与株高性状无关，另有1个位点分别有36次H8完全匹配，252次与S8完全匹配，表明该位点为与株高基因连锁的位点。其余2个位点即H3和H41在矮杆隐性池中没有发现完全匹配的序列，但分别有271和263条序列与S3和S41的完全匹配，其中，H3的碱基序列为序列表中的SEQ ID NO.1。(该序列与RH23相同，在RS35中，本序列中第107个碱基为t)，H41的碱基序列为序列表中的SEQ ID NO.2。(该序列与RH23相同，在RS35中，本序列中第176个碱基为c)。由此，H3与H41被确定为高杆基因的候选位点。

(3)PCR富集差异位点、重测序与目标基因的克隆

根据H3与H41的碱基组成，利用Primer5软件设计引物在隐性混合池中扩增候选位点，引物设计时采用软件的默认参数进行。其中，H3的Sense Primer(正向引物)为序列表中的SEQ ID NO.3。Antisense Primer(反向引物)为序列表中的SEQ ID NO.4。获得的PCR产物为272bp。H41的Sense Primer为序列表中的SEQ ID NO.5。H41的Antisense Primer为序列表中的SEQ ID NO.6。PCR产物为181bp。PCR扩增体系按试剂盒DreamTaq^TM Green PCRMaster Mix(2X)(K1081，Fermentas)推荐比例配比，即PCR混合物50μl、模板15ng、引物2μl(浓度：0.5μM/μL)，加纯水至总体积为100μl。扩增程序如下：94℃预变性4分钟；94℃，1分钟，54℃，1分钟，72℃，2分钟，循环44次；72℃延伸8分钟。扩增产物用3％的琼脂糖凝胶检测，扩增结果参见图3。PCR产物按琼脂糖凝胶回收试剂盒(K0691，Fermentas)操作手册回收并纯化目的DNA片段。按Illumina GAIIx高通量测序技术规程，选用扩增子串联法建库，对以上两个位点进行高通量测序，分别获得101.2M和87.6M测序数据，H3被检测到了198723次，其中198710条序列与H3完全匹配，其余13条序列有1-2个位点不匹配，且不能与S3完全匹配，表明这些序列可能是由测序错误或杂交后的突变引起。H41被检测到了127113次，有12789次与H41完全匹配，1311次与S41完全匹配，表明H3为控制目标性状的位点，H41为与目标性状连锁的位点，二者遗传距离大约为1.04cM。通过以上实验表明，H3为控制水稻高杆的基因座位。将上述H3与初步组装的显性亲本基因组比对，根据H3前后各20K序列，按植物基因组结构预测程序GeneSeqerPlantGDB(http://www.plantgdb.org/cgi-bin/GeneSeqer.cgi)对基因结构进行预测，发现H3位于基因序列内，根据预测的结构，获得预测基因的起始点和结束点，整个基因全长为3123bp，功能预测为赤酶素氧化酶。根据预测基因起始点前500bp和结束点后500bp的碱基序列，按Primer5及其默认参数设计引物(Sense primer为序列表中的SEQ ID NO.7；Antisense primer为序列表中的SEQ ID NO.8)。于RH23亲本中扩增全长基因序列。PCR扩增体系按试剂盒DreamTaq^TM Green PCR Master Mix(2X)(K1081，fermentas)推荐的体系进行，即含PCR混合物50μl，RH23模板15ng，引物2μl(浓度：0.5μM/μL)，加纯水至总体积为100μl。扩增程序如下：94℃预变性4分钟；94℃，1分钟，54℃，3分钟，72℃，3分钟，循环44次；72℃延伸8分钟。扩增产物用2％的琼脂糖凝胶检测。按PCR产物按琼脂糖凝胶回收试剂盒(K0691，Fermentas)操作手册回收并纯化扩增片段并测序，获得控制水稻高杆的目的基因序列为序列表中的SEQ ID NO.9所示。通过以上技术手段，克隆获得了控制水稻株高的基因HD，

(4)功能互补验证

利用根癌农杆菌Ti质粒载体，将HD转入矮杆亲本RS23中，转基因阳性植株表现为高杆，证明HD控制了水稻高杆性状。

以上所述的实施例，只是本发明较优选的具体实施方式的一种，本领域的技术人员在本发明技术方案范围内进行的通常变化和替换都应包含在本发明的保护范围内。

Claims

1.一种隐性混合池测序基因克隆方法，其特征在于，包括以下步骤：亲本杂交构建分离群体；按每个个体目标性状的差异对分离群体分池，获得隐性池，通过对亲本的高通量测序获得显性与隐性亲本特异位点，与隐性混合池测序结果比较获得候选位点；通过PCR检测隐性池中每一基因型候选位点，或通过富集隐性池中候选位点后重测序的方式确定目标位点；PCR扩增克隆目标基因，并通过遗传互补实验验证所克隆基因的功能。

2.根据权利要求1所述的隐性混合池测序基因克隆方法，其特征在于，包括以下步骤：

(3)DNA提取：取两个亲本的组织，分别提取并获得两个亲本的基因组DNA；同时将隐性池中个体组织等量混合后再提取DNA，获得隐性池DNA；

(4)确定候选位点：按高通量测序流程分别构建亲本与隐性池文库，PCR并高通量测序；按直接组装方式，初步构建两亲本与隐性池全基因组，比对两亲本基因组序列，分别获得显性亲本与隐性亲本中的特异片段；进一步分析亲本基因组后，获得特异片段可能的等位关系；将显性亲本中的特有片段与隐性池测序片段对比，获得隐性池中没有出现过的片段，即为候选位点；

(5)目标基因克隆：通过在隐性池中富集候选位点后再次高通量测序，或通过PCR方式检测隐性混合池中每一单株每一候选位点；分析显性亲本中特有的候选位点是否在隐性池中出现，若没有出现，则为目标性状的基因位点；通过比对亲本基因组的方式获得基因的全长序列，PCR扩增克隆目标基因；

(6)克隆基因的功能验证：按通用的遗传互补实验验证所克隆基因的功能。

3.根据权利要求1所述的隐性混合池测序基因克隆方法，其特征在于，所述亲本杂交构建分离群体利用遗传距离近的纯系亲本。