具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明,以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施,但所举实施例不作为对本发明的限定。
本发明的眼部抗皱护肤品实施例用量如下(重量份):
上述眼部抗皱护肤品的制备步骤是:
(1)将420-680份水称好后加入乳化罐中,将卡波姆U 21(丙烯酸(酯)类/C10-30烷醇丙烯酸酯交联聚合物)均匀洒在水表面(尽量不要洒到锅壁上),待浸泡完全(约10min,表面无白色粉末为标准)后,待用;
(2)将甘油,丁二醇,α-甘露聚糖,海藻糖,EDTA 二钠,燕麦紧肤蛋白,燕麦β-葡聚糖,自由基清除剂(本发明的实施例1~11中使用全效自由基清除剂(Wide Spectrum FRS),购自北京华夏众芳生物科技有限公司)、BioAegis(或不加入)和BioCalm(或不加入)分别经200目筛网加入上述乳化罐中;
(3)将双-PEG-18 甲基醚二甲基硅烷,积雪草苷,枸杞子提取物,黄芪总皂苷提取物,黄芪多糖提取物和80-120份水加热溶解完全,经200目筛网加入步骤(2)所得混合物中,真空混合搅拌(300r/min)加热80~85℃保温30min,搅拌(300r/min)降温,当温度降到45℃以下,过200目筛网;
(4)向步骤(3)所得混合物中加入NaOH(重量百分比浓度10%)调节pH值至3.5~8.5,真空搅拌(500r/min)5min;然后加入MTI(或不加入),真空搅拌(500r/min)15min;
(5)将步骤(4)所得混合物降温至38℃,陈化24h后分装。
本发明去离子水为500~800份,分两次加入,在步骤(1)中加去离子水420-680份,在步骤3中加去离子水80-120份。
所述黄芪多糖提取物、黄芪总皂苷提取物、积雪草苷、枸杞子提取物等各种提取物为市售或按照现有技术的常规方法提取,本发明不作详述。
BioAegis(刺激抑制因子)、BioCalm(抗敏止痒剂)(购自北京华夏众芳生物科技有限公司)能明显改善本发明对皮肤的刺激性,减少过敏,MTI(甲基异噻唑啉酮/碘丙炔醇丁基氨甲酸酯,购自托尔专用化学品(上海)有限公司)使本发明质量更加稳定。
按照本发明实施方式所制得的成品功效明显、感官良好、pH值及稠度适中、质量稳定,实施例2的各项指标最好,为本发明最佳实施方式。
本发明对改善眼周皮肤皱纹效果显著,同时具有较好的保湿效果,有较强的增加水分能力和持续锁水效果,安全无刺激,现将有关研究结果报告如下:
一、延缓衰老功效评价
方法:
受试者共计32人。具体性别构成随机确定。期间若有2人出现不良反应,则终止测试;结果未发现不良反应。受试者涂抹了本发明任一实施例制得的眼部抗皱护肤品后,皮肤的粗糙度均有明显改善。
1. 选择受试者左、右眼部作为受试区域。每位受试者左眼涂抹受试样品(本发明任一实施例制得的眼部抗皱护肤品)作为样品组,右眼不涂抹任何样品作为空白对照组。
2. 由技术人员使用MicroSkinⅡ多功能皮肤镜图像分析系统及皮肤含水量测试仪测定实验部位涂抹化妆品前的皮肤纹理度。
3. 每天早晚在经过清水清洗过的受试区(同一区域),涂抹检测产品,实验期间,受试者在实验部位不能涂抹除受测样品外的其它任何化妆品。
4. 受试者在连续使用化妆品一周、两周、三周和四周后,每周同一时间受试者将涂抹部位洗净,由测试者使用MicroSkinⅡ多功能皮肤镜图像分析系统及皮肤含水量测试仪测定涂抹部位数值。
5. 统计受试者实验部位每次测得的数值,分析皮肤纹理度及水分含量的变化规律。
结果:
(一)皮肤纹理变化情况:
变化率=(样品组数据Tn—起始值T0)/起始值T0×100%
相对变化率=(样品组数据Tn—空白对照组数据Tn)/空白对照组数据Tn×100%
T0是试验前受试者皮肤测定值,Tn是各受试者各时间点每次测试时皮肤测定值。
1、皮肤粗糙度(Skin Roughness SR)
是皮肤所有剖面中,以直线上最大灰度峰值和最小灰度峰值之间的差值。该参数是皮肤表面不平度的最大高度。
表1 受试部位皮肤粗糙度与初始值的差值
皮肤粗糙度变化率和相对变化率,分析结果详见图1-图2。
在测试周期4周内,受试部位使用样品后,其皮肤粗糙度一直呈降低趋势。其变化率一直低于空白组,并为负值,相对变化率一直为负值,且均呈降低趋势;样品使用4周后,皮肤粗糙度的变化率为-6.15%,相对起始值存在显著性差异(p<0.05)。
2、皮肤平均粗糙度(Skin Average Roughness SAR)
在目标皮肤的基线上下方皮丘轮廓的算术平均值,即在极限剖面中,按长度极限分为5等分,先求出每段以基线上皮丘轮廓(最大灰度值)和基线下皮丘轮廓(最小灰度值)之间的差值,即皮肤粗糙度,之后再求该长度基线内的粗糙度平均值(算术平均值)即为皮肤平均粗糙度。本参数与皮肤皱纹的数目多少、粗细、深浅有密切的关系。
表2 受试部位皮肤平均粗糙度与初始值的差值
皮肤平均粗糙度变化率和相对变化率,分析结果详见图3-图4。
在测试周期4周内,受试部位使用样品后,其皮肤平均粗糙度一直呈降低趋势。其变化率一直低于空白组,并为负值,相对变化率一直为负值,且均呈降低趋势;样品使用4周后,皮肤平均粗糙度的变化率为-5.52%。
样品使用3周后,皮肤平均粗糙度相对起始值存在显著性差异(p<0.05)。
3、最大粗糙度(Maximum Roughness MR)
指在被切割的皮肤段面中,在直线上相邻的最大灰度峰值和最小灰度峰值的峰谷之间的最大值。即相当于皮肤纹理当中的最大一根皱纹。
表3 受试部位皮肤最大粗糙度与初始值的差值
皮肤最大粗糙度变化率和相对变化率,分析结果详见图5-图6。
在测试周期4周内,受试部位使用样品后,其皮肤最大粗糙度一直呈降低趋势。其变化率一直低于空白组,并为负值,相对变化率一直为负值,且均呈降低趋势,即受试部位的皮肤最大粗糙度有一定的改善效果;样品使用4周后,皮肤最大粗糙度的变化率为-1.55%,相对起始值差异性不明显。
4、平均深度(Skin Smoothness Depth SSD)
指目标皮丘最高点(最大灰度值曲线)和皮沟最低点(最小灰度曲线)的两峰值间平均距离。即皮肤表面轮廓线最高点和皮肤皱纹底线最低点之间的平均距离。
表4 受试部位皮肤平均深度与初始值的差值
平均深度变化率和相对变化率,分析结果详见图7-图8。
在测试周期4周内,受试部位使用样品后,其皮肤平均深度一直呈降低趋势,且受试部位涂抹样品4周后,其皮肤平均深度低于起始值;其变化率一直低于空白组,并为负值,相对变化率一直为负值。其中在样品使用4周后,样品组的变化率为-8.21%,相对变化率为-7.67%,均为最低值。
样品使用4周后,皮肤平均深度相对起始值存在显著性差异(p<0.05)。
5、算术平均粗糙度(Arithmetic Average Roughness AAR)
指目标皮肤直线上灰度曲线到平均灰度值的距离平均值。即在直线长度范围内,被测皮肤表面轮廓线上各点至轮廓中线距离的绝对值的算术平均值。
表5 受试部位皮肤算术平均粗糙度与初始值的差值
算术平均粗糙度变化率和相对变化率,分析结果详见图9-图10。
在测试周期4周内,受试部位使用样品后,其皮肤算术平均粗糙度一直呈降低趋势,且受试部位涂抹样品4周后,其皮肤算术平均粗糙度低于起始值;其变化率一直低于空白组,并为负值,相对变化率一直为负值。其中在样品使用4周后,样品组的变化率为-9.55%,相对变化率为-7.73%,均为最低值。
样品使用4周后,皮肤算术平均粗糙度相对起始值存在显著性差异(p<0.05)。
结果
根据以上试验结果表明:
在测试周期内,受试部位的皮肤粗糙度、平均粗糙度、最大粗糙度、平均深度及算术平均粗糙度,均呈降低趋势,且皮肤粗糙度、平均粗糙度、平均深度及算术平均粗糙度均在第四周存在显著性差异(p﹤0.05),其受试部位的皮肤纹理度有较为明显的改善,即本发明能够明显改善皮肤纹理度。
二、本发明的眼部护肤品的保湿功效评价
方法:
受试者共计30人,具体性别构成和年龄构成随机确定,在测试周期内,受试部位未发现不良反应。
1. 选择受试者左、右手臂依次循环标记:受试区域样品组(本发明任一实施例制得的眼部护肤品)和空白对照区域;
2. 技术人员使用皮肤含水量测试Corneometer CM825、水分经皮肤散失测试Tewameter TM300分别测量受试区域和空白对照区域,取平均值,记为起始值。
3. 在受试者经清水清洗过的实验部位涂抹送检样品,空白对照区域不涂抹任何样品。
4. 受试者在连续使用化妆品一小时、两小时、四小时后,由技术人员使用皮肤含水量测试Corneometer CM825、水分经皮肤散失测试Tewameter TM300分别测量受试区域和空白对照区域5次,取平均值。
5. 统计测得的数值,分析其皮肤水分和水分散失变化规律。
结果分析:
(一)水分含量变化
水分含量变化反映在测试周期内,实验区域水分含量随时间变化规律。其值越大,水分含量越大,反之,水分含量越小。水含量差值(ΔT)= 使用产品后各时间点含水量(Th)- 使用产品前含水量(T0)。
表6 样品组的水分含量与初始值的差值
样品使用1小时后与空白组相比较,样品组的水分含量明显增加;在测试周期4小时内,样品组4的水分含量一直高于空白组。
(二)水合率变化
水合率=(样品组水分含量—起始水分含量)/ 起始水分含量。
分析结果详见图11和表7。
表7 样品的水分含量随时间的变化与其起始值的T检验结果
时间(h) | 0 | 1 | 2 | 4 |
T值 | -- | 5.175 | 4.021 | 2.908 |
P值 | -- | <0.05 | <0.05 | 0.007<0.05 |
由图11可以看出,空白组的水合率变化相对稳定,样品组在样品使用1小时后,其水合率明显高于空白组,且达到最高;4小时内样品组的水合率一直高于空白组。与空白组相比,样品有明显的补水效果,且持续补水能力佳。
由表7可看出,在测试周期4小时内,受试部位涂抹样品1小时后,受试部位的水分含量明显升高(p<0.05),即从第1小时开始存在显著性差异,其4小时内的水分含量明显高于起始值(p<0.05)。
(三)相对水分增加率
水分相对增加率,即相对保湿率=(样品组水分含量—空白组水分含量)/空白组水分含量;此值越大,说明试验样品相对空白样品保湿效果越明显。
水分相对增加率,分析结果详见图12。
由图12可以看出,受试部位涂抹样品1小时后,样品组的相对水分增加率明显升高,且在测试周期4小时内,样品组的水分相对增加率一直为正值,说明相对于空白组,样品组的补水效果明显。
(四)水分散失情况
水分散失变化反映在测试周期内,实验区域水分散失随时间变化规律。其值越小,水分散失越少,锁水能力越强;反之,锁水能力越弱。失水量差值(ΔT)= 使用产品后各时间点失水量(Th)- 使用产品前失水量(T0)。
表8 样品组的失水量与初始值的差值
样品使用1小时后与空白组相比较,样品组的水分散失量明显降低;在测试周期4小时内,样品组的水分散失量一直低于空白组。
(五)水分散失率
失水率=(样品组水分散失量—起始水分散失量)/ 起始水分散失量。此值越小,说明水分散失越少,试验样品锁水效果越明显。
失水率,分析结果详见图13。
表9 样品水分散失量随时间的变化与其起始值T检验结果
时间(h) | 0 | 1 | 2 | 4 |
T值 | -- | -3.297 | -2.600 | -3.372 |
P值 | -- | 0.003<0.05 | 0.015<0.05 | 0.002<0.05 |
由图13可以看出,在测试周期内,受试部位涂抹样品1小时后,样品组的失水率明显低于空白组;在测试周期4小时内,样品组的失水率一直低于空白组,且一直为负值,样品使用4小时后,受试部位的失水率达到最低;样品与空白组相比,有即时锁水效果,且持续锁水能力佳(p<0.05)。
由表9可看出,在测试周期4小时内,受试部位涂抹样品1小时后,受试部位的失水量明显降低(p<0.05),即从第1小时开始存在显著性差异,其4小时内的水分散失量明显低于起始值(p<0.05)。
(六)水分相对散失率
相对失水率=(样品组水分散失量—空白水分散失量)/ 空白水分散失量。此值越小,说明水分散失越少,试验样品锁水效果越明显。
相对失水率,分析结果详见图14。
由图14可以看出,在使用样品后,样品组的相对失水率一直为负值,即相对空白组,样品组4小时内的失水量明显降低。
结果
根据以上试验结果表明:
1、在测试周期4小时内,受试部位涂抹抗皱眼部啫喱后,样品使用1小时后,皮肤水分含量相对起始值存在显著性差异(p<0.05),即有即时补水的能力,且效果明显; 4小时内持续补水能力佳(p<0.05)。
2、在测试周期4小时内,受试部位涂抹抗皱眼部啫喱后,样品使用1小时后,皮肤失水量相对起始值存在显著性差异(p<0.05),有即时锁水的能力,且效果明显; 4小时内持续锁水能力佳(p<0.05)。
三、本发明眼部抗皱护肤品的刺激性测试结果
实验方法:
参照ECVAM DB-ALM:INVITTOX protocol;Red Blood Cell Test System INVITTOX n°37,以下简称RBC Test System。
Red Blood Cell(RBC)Test System 是欧洲替代方法认证中心认证的权威测试产品刺激性的试验方法,该方法旨在替代之前的Draize 动物试验。
RBC Test System的基本原理是测定化学物对细胞膜的损伤和因此导致的细胞膜渗透性的改变,通过测定从血红细胞中漏出的血红蛋白的量来评价细胞膜的损伤程度,该损伤程度与产品的刺激性具有直接相关性。
使用分光光度法测定化学物作用后的血红细胞悬液的吸光度,可计算出溶血率和H50值(即使50% 血红细胞发生溶血的受试物的浓度值)。此H50值与Draize 试验两种评分标准即最大平均值(MAS) 和24h作用值的结果及其组成参数(角膜、结膜、虹膜) 的评分进行相关性分析显示较好的一致性。在相同浓度下,样品的溶血率越高表明样品的刺激性越强。
产品刺激性检测:根据产品对血红细胞细胞膜的刺激,可使血红细胞膜破裂,达到一定程度的溶血现象。在相同浓度下,产品的溶血率越高表明产品的刺激性越强。
产品抗刺激性检测:建立原料与血红细胞的PBS体系,假设原料对血红细胞有一定程度的保护作用,加入能达到50%溶血的特定体积量的表面活性剂SDS,刺激体系中的血红细胞,在530nm下测量吸光度,吸光度值越大,说明细胞溶血率越高,原料的抗刺激能力越弱。吸光度值越小,说明细胞溶血率越低,原料的抗刺激能力越强。
实验内容
1) 血红细胞(RBC)的制备和储存 :新鲜动物血液盛装于聚乙烯塑料容器中,与抗凝血剂混匀。立即将混匀血样保温于保温箱中。规定时间内运回实验室,若血样没有受到污染,时间可延长。
用聚乙烯无菌离心管分装采集的血液样本,室温下,用缓冲液反复冲洗血液样本。此过程能去除大量的白细胞、血浆和黄色的碎片。处理好的血液样本,密封,冰箱保存备用。
实验前,将RBC取出稳定于室温,以PBS调RBC终浓度为规定浓度待用,整个过程无菌操作。
2) RBCH50测定:按照RBC Test System方法中规定,用质量比为0.1%的十二烷基硫酸钠(SDS)检测所采集红细胞的完整性,同时在显微镜下观察红细胞的形态和细胞膜的完整性。确定致红细胞溶血的H50。
3) 样品自身刺激性检测:按照RBC Test System方法中规定,将样品(本发明任一实施例制得的眼部抗皱护肤品)用PBS(磷酸盐缓冲液)分别稀释成终浓度1.0%的液体,用其检测样品的刺激性。
实验分为2组:①阳性对照组;②测试样品组
阳性对照组和测试样品组的比较可表征该样品的刺激性。
实验结果:
1、RBC完整性的评估
按照RBC Test System方法中规定,用质量比为0.10%的十二烷基硫酸钠(SDS)检测所采集红细胞的完整性,同时在显微镜下观察红细胞的形态和细胞膜的完整性。
结果见图15和图16,图15中添加SDS为:SDS含量为0.10%的PBS稀释液。
由图15可得此次红细胞的H50约为28.7×10-6,符合Test System标准中规定(29.4±3.7)×10-6。
图16显示在显微镜下,红细胞形态和细胞膜均完整。
2、样品刺激性测试
样品在体系中的浓度为4000μg/mL时,未发生血红细胞溶血现象,溶血率为0.90%,低于20%,即H50>4000μg/mL(SDS的 H50=26.1μg/mL)时,样品没有使血红细胞发生明显的溶血现象。
样品在体系中的浓度为8000μg/ml时,未发生血红细胞溶血现象,溶血率为1.02%,低于20%,即H50>8000μg/ml(SDS的 H50=26.1μg/ml)时,样品没有使血红细胞发生明显的溶血现象。
三、人体斑贴实验结果
实验过程: 受试者共计30人,具体性别构成和年龄构成随机确定(符合《化妆品接触性皮炎诊断标准及处理原则》纳入、排除标准)。
选用合格斑贴材料,将依本发明任一实施例制得的样品放入斑试器内(样品用量为0.020~0.025g),对照孔为空白(不置任何物质)。将样品和空白对照均贴于受试者的前臂曲侧,用手掌轻压使之均匀地贴敷于皮肤上,持续24h。去除斑贴器后间隔30min,待压痕消失后观察皮肤反应。斑贴试验后24h和48h分别再观察一次,观察皮肤反应。
判定标准:
根据《化妆品接触性皮炎诊断标准及处理原则》分类判定:受试部位无反应为(0),皮肤出现淡红斑为(1),皮肤出现红斑、浸润或丘疹为(2),皮肤出现水肿性红斑、丘疹为(3),皮肤出现显著红肿、伴丘疹或大疱为(4)。
30例中出现2级皮肤不良反应的人数多于2例,或出现任何1例3级或3级以上皮肤不良反应时,判定受试物对人体有不良反应。
具体结果评价如下表所示:
表10去除斑试器0.5小时观察结果
样品 | 阴性反应(0) | 淡红斑、皮肤干燥、褶皱(1) | 红斑、水肿、丘疹、风团、脱屑裂隙(2) | 明显红斑、水肿、水疱(3) | 重度红斑、水肿、大疱、糜烂、色素沉淀或色素减退、痤疮样改变(4) |
空白 | 30 | 0 | 0 | 0 | 0 |
本发明 | 30 | 0 | 0 | 0 | 0 |
表11 去除斑试器24小时观察结果
样品 | 阴性反应(0) | 淡红斑、皮肤干燥、褶皱(1) | 红斑、水肿、丘疹、风团、脱屑裂隙(2) | 明显红斑、水肿、水疱(3) | 重度红斑、水肿、大疱、糜烂、色素沉淀或色素减退、痤疮样改变(4) |
空白 | 30 | 0 | 0 | 0 | 0 |
本发明 | 30 | 0 | 0 | 0 | 0 |
表12去除斑试器48小时观察结果
样品 | 阴性反应(0) | 淡红斑、皮肤干燥、褶皱(1) | 红斑、水肿、丘疹、风团、脱屑裂隙(2) | 明显红斑、水肿、水疱(3) | 重度红斑、水肿、大疱、糜烂、色素沉淀或色素减退、痤疮样改变(4) |
空白 | 30 | 0 | 0 | 0 | 0 |
本发明 | 30 | 0 | 0 | 0 | 0 |
实验结果表明:此次实验中样品斑贴试验结果,根据2007《化妆品卫生规范》的要求,判定本发明的眼部抗皱护肤品对人体皮肤无不良反应。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例,本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换,均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。