CN102858793A - Bmp-2亲和肽 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了BMP-2亲和肽。更具体地讲，公开了一种亲和生物基质，其中所述亲和肽共价地连接到可生物降解的生物相容性聚合物。所述亲和生物基质可用于制备BMP-2控释装置。

Description

BMP-2亲和肽
技术领域
本发明涉及骨形态发生蛋白-2(BMP-2)的特异性亲和肽。另外，本发明涉及这些亲和肽在BMP-2控释装置中的应用。
背景技术
BMP-2是一种属于称为转化生长因子β(TGF-β)的超家族的蛋白质。已知BMP-2可诱导骨和软骨的形成。例如，BMP-2已被用于通过手术植入与该蛋白质组合的胶原基质来促进骨修复。BMP-2以水性悬浮液的形式加载到可吸收的胶原海绵中。BMP-2与胶原非特异性地缔合。然而，由于胶原原纤维对BMP-2的低结合能力(反之亦然)，BMP-2可能会从胶原基质渗漏出去。BMP-2从胶原海绵的这种渗漏会导致在植入部位或其附近出现不良的旺盛骨形成和/或异位骨形成。不良的骨骼生长会引起进一步的并发症，导致病人需要一项或多项额外矫正手术。
因此，需要一种BMP-2控释装置来消除在不希望的位置的骨形成的问题性副作用。制备控释装置的标准方法包括使用聚合物基质，通常为微球、棒、片或丸的形式，其用于封装活性剂。已知有多种技术可将活性剂掺入到聚合物基质中。例子包括对具有离散性(discrete)大小或形状的颗粒的溶剂蒸发、喷雾干燥、乳化、熔融共混和简单物理混合。由于肽或蛋白质的微妙性质，这些方法均不可应用于将这些分子掺入到聚合物中。肽和蛋白质容易因为溶剂、乳化、高温和(尤其是)最终灭菌而变性。
因此，需要一种制备BMP-2控释装置的方法，并且该方法不会使蛋白质变性或失去活性。还期望一种能提供蛋白质的局部持续释放从而避免不期望的异位骨形成的BMP-2控释装置。
发明内容
本文描述了BMP-2亲和肽。这些亲和肽对BMP-2具有特异性亲和力，可用于制备亲和生物基质。还描述了BMP-2控释装置，其由亲和生物基质和BMP-2制备而成。
附图说明
图1.对BMP-2具有特异性亲和力的氨基酸序列(亲和肽)，其包含线性肽和受二硫键约束的肽。
图2.控释装置的图形表示，其包含亲和生物基质和BMP-2。
图3.BMP-2噬菌体ELISA测定证实了从噬菌体选择产生的噬菌体展示肽结合到BMP-2。
图4A.用递增的噬菌体数目/孔进行的验证性和交叉反应性噬菌体ELISA测定，显示出最小交叉反应的结合噬菌体。
图4B.用递增的噬菌体数目/孔进行的验证性和交叉反应性噬菌体ELISA测定，显示出高度交叉反应的结合噬菌体。
图4C.用递增的噬菌体数目/孔进行的验证性和交叉反应性噬菌体ELISA测定，显示出在高噬菌体浓度(1010个噬菌体/孔)下交叉反应的结合噬菌体。
图5A.对人IgG的交叉反应性噬菌体ELISA测定。
图5B.对人血清白蛋白(HSA)的交叉反应性噬菌体ELISA测定。
图6.亲和肽与BMP-2的浓度依赖性结合，采用放大发光接近均匀测定法(amplified luminescent proximity homogenous assay，ALPHA)。
图7.通过评估在存在BMP-2的情况下3天后小鼠(MCH 1/26)成骨细胞的碱性磷酸酶活性得出的亲和肽对BMP-2受体结合的功能干扰。
图8A.用于将SEQ ID NO：6缀合到包含乙酰化N端和接头的胶原基质的肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：23)。
图8B.耦联了SEQ ID NO：23后的胶原亲和生物基质的扫描电子显微镜(SEM)图象。
图9.加载到胶原生物基质及胶原亲和生物基质盘中的BMP-2的掺入百分比。
图10.体外释放研究，示出在36天时间里从胶原生物基质及胶原亲和生物基质盘释放的BMP-2的量。
图11A.突变型噬菌体ELISA，示出结合到BMP-2的SEQ ID NO：3片段。
图11B.突变型噬菌体ELISA，示出结合到BMP-2的SEQ ID NO：6片段。
图12.用于鉴定结合到BMP-2的SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：6片段的氨基酸序列，以及结合到BMP-2的片段的氨基酸序列。
图13.体外释放研究，在包含2％热灭活的胎牛血清(FBS)的磷酸缓冲盐水(PBS)中进行，示出在15天时间里从胶原生物基质及胶原亲和生物基质盘释放的BMP-2的量。
图14.用于体内笼状植入物测试系统的不锈钢腔室的图象。
图15.体内释放研究，示出在7天时间里从胶原生物基质及胶原亲和生物基质盘释放的BMP-2的量。
具体实施方式
本文描述了BMP-2亲和肽。在一个实施例中，BMP-2是重组人BMP-2。BMP-2亲和肽表示该肽对BMP-2具有特异性结合亲和力。该肽可以为线性的或受二硫键约束的。在一个实施例中，BMP-2亲和肽为图1所示亲和肽中的任一个。在另一个实施例中，亲和肽可以是图1所示亲和肽中的任一个的片段。虽然亲和肽具有对BMP-2的特异性亲和力，但是亲和肽不会干扰BMP-2的生物活性。这些亲和肽可用于制备BMP-2控释装置。
图1所示的BMP-2亲和肽使用美国专利No.US6472147中所述的pIX噬菌体展示技术进行鉴定。使用高复杂性的初级肽噬菌体文库(每个文库109个肽序列)来选择BMP-2亲和肽。更具体地讲，将生物素酰化BMP-2固定在涂布链霉抗生物素蛋白的ELISA板上，并引入在pIX次要外壳蛋白上展示肽序列的噬菌体。将未结合到BMP-2上的噬菌体冲洗掉，并对结合到BMP-2的噬菌体进行分离和扩增。将结合到BMP-2的分离噬菌体作为输入用于按照上述程序进行第二轮选择，共计三轮选择。在第三轮结束时，对结合到BMP-2的噬菌体进行测序以确定负责结合到BMP-2的肽。对BMP-2具有亲和力的肽列于图1中。
BMP-2亲和肽可用于制备亲和生物基质。亲和生物基质通过将至少一种如上所述的BMP-2亲和肽共价连接至可生物降解的生物相容性聚合物来制备。此外，亲和生物基质可用作BMP-2控释装置。代表性的实施例以图示方式示出于图2中。BMP-2控释装置包含亲和生物基质和BMP-2。
用于制备亲和生物基质的可生物降解的生物相容性聚合物可以是天然聚合物、合成聚合物以及它们的组合。可生物降解的聚合物在暴露于潮湿的身体组织时容易分解成小片段。这些片段随后会被身体吸收或排泄。更具体地讲，由于生物降解的片段被身体吸收或排泄，使得体内不会永久性保留痕量或残余片段，因此不会引起永久性的慢性异物反应。
合适的天然聚合物包括但不限于蛋白质，诸如胶原、弹性蛋白、角蛋白、丝、葡糖胺聚糖(GAG)、凝血酶、纤连蛋白、明胶、纤维蛋白、弹性蛋白原、多肽、层粘连蛋白、蛋白聚糖、纤维蛋白胶、纤维蛋白凝块、富血小板血浆(PRP)凝块、贫血小板血浆(PPP)凝块、自组装肽水凝胶和去端肽胶原(atelocollagen)；多糖，诸如淀粉、果胶、纤维素、烷基纤维素(如甲基纤维素)、烷基羟烷基纤维素(如乙基羟乙基纤维素)、羟烷基纤维素(如羟乙基纤维素)、硫酸纤维素、羧甲基纤维素的盐、羧甲基纤维素、羧乙基纤维素、几丁质、羧甲基几丁质、透明质酸、透明质酸的盐、藻酸盐、交联藻酸盐藻酸、丙二醇藻酸盐、糖原、葡聚糖、硫酸葡聚糖、凝胶多糖、果胶、普鲁兰多糖、黄原胶、软骨素、硫酸软骨素、羧甲基葡聚糖、羧甲基壳聚糖、壳聚糖、肝素、硫酸肝素、乙酰肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸皮肤素、硫酸角质素、卡拉胶、壳聚糖、淀粉、直链淀粉、支链淀粉、聚-N-葡糖胺、聚甘露糖醛酸、聚葡糖醛酸以及衍生物；聚核苷酸，诸如核糖核酸、脱氧核糖核酸，以及它们的组合。
在一个实施例中，天然聚合物为胶原。在另一个实施例中，天然聚合物可获自脱细胞组织(decellularized tissue)。脱细胞组织可从自体组织、同种异体组织或异种组织获得。合适的脱细胞组织包括但不限于皮肤、骨膜、软骨膜、滑膜、筋膜、肠系膜(mesenter)、骨骼、腱等。
合适的合成聚合物的例子包括但不限于脂族聚酯、聚(氨基酸)、共聚(醚-酯)、聚亚烷基草酸酯、聚酰胺、聚(亚胺基碳酸酯)、聚原酸酯、聚氧杂酯、聚酰胺酯、含胺基团的聚氧杂酯、聚(酸酐)、聚磷腈、生物分子以及它们的共混物。出于本发明的目的，脂族聚酯包括但不限于下列单体的均聚物和共聚物及其聚合物共混物：丙交酯(包括乳酸、d-、l-和内消旋丙交酯)、乙交酯(包括乙醇酸)、ε-己内酯、对二氧杂环己酮(1，4-二氧六环-2-酮)、三亚甲基碳酸酯(1，3-二氧六环-2-酮)、三亚甲基碳酸酯的烷基衍生物、δ-戊内酯、β-丁内酯、γ-丁内酯、ε-癸内酯、羟基丁酸酯(重复单元)、羟基戊酸酯(重复单元)、1，4-二氧杂环庚烷-2-酮(包括其二聚体1，5，8，12-四氧杂环十四烷-7，14-二酮)、1，5-二氧杂环庚烷-2-酮、6，6-二甲基-1，4-二氧六环-2-酮、2，5-二酮吗啉、新戊内酯、α，α-二乙基丙内酯、碳酸亚乙酯、草酸乙烯酯、3-甲基-1，4-二氧六环-2，5-二酮、3，3-二乙基-1，4-二氧六环-2，5-二酮和6，8-二氧杂双环辛烷-7-酮。
合适的脂族聚酯包括但不限于下列单体的均聚物和共聚物及其聚合物共混物：丙交酯(包括乳酸、D-、L-和内消旋丙交酯)、乙交酯(包括乙醇酸)、ε-己内酯、对二氧杂环己酮(1，4-二氧六环-2-酮)、三亚甲基碳酸酯(1，3-二氧六环-2-酮)、三亚甲基碳酸酯的烷基衍生物、δ-戊内酯、β-丁内酯、γ-丁内酯、ε-癸内酯、羟基丁酸酯(重复单元)、羟基戊酸酯(重复单元)、1，4-二氧杂环庚烷-2-酮(包括其二聚体1，5，8，12-四氧杂环十四烷-7，14-二酮)、1，5-二氧杂环庚烷-2-酮和6，6-二甲基-1，4-二氧六环-2-酮。
在一个实施例中，可生物降解的生物相容性聚合物和BMP-2亲和肽具有合适的活性基团和相应的官能团以将亲和肽共价连接到聚合物。活性基团和官能团可以在聚合物、亲和肽以及它们的组合上。合适的活性基团包括但不限于芳基叠氮化物、碳二亚胺、肼、羟甲基膦、亚氨酸酯、异氰酸酯、羰基、马来酰亚胺、NHS酯、PFP酯、硫醇、吡啶基二硫化物和/或乙烯基砜等。合适的官能团包括但不限于羟基、羧基、醛、酯、硫醇、胺、烯烃、炔烃、烷基卤、肼和/或叠氮化物官能团。有机化学或高分子化学领域的技术人员将能够用上述合适的活性基团和相应官能团将亲和肽及聚合物官能化，以使亲和肽共价连接到聚合物。例如，可以使用简单的碳二亚胺化学作用，将从胶原展示的赖氨酸残基上的胺官能团连接到亲和肽的C末端羧基基团。
任选地，可将接头序列添加到图1所示的肽，以提高亲和肽对BMP-2的结合性。接头序列可以为(SGG)n或(XXX)n，其中X可以是丝氨酸、甘氨酸、丙氨酸或苏氨酸的任何组合。在一个实施例中，重复单元数n为约1至约10。在另一个实施例中，重复单元数n为约3至约5。
例如，亲和生物基质可由可溶性和/或纤维状的I型牛胶原制成。简单地说，将胶原在水中的均质化悬浮液(具有约10mg/mL至约100mg/mL的浓度)浇注到模具中，然后冻干。在热脱水步骤之后，使用1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDC)/N-羟基磺基琥珀酰亚胺(磺基-NHS)耦联化学反应将亲和肽缀合至胶原。这样制备的胶原亲和生物基质为多孔三维泡沫支架的形式。
亲和生物基质可用作BMP-2控释装置。BMP-2控释装置包含亲和生物基质和BMP-2。可以加载到亲和生物基质的BMP-2的量取决于缀合到可生物降解的生物相容性聚合物的亲和肽的量。可生物降解的生物相容性聚合物上存在的亲和肽的量可等于或大于控释装置中所需BMP-2的量。因此对于1摩尔的要递送的BMP-2，可能至少有1摩尔的亲和肽。本领域的技术人员将能够确定骨修复的控释装置中需要的BMP-2量。该控释装置可以为海绵、颗粒、注射用凝胶或液体、膜、薄膜、纤维和基于纤维的支架等形式。
在一个实施例中，控释装置为注射用凝胶或液体的形式，其中亲和生物基质在水溶液中并含有BMP-2。合适的水溶液的例子包括但不限于生理缓冲溶液、盐水、水、缓冲盐水、磷酸盐缓冲溶液、Hank′s平衡盐溶液、PBS、Tris缓冲盐水、Hepes缓冲盐水，以及它们的混合物。用于制备注射用凝胶或液体装置的聚合物可选自上述的天然或合成聚合物。在注射用液体或凝胶的情况下，亲和生物基质可以以约10mg/mL至约150mg/mL的量存在于水溶液中。
任选地，还可将合成骨矿物质掺入到BMP-2控释装置中以定制用于特定应用的机械性能。例如，可以掺入具有生物活性的无机物以增加生物基质的拉伸强度，所述无机物包括但不限于羟基磷灰石、氟代羟基磷灰石和/或硅酸盐。
BMP-2控释装置还可以任选地具有掺入在其中的细胞。合适的细胞类型包括但不限于骨细胞、成骨细胞、软骨细胞、干细胞、多能干细胞、脐带细胞、基质细胞、间充质干细胞、骨髓细胞、胚胎干细胞；衍生自脂肪组织的前体细胞；外周血祖细胞；分离自成体组织的干细胞；基因转化细胞；以及它们的组合。
BMP-2控释装置可以作为试剂盒出售，其包含无菌亲和生物基质和无菌BMP-2冻干粉。包含在试剂盒中的亲和生物基质和BMP-2可以使用常规灭菌程序进行灭菌，常规灭菌程序可包括但不限于电子束、γ辐照和灭菌制备方法。
BMP-2控释装置允许人们以受控方式局部递送BMP-2。该控释装置可以植入或注入需要骨修复或再生的部位。这种局部递送有助于消除现有递送方法所导致的旺盛骨形成和/或异位骨形成的不期望的效应。异位骨形成的这一减少继而会降低这些植入物的失败率，从而提高患者的生活质量。
实例
实例1-使用噬菌体展示进行的BMP-2亲和肽选择
使用高复杂性的初级肽噬菌体文库(每个文库109个肽序列)来选择BMP-2亲和肽。更具体地讲，将生物素酰化BMP-2固定在涂布链霉抗生物素蛋白的ELISA板上，并且引入在pIX次要外壳蛋白上展示肽序列的噬菌体。将未结合到BMP-2的噬菌体冲洗掉，并对结合到BMP-2的噬菌体进行分离和扩增。将结合到BMP-2的分离噬菌体作为输入用于按照上述程序进行第二轮选择，共计三轮选择。
使酶联免疫吸附剂测定(ELISA)板装载200微升/孔的含5微克/mL链霉抗生物素蛋白的磷酸缓冲盐水(PBS)，并在4℃下保持过夜。每次选择涂布两个孔。然后使用96孔ELISA洗板机将涂布链霉抗生物素蛋白的ELISA板用含吐温20(TBST)的Tris缓冲盐水洗涤三次，随后加载含有浓度为5微克/mL的生物素酰化BMP-2(明尼苏达州明尼阿波利斯的安迪生物科技有限公司(R&D Systems Minneapolis，MN)，产品号355-BM/CF)的PBS溶液。将这些板在室温下保持30分钟。同时，用1mL含3％脱水牛奶的TBST溶液封闭Eppendorf管(1mL体积，每个文库一个)。将Eppendorf管在室温下翻转30分钟。在补加有四环素的2x YT培养基中，于37℃摇动器上开始两组MC1061F’GII大肠杆菌培养。随后弃去Eppendorf管中的封闭溶液，并更换为100微升的肽库和300微升的含3％牛奶的TBST溶液。将此溶液在室温下翻转1小时。在封闭初级肽噬菌体文库的同时，使用洗板机将涂布链霉抗生物素蛋白并加载BMP-2的孔用TBST洗涤3次。然后在室温下用250微升的含3％牛奶的TBST溶液将板封闭1小时。移除每个孔中的封闭溶液并弃去，并且将肽噬菌体库溶液以200微升/孔的体积加入各个相应的孔。将其在室温下保持1小时。随后移除每个孔中的肽库-牛奶溶液并弃去，并且用TBST将这些孔手工洗涤3次。在每个孔中引入200微升的对数中期噬菌体MC1061F’GII大肠杆菌，并在37℃下温育30分钟。使感染的细菌在50mL补充有四环素的2xYT培养基中于37℃下生长4小时。然后，将细菌通过离心进行分离，并使用PEG/NaCl溶液沉淀噬菌体。将PEG沉淀的噬菌体用于第二轮，并重复以上过程共进行三个循环的选择过程。
在第三轮结束时，对结合到BMP-2的噬菌体进行测序以确定负责结合到BMP-2的肽。在含MC1061F’GII大肠杆菌的顶层琼脂中，接种噬菌体感染的细菌以得到单个噬菌斑。所得的噬菌斑用于使用ELISA分离结合到BMP-2的噬菌体。鉴定出单个噬菌体后，将结合到BMP-2的噬菌体进行扩增、PEG沉淀，并进行序列分析。对BMP-2具有亲和力的肽列于图1中。
这些噬菌体用于实例2中所述噬菌体滴定以及实例3中所述的验证性和交叉反应性噬菌体ELISA测定。
实例2-BMP-2选择输出噬菌体滴定
进行噬菌体滴定，以确定如实例1所述对结合到BMP-2的噬菌体进行PEG沉淀所得到的噬菌体的浓度。
使大肠杆菌MC1061F’GII在补加有四环素的2xYT培养基中于摇动器上(180-250rpm)37℃生长2-3小时。在96孔板中，进行噬菌体稀释，假设PEG沉淀的原液含有1012个噬菌体/mL。简单地说，将100微升的2xYT培养基引入到96孔板的各孔。向第1列引入10微升相应的噬菌体原液。在整个板上进行1∶10的系列稀释直至第12列，得到的噬菌体浓度分别为：1010、109、108、107、106、105、104、103、102、101、100、10-1，其中每行含有不同的噬菌体。对于噬菌斑生长，将1.5微升的各个相应噬菌体系列稀释液引入到涂布了固化顶层琼脂/细菌悬浮液的LB/四环素/X-Ga琼脂板。将这些板在37℃下倒置温育过夜。过夜温育后，选择噬菌斑良好分离并且可以计数的稀释液。用以下公式计算滴定度：(斑块数)(66.7)(10稀释次数-1)×100＝噬菌体/mL，其中66.7为各个孔中噬菌体的稀释倍数，而稀释次数为直到噬菌斑可以计数为止所进行的稀释次数。乘以100后得到噬菌体悬浮原液中每毫升的噬菌体数。
计算出的噬菌体浓度示于表1中。用所获得的噬菌体浓度进行稀释，以用于实例3所述的验证性和交叉反应性噬菌体ELISA测定。
表1
  SEQ ID No.   噬菌体/mL
  1   1.4007E+12
  2   1.334E+12
  3   1.0672E+12
  4   1.1339E+12
  5   4.669E+11
  6   6.67E+11
  7   9.338E+11
  8   5.336E+11
  9   1.4007E+12
  10   1.334E+12
  11   4.669E+11
  12   1.0005E+12
  13   5.336E+11
  14   1.334E+12
  15   8.671E+11
  16   8.004E+11
  17   1.334E+12
  18   1.6675E+12
  19   8.004E+11
  20   7.337E+11
  21   2.1344E+12
  22   1.1339E+12
实例3-验证性和交叉反应性噬菌体ELISA测定
在本实例中，我们确认实例1中所鉴定的噬菌体对BMP-2的结合。此外，我们还测试到噬菌体不显示出对人血清白蛋白和hIgG的结合。
将96孔黑色ELISA板涂布上链霉抗生物素蛋白(行A到D)、hIgG(行E和F)和人血清白蛋白(行G和H)，在PBS中浓度均为5微克/mL。将这些板在4℃下温育过夜。使用洗板机将这些板用TBST洗涤3次。向行C和D中涂布链霉抗生物素蛋白的孔引入100微升的4微克/mL生物素酰化BMP-2溶液(明尼苏达州明尼阿波利斯的安迪生物科技有限公司(R&D Systems，Minneapolis，MN)，产品号355-BM/CF)，并在室温下放置30分钟。向所有其他孔引入100微升PBS。使用洗板机再次将这些板用TBST洗涤3次。然后用250微升含3％脱水牛奶的TBST悬浮液封闭这些板，并在室温下放置最少1小时。使用由噬菌体滴定所确定的噬菌体浓度，在单独的96孔板中进行噬菌体原液的稀释，得到如下噬菌体浓度：1010、109、108、107、106和105个噬菌体/孔。封闭后，用TBST洗涤ELISA板3次，将100微升的各噬菌体稀释液引入到相应的ELISA板，并在室温下放置最少1小时。使用洗板机再次用TBST洗涤ELISA板3次，将100微升的HRP缀合的抗M13噬菌体单克隆抗体(1∶5000稀释，PBS溶液)引入到各个孔。将这些板在室温下放置1小时，然后用TBST洗涤3次。接下来，将POD HRP底物引入到各个孔。使用增益设置为150的发光计读取发光值。
图3、图4和图5中的噬菌体ELISA数据显示了相对发光值并且其N值为2。图3中的数据证实了分离的噬菌体对BMP-2的结合。图4和图5中的数据表明噬菌体分别与hIgG和HSA的交叉反应性极低，SEQ ID NO：4例外，其同时结合hIgG和HSA。
实例4-放大发光接近均匀测定法(amplified luminescent proximity  homogenous assay，ALPHA)
使用ALPHA测定来评估BMP-2对亲和肽的浓度依赖性结合效率。
在2x测定缓冲液(PBS、0.01％吐温80、0.05％BSA)中制备3.3微克/mL的生物素酰化BMP-2(明尼苏达州明尼阿波利斯的安迪生物科技有限公司(R&D Systems，Minneapolis，MN)，产品号355-BM/CF)的稀释原液。具有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：6的化学合成肽采用标准的自动化芴基甲氧基羰基(Fmoc)固相肽合成程序制备。每种用于测定的肽溶液从100微克/mL原液制备。将原液在测定缓冲液中以1/2对数步长进行系列稀释，得到如下肽浓度：100、33.3、11.1、3.70、1.23、0.41、0.14、0.046、0.015、0.0051、0.0017和0.00056微克/mL。随后，将系列稀释的肽添加到含有10微升的3.3微克/mL生物素酰化BMP-2溶液的相应孔。生物素酰化BMP-2的最终测定试验浓度为0.825微克/mL。最终肽浓度为25、8.3、2.8、0.93、0.31、0.10、0.03、0.01、0.003、0.001、0.0003和0.0001微克/mL。接着，将镍(Ni)受体和链霉抗生物素蛋白(SA)供体珠粒(马萨诸塞州沃尔瑟姆的珀金埃尔默股份有限公司(Perkin Elmer，Waltham，MA)，产品号6760619M)在测定缓冲液中进行1∶100稀释，然后向每个测试孔添加20微升。对照物仅包含三种不同浓度的BMP-2以及无肽的SA珠粒。用铝密封件使该板不漏光，并且于室温下在台式摇动器上摇动45分钟。用双波长荧光计(珀金埃尔默股份有限公司(马萨诸塞州沃尔瑟姆)，Envision 2101多标记读板仪)(Perkin Elmer(Waltham，MA)Envision 2101Multilabel Reader)读取板的发射。
图6中的ALPHA数据归一化为基于肽序列分子量的摩尔浓度。图6中的数据示出了肽对BMP-2的浓度依赖性结合。根据肽序列对BMP-2的浓度依赖性结合，将肽序列排列如下：SEQ ID NO：6＞SEQ ID NO：3＞SEQ IDNO：2＞SEQ ID NO：1。
实例5-表面等离子体共振(SPR)
通过表面等离子体共振测量，评估SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：6对BMP-2的肽结合亲和力。测量是在采用CM4系列-S传感器芯片的BiacoreS51(新泽西州皮斯卡塔韦的Biacore生命科学公司)(Biacore Life Sciences，Piscataway，NJ)仪器上进行。用1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDC)/N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)耦联化学反应将rhBMP-2(明尼苏达州明尼阿波利斯的安迪生物科技有限公司(R&D Systems，Minneapolis，MN)，产品号355-BM/CF)固定在该传感器芯片上。BMP-2亲和肽以5微摩尔的浓度流过BMP-2功能化芯片，并记录折射率的变化。使用Biacore分析软件(新泽西州皮斯卡塔韦的Biacore生命科学公司)(Biacore Life Sciences，Piscataway，NJ)将数据拟合到1∶1的Langmuir结合模型。
表2所示数据是N值为3的平均平衡解离常数。数据表明平均平衡解离常数在300和400nM之间。
表2.
  KD(M)
  SEQ ID NO：6   3.03×10-7M(±1.77×10-8)
  SEQ ID NO：3   3.98×10-7M(±5.94×10-8)
实例6-碱性磷酸酶生物活性测定
在本实例中，我们用小鼠成骨细胞来确定亲和肽是否会干扰细胞表面受体与BMP-2的结合。在BMP-2存在下在含有或不含亲和肽的情况下监测碱性磷酸酶(ALP)产量。
在二次传代MCHT-1/26细胞(小鼠成骨细胞系)达到4500个细胞/孔的前一天晚上，将其接种到96孔板中。在存在或不存在肽SEQ ID NO：6的16、160和800nM这3种稀释液的情况下，用0-1000ng/mL范围内的BMP-2系列稀释液刺激细胞。在37℃下温育3天后，用裂解缓冲液(250mMNaCl，25mM MgCl2和100mM Tris，pH＝8.0)在37℃下过夜裂解细胞。将三分之一的裂解物用于使用磷酸对硝基苯酯进行的碱性磷酸酶测定。该反应在37℃下进行一至两小时。然后，在吸光度读板仪上在405nm波长下读取该板。
图7示出SEQ ID NO：6对小鼠成骨细胞的ALP产量影响很小。这表明SEQ ID NO：6不会干扰BMP-2的生物活性。
实例7-泡沫胶原生物基质的制备
将80％I型纤维胶原(32mg)和20％可溶性I型胶原(8mg)的40mg/mL水溶液在4℃下搅拌过夜。随后将此悬浮液在掺合机中匀化3个循环(30秒至1分钟/循环)。转移大约5mL至尺寸为5cm×5cm、高度为0.5cm的模具。用直边刮刀将胶原混合物整平以确保胶原的均匀高度分布。接着，用表3所示循环方案对样品进行脱气，然后冻干(纽约州加德纳的Virtis公司)(Virtis，Gardiner，NY)。随后用温控真空室对样品进行热脱水。接着用活检穿孔器将泡沫胶原生物基质切成6mm的盘，并于室温在干燥的氮气吹扫下储存备用。
表3
  温度(℃)   时间(分钟)   压力(毫托)
  -40   60   500
  -25   300   100
  -20   600   50
  -10   300   50
  -5   180   50
  0   120   50
  10   120   50
  20   120   50
实例8-通过BMP-2亲和肽与泡沫胶原生物基质的缀合制备亲和生物基 质
为了进行肽缀合，将6mm胶原泡沫盘(按实例7所述制备)放置于Eppendorf管中的1.8mL 40％EtOH/50mM 2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES，pH5.5)，并且在室温下翻转30分钟。将该盘从上述缓冲液取出，放置于含0.5mM SEQ ID NO：23BMP-2亲和肽(图8A所示SEQ ID NO：6的缀合肽)的1.8mL 40％EtOH/50mM MES(pH 5.5)中。用标准的自动化芴基甲氧基羰基(Fmoc)固相肽合成程序制备肽。让该盘在室温下翻转1小时。然后，将10微升的0.5M EDC原液和10微升的0.1M磺基-NHS原液(均在40％EtOH/50mM MES(pH 5.5)中)引入到Eppendorf管中，得到最终浓度为：2.5mM EDC和0.5mM磺基-NHS(肽、磺基-NHS和EDC的摩尔当量分别为1∶1∶5)。让该盘在室温下翻转4小时。接着，通过在10mL的1XPBS中翻转来清洗该盘30分钟。此清洗共重复三个清洗循环。最后，将盘从PBS取出，让其在冷冻干燥机中于真空下过夜干燥。三个对照样品也用于以上程序。1＝胶原海绵+缓冲液，2＝胶原海绵+肽/缓冲液，3＝胶原海绵+EDC/NHS/缓冲液。
使用SEM分析肽缀合的胶原泡沫(亲和生物基质)的微结构。代表性图象显示于图8B中。该图像表明肽缀合的胶原泡沫保留了其多孔的微结构。对于所有样品，将上清液冻干为干粉并用RP-分析HPLC进行分析。数据表明大约40％的BMP-2亲和肽(SEQ ID NO：23)共价缀合至6mm胶原盘。
实例9-BMP-2保持测试
将冻干的rhBMP-2溶解于8.4mL无菌水，得到1.5mg/mL的rhBMP-2悬浮液。对于加载研究，将6mm直径的亲和生物基质(如实例7和实例8所制备)放置在0.2微米过滤Eppendorf管中，并加载100微升的0.4mg/mLrhBMP-2溶液(250mM精氨酸、10mM组氨酸、20mM CaCl2(pH 6.5)缓冲液)，并让其在室温下放置45分钟。随后将过滤Eppendorf管中的亲和生物基质在3000rpm下旋转5分钟以移除上清液。按照产品说明书中的程序，使用所得上清液的1∶100000稀释液进行rhBMP-2免疫测定ELISA(安迪生物科技有限公司(明尼苏达州明尼阿波利斯)(R&D Systems(Minneapolis，MN)DBP200)。通过从BMP-2初始加载浓度减去上清液中rhBMP-2量来确定rhBMP-2掺入百分数。作为对照，采用了不含亲和肽的EDC/NHS交联胶原的6mm直径的盘。
图9中的数据表明亲和生物基质加载大约90重量％的总BMP-2(40微克)，而相比之下交联胶原盘加载大约40重量％。
实例10-来自胶原盘的体外BMP-2释放
在本实验中，我们评估了在模拟的生理条件下BMP-2从亲和生物基质的体外控制释放。对于释放研究，将按照实例7和实例8中所述方法制备的6mm直径亲和生物基质盘放置在24孔细胞培养板的孔中。海绵加载了40微升的1.5mg/mL rhBMP-2溶液，让其在室温下放置15分钟。将实例8中制备的不含亲和肽的EDC/NHS交联胶原的6mm直径盘用作对照。随后将已加载的胶原海绵转移至24孔细胞培养板的孔中，该培养板中包含补充有浓度为1mg/mL的人血清白蛋白(HSA)的1.5mL PBS。在各个时间点，将培养基移除并转移至Eppendorf管，随后在-20℃下冷冻。向装有胶原盘的孔补充1.5mL新的0.1％HSA/PBS溶液。按照产品说明书中的程序，使用释放培养基的1∶1000稀释液在每个时间点进行rhBMP-2免疫测定ELISA(安迪生物科技有限公司(明尼苏达州明尼阿波利斯)(R&D Systems(Minneapolis，MN))DBP200)。使用标准曲线确定从相应盘释放的rhBMP-2量。
图10中的数据表明亲和生物基质控释装置在36天的时间点累积释放大约25重量％的rhBMP-2，而EDC/NHS交联胶原海绵释放大约90重量％。相比于EDC/NHS交联胶原海绵，rhBMP-2从亲和生物基质控释装置的初始突释显著减少。
实例11-突变型噬菌体ELISA
分别对亲和肽SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：6进行定点诱变，以了解对于结合到BMP-2而言重要的氨基酸。SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：6的突变体通过进行丝氨酸扫描来构建，在该扫描中野生型的残基为丝氨酸所取代。图12示出了进行测试的突变体序列，该测试旨在鉴定更具体的负责对BMP-2的特异性亲和力的氨基酸序列。SEQ ID NO：24至SEQ ID NO：28是SEQ ID NO：3的突变体。SEQ ID NO：29至SEQ ID NO：32是SEQ ID NO：6的突变体。
相应的定制寡核苷酸得自集成DNA技术公司(Integrated DNATechnologies)。使用标准方案将寡核苷酸插入pIX基因中。首先，使用T4多核苷酸激酶将寡核苷酸磷酸化。接着，使磷酸化的寡核苷酸与ssDNA模板退火。采用Kunkel法，用T4DNA连接酶和T7DNA聚合酶连接退火的DNA。用异丙醇沉淀法分离所得DNA，然后跑凝胶电泳以确认反应。最后，用纯化的DNA转化电感受态大肠杆菌细胞，并将细胞接种至2xYT/Tet/Xgal琼脂板上，让其过夜生长以分离出单菌落。将转化细胞等分试样在50mL的2xYT/tet培养基中于37℃下振荡过夜生长。随后按照实例1中的程序对噬菌体进行PEG沉淀。进行噬菌体滴定以确定如实例2中所述ELISA测定的噬菌体浓度。按照实例3中的程序进行ELISA测定。
突变型噬菌体ELISA测定数据(图11A和图11B)示出了SEQ ID NO：3的片段和SEQ ID NO：6的片段结合到BMP-2的证据。更具体地讲，SEQID NO：3的片段SEQ ID NO：33，以及SEQ ID NO：6的片段SEQ ID NO：34对于结合到BMP-2是重要的，并示出于图12中。
实例12-BMP-2从胶原盘的体外释放
在本实验中，我们评估了在如实例10所述的模拟生理条件下BMP-2从亲和生物基质的体外控释，然而我们使用了补充有热灭活胎牛血清(FBS)的PBS而不是单独PBS。对于释放研究，将按照实例7和实例8中所述方法制备的6mm直径亲和生物基质盘放置在24孔细胞培养板的孔中。海绵加载了40微升的1.5mg/mL rhBMP-2溶液，让其在室温下放置15分钟。使用市售胶原盘作为对照。随后将已加载的胶原海绵转移至24孔细胞培养板的孔中，该培养板中包含1.5mL补充有热灭活胎牛血清(FBS)的PBS。在各个的时间点，将培养基移除并转移至Eppendorf管，随后在-20℃下冷冻。向装有胶原盘的孔补充1.5mL新的2％FBS/PBS溶液。按照产品说明书中的步骤，使用释放培养基的1∶1000稀释液在每个时间点进行rhBMP-2免疫测定ELISA(安迪生物科技有限公司(明尼苏达州明尼阿波利斯)(R&D Systems(Minneapolis，MN)DBP200)。使用标准曲线确定从相应盘释放的rhBMP-2量。
图13中的数据表明亲和生物基质控释装置在15天的时间点累积释放大约15重量％的rhBMP-2，而市售胶原海绵释放大约95重量％。相比于市售胶原海绵，rhBMP-2从亲和生物基质控释装置的初始突释显著减少。
实例13-BMP-2从胶原盘的体内释放
使用笼状植入测试系统评估BMP-2从亲和生物基质的体内释放。使用笼状植入系统研究生物活性剂在体内环境中的控制释放的一个例子在PaulaS.Leppert和Joseph A.Fix，用于研究材料从长期植入物的缓慢释放的皮下组织笼(Subcutaneous Tissue Cages for Examination of Slow Release ofMaterials from Long Term Implants)，《生物材料》(Biomaterials)，第11卷，1990年，第46-49页)中有描述。这些方法适于测量BMP-2从亲和生物基质的体内释放。
此体内研究遵从所有适用的规管实验动物的护理和使用的法规。本研究的动物福利符合美国农业部(USDA)动物福利法(CFR第9卷，第1、2和3部分)。并且遵循Guide for the Care and Use of Laboratory Animals(Instituteof Laboratory Animal Resources，National Academy Press，Washington，D.C.，1996)(《实验动物护理和使用指南》，实验动物资源研究所，美国国家科学院出版社，华盛顿，1996年)。此体内研究采用七至八周龄的雄性大鼠，具体地讲是以商品名SPRAGUE DAWLEY(印地安那州印第安纳波利斯的哈兰实验室公司)(Harlan Laboratories，Inc.，Indianapolis，IN)Crl:CD种群出售的远系繁殖多用途品种的大白鼠。将动物分别关养在具有直接接触垫草的polybox中。每天提供大约12小时的荧光照明。每日监测和记录温度和湿度，并且尽最大可能分别保持在64℃至79℃之间和30％至70％之间。大鼠的基础饮食为随意供应的经认证的啮齿动物饮食。通过自动供水系统随意供应自来水。本研究设计的简要说明可见于表4中。
表4
  组别   大鼠数量   生物基质   剂量和说明
  1   5   胶原盘   +PBS
  2   5   胶原盘   +BMP-2
  3   5   SEQ ID NO：23改性的胶原盘   +BMP-2
用316号46目(0.0055英寸网丝直径)不锈钢(新泽西州克利夫顿的纽瓦克丝布公司)(Newark Wire Cloth Company，Clifton，New Jersey)手工制作笼状植入物(长度＝25毫米，直径＝10毫米)。用0.1M氢氧化钠将笼状植入物去热源并用水彻底洗涤。通过使用预钻孔的聚四氟乙烯(PTFE)块在室端周围浇注硅酮弹性体(MED6215，新泽西州汤姆斯河的NuSil科技有限公司(NuSil Technology，LLC，Toms River，NJ))盖来封闭笼式植入物的一端。用定制模制的硅酮弹性体塞子(Wacker LR3003/40，马萨诸塞州莱明斯特的Albright科技有限公司)(Wacker LR3003/40，Albright Technologies Inc.，Leominster，MA)盖在添加相应的生物基质之后封闭笼子的开口端。在笼子中加载盘之前，对盖和笼子进行高压灭菌。
按照实例7中的程序在无菌条件下制备胶原盘。然后，用电子束辐射(25kGy)对6mm直径胶原盘进行灭菌。使用实例8所述方法在无菌条件下制备亲和生物基质。接着采用表3所示冻干方法在无菌室中将样品冻干。将不含亲和肽的市售胶原的6mm直径盘用作对照。
在植入前，将干燥的生物基质置于室中，并用非吸收性缝合线缝合到位。然后在盘中加载100微升的剂量为30微克/盘的BMP-2无菌溶液。在每只大鼠中采用吸入麻醉(异氟醚)来诱导麻醉。将眼用软膏施用到眼睛以防止麻醉期间该组织干燥。每只动物均施用盐酸丁丙诺啡(0.05mg/kg，安全浓度)来镇痛，施用乳酸林格氏液(LRS，1-5mL)来维持体液平衡。在诱导麻醉后，通过使用配备有真空系统的电动动物剪将动物从颈背部区域到腰背部区域的外科手术部位的毛发剪光。用二醋酸氯己定擦洗该手术部位的周围区域，用醇冲洗，干燥，并涂抹1％有效碘的碘伏水溶液。将麻醉动物送至手术台，在该手术台使用无菌技术向准备好的区域布放无菌手术单。手术过程中，在抽空系统下通过掩膜用异氟醚维持动物。
将无菌的含BMP-2加载盘的笼状植入物植入到每只大鼠的皮下空间。在左胸背制作皮肤切口。在大鼠的背部上通过钝性解剖产生皮下囊袋，其大小刚好足以容纳伤口腔室。将笼状植入物放置在皮下囊袋中，最大限度地减少空闲皮下空间。插入笼状植入物，使最靠近硅酮端盖并最远离硅酮塞子的包含样品的末端最接近切口部位。笼子的近端插入离切口线最少相距1cm的位置以避免发炎。用非吸收性缝合线将笼状植入物缝合到下层肌肉，并使用非吸收性缝合线封闭切口。
植入后，在第1、3、5和7天收集伤口渗出物。在收集流体之前，用二氧化碳/氧气和异氟醚使动物轻度麻醉。简单地说，将21G针插入到离切口部位最远的硅酮塞子的中部。使大鼠保持在直立位置以让流体流入注射器。缓慢地抽动注射器直至达到300微升的收集体积。样品于-80摄氏度下冷冻，直到使用rhBMP-2免疫测定ELISA进行分析。完成本研究后，通过将动物放置在预填充二氧化碳的腔室中并使它们吸入100％二氧化碳，对其实施安乐死。通过对呼吸的望诊和心脏触诊来确认安乐死。
图13中的数据表明亲和生物基质控释装置在七天的时间里持续释放BMP-2。在第5天和第7天，从亲和生物基质盘释放的BMP-2相比于对照胶原盘有统计学上的显著性差异。

Claims (10)

1. 一种BMP-2亲和肽，选自SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10 SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 22以及它们的片段。
2. 一种亲和生物基质，包含可生物降解的生物相容性聚合物和至少一种BMP-2亲和肽。
3. 根据权利要求2所述的亲和生物基质，其中所述亲和肽选自SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 21和SEQ ID NO: 22。
4. 根据权利要求2所述的亲和生物基质，其中所述可生物降解的生物相容性聚合物为天然聚合物。
5. 根据权利要求4所述的亲和生物基质，其中所述天然聚合物选自胶原、弹性蛋白、角蛋白、丝、多糖、GAG以及它们的组合。
6. 根据权利要求5所述的亲和生物基质，其中所述天然聚合物为胶原。
7. 根据权利要求6所述的亲和生物基质，其中所述天然聚合物为选自以下组织的脱细胞组织：皮肤、骨膜、软骨膜、滑膜、筋膜、肠系膜、骨骼和腱。
8. 一种控释装置，包含亲和生物基质和BMP-2。
9. 根据权利要求8所述的控释装置，其中所述装置为选自海绵、颗粒、注射用凝胶、注射用液体、膜、薄膜、纤维和基于纤维的支架的形式。
10. 一种试剂盒，包含亲和生物基质和BMP-2。
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