CN102847175B - 一种抑制细菌信号转导系统PhoQ组氨酸激酶活性的制剂 - Google Patents

Abstract

本发明属生物技术领域，涉及一种抑制细菌信号转导系统PhoQ组氨酸激酶活性的制剂，具体涉及一种含有小分子化合物的细菌PhoQ组氨酸激酶抑制剂，尤其是对革兰阴性菌的信号转导系统PhoQ蛋白的抑制剂。所述的制剂由式(I)结构的小分子化合物和DMSO组成。本发明的抑制细菌信号转导系统PhoQ组氨酸激酶活性的制剂，对志贺菌信号转导系统中PhoQ蛋白具有抑制作用，抑制志贺菌的毒力，可用于制备抑制志贺菌毒力的药物，或可用于制备治疗由革兰阴性菌引起的疾病的药物，还可配制成医疗器械或医疗器具消毒液。

Description

一种抑制细菌信号转导系统PhoQ组氨酸激酶活性的制剂

技术领域

本发明属生物技术领域，涉及一种抑制细菌信号转导系统PhoQ组氨酸激酶活性的制剂，具体涉及一种含有小分子化合物的细菌PhoQ组氨酸激酶抑制剂，尤其是对革兰阴性菌的信号转导系统PhoQ蛋白的抑制剂；所述的制剂对志贺菌信号转导系统中PhoQ蛋白具有抑制作用，能抑制革兰阴性菌生长，并抑制志贺菌的毒力。

背景技术

现有技术公开了志贺菌(Shigella)为革兰阴性菌，是细菌性痢疾的病原体，主要通过粪-口途径传播，侵入结肠粘膜。有统计表明，在我国，细菌性痢疾是发病率仅次于病毒性肝炎和肺结核的第三大传染病，血清型以福氏2a型为主。近年来，由于抗生素的不规范使用以及耐药基因的水平传播，志贺菌在临床上呈现多重耐药，对青霉素类、磺胺类、四环素类抗生素耐药率极高，甚至对喹诺酮类、头孢菌素类等目前临床常用药物的耐药率也不断上升，因此需要研究新的治疗策略加以应对。

当前，抑制细菌毒力而不影响细菌的生长可能成为研究抑制剂的新策略；相比现有的以抑制或杀灭细菌为目的抗生素，抑制细菌毒力而不影响细菌生长可能使细菌处于低选择压力下而减少细菌变异的机会并降低细菌产生耐药性的机率；同时，宿主与无毒或减毒的细菌相互作用，能够产生足够的免疫力对抗病原菌并彻底根除入侵的病原菌。因此，以细菌毒力因子为靶标已经成为发展新型抗菌药物的新策略。

发明内容

本发明的目的是提供一种抑制细菌信号转导系统PhoQ组氨酸激酶活性的制剂，尤其是对革兰阴性菌的信号转导系统PhoQ蛋白的抑制。

本发明对志贺菌双组分信号转导系统中的PhoQ蛋白(PhoQ组氨酸蛋白激酶)进行蛋白质结构三维模拟，并根据此模型，利用对接软件进行虚拟，获得能抑制志贺菌等革兰阴性细菌毒力的小分子化合物；然后，将所述的小分子化合物与二甲基亚砜(DMSO)混合，制成抑制细菌信号转导系统PhoQ组氨酸激酶活性的制剂。

具体而言，本发明所述的抑制细菌信号转导系统PhoQ组氨酸激酶活性的制剂，其特征在于，由式(I)结构的小分子化合物(FDDDC1)和0.1-2％二甲基亚砜(DMSO)组成；

本发明中，所述的细菌为革兰阴性菌，包括志贺菌、沙门菌或大肠杆菌。

本发明中，所述的小分子化合物FDDDC1具有抑制细菌毒力的功能，能有效抑制临床常见的革兰阴性菌，如志贺菌、沙门菌或大肠杆菌的毒力，且对哺乳动物细胞无明显毒性；

本发明中，所述小分子化合物FDDDC1可通过市购(荷兰SPECS公司)获得。

本发明中，所述二甲基亚砜(DMSO)其分子式为(CH3)2SO，常温下为无色无臭的透明液体，具有高极性、高沸点、热稳定性好、非质子、与水混溶的特性，能溶于乙醇、丙醇、苯和氯仿等大多数有机物，可通过市购途径获得。

本发明通过蛋白结构分子模建和虚拟高通量筛选技术从已知结构的化合物库中筛选出针对志贺菌组氨酸蛋白激酶PhoQ蛋白潜在的小分子抑制物(FDDDC1化合物)，经体外及体内生物学实验证实，该小分子化合物FDDDC1能有效抑制志贺菌及几种临床常见的革兰氏阴性菌的毒力，且对哺乳动物细胞没有毒性。

本发明中，所述的小分子化合物FDDDC1具有如下优点：

(1)所述的小分子化合物在体外及体内能明显抑制志贺菌的毒力；

(2)所述的小分子化合物不影响细菌的生长；

(3)所述的小分子化合物对哺乳动物细胞无毒性，且对人红细胞无明显的溶血作用；

(4)所述的小分子化合物与目的蛋白志贺菌组氨酸激酶PhoQ保守功能域片段有很强的结合力，且均能明显抑制蛋白组氨酸激酶PhoQ的自身磷酸化活性。

本发明中，所述的小分子化合物FDDDC1与0.1-2％二甲基亚砜(DMSO)制成细菌PhoQ组氨酸激酶抑制剂，对志贺菌信号转导系统中PhoQ蛋白具有抑制作用，能抑制革兰阴性菌生长，并抑制志贺菌的毒力。

本发明中，所述的小分子化合物FDDDC1可用于配制成医疗器械或医疗器具消毒液，还可进一步进行化学结构的改造，制备抗革兰阴性球菌感染的新药物。

本发明的细菌PhoQ组氨酸激酶抑制剂，对志贺菌信号转导系统中PhoQ蛋白具有抑制作用，抑制志贺菌的毒力，可配制成医疗器械或医疗器具消毒液；所述的抑制剂还可用于制备抑制志贺菌毒力的药物，或可用于制备治疗由革兰阴性菌引起的疾病的药物。

附图说明

图1显示了本发明中化合物FDDDC1对志贺菌侵袭HeLa细胞的影响，其中，Sf9380为阳性对照，ATCC 25922为阴性对照，DMSO为化合物溶剂对照。

具体实施方式

下面结合实验例对本发明进一步详细描述但不限制本发明。

本发明试验所涉及的大肠杆菌JM109和pQE30载体均为本领域技术人员所熟知的现有公开技术，或可通过市购渠道获得。

实施例1构建志贺菌组氨酸激酶PhoQ原核表达质粒

通过如下方法获取志贺菌组氨酸激酶PhoQ基因(NC_004337)：

在正义链引物5’端设计BamH I酶切位点，反义链引物5’端设计HindIII酶切位点：sense：5’-CGCGGATCCGTACGAAACCTGAACCGATT-3’，下划线部分为BamH I酶切位点；antisense：5’-CCCAAGCTTTTATTCATCTTTCGGCGCAG-3’，下划线部分为HindIII酶切位点。

用上述引物经PCR扩增出志贺菌组氨酸激酶PhoQ的编码基因。通过限制性内切酶(BamH I和HindIII)的酶切反应和T₄DNA连接酶的连接反应，将上述基因连入pQE30载体，转化JM109细菌，挑选阳性菌落，测序证实克隆构建成功。

实施例2志贺菌组氨酸激酶PhoQ蛋白的表达和纯化

宿主菌：大肠杆菌JM109

1.挑单克隆菌落接种至5ml LB培养基中，37℃×250rpm至OD₆₀₀＝0.6。

2.加1M IPTG至终浓度0.8mmol/L，在30℃下诱导6h后。

3.离心取菌体，用PBS重悬后超声破碎，于4℃以12000转/分离心5分钟，取上清液。

用Invitrogen公司ProBond^TM Purification System提纯蛋白。以12％SDS-PAGE蛋白电泳分析确定目的蛋白的分布。用Bradford法对蛋白质进行定量。

实施例3化合物FDDDC1对志贺菌组氨酸激酶PhoQ酶活性的影响：

采用下述两种方法进行检测，

1.检测底物ATP的减少量——Kinase-Glo^TM Luminescent Kinase Assay Kit(美国Promega公司)：

将重组表达、纯化的2μg志贺菌组氨酸激酶PhoQ分别与梯度稀释的化合物在25℃作用20分钟，然后加入100μM ATP(反应总体积50μL)，在25℃作用20分钟后，将反应混合物加入96孔酶标板，每孔50μL，加入Kinase-Glo^TMReagent每孔50μL室温静置10分钟，读取化学发光值表示反应剩余的ATP的量，实验设不加化合物组为对照组。最后计算化合物对目的蛋白活性的抑制率：

2.检测产物焦磷酸的生成量——Pyrophosphate Reagent(美国Sigma-A1drich公司)：

将重组表达、纯化的2μg志贺菌组氨酸激酶PhoQ分别与梯度稀释的小分子化合物混合，加入96孔酶标板，然后加入100μL Pyrophosphate Reagent，用水补足总体积200μL，在37℃作用30分钟，连续读取OD₃₄₀，实验设不加化合物组为对照组。最后计算化合物对目的蛋白活性的抑制率。

采用Logit法对上述两种方法检测的抑制率分别计算半数抑制浓度IC₅₀。结果表明：化合物能较强地抑制志贺菌组氨酸激酶PhoQ的活性，表1为IC₅₀结果。

表1

注：IC₅₀值即半数抑制浓度，代表化合物抑制反应体系中组氨酸激酶PhoQ酶半数催化活性时的浓度。

实施例4表面等离子共振(SPR)技术检测化合物FDDDC1与志贺菌组氨酸激酶PhoQ的亲合力

将重组表达、纯化的志贺菌组氨酸激酶PhoQ酶偶联在能量共振生物传感芯片(Biacore CM5型芯片)上，将化合物按两倍梯度稀释，通过Biacore仪器观察化合物与蛋白结合的情况，计算出解离衡常数K_D。

结果显示化合物FDDDC1与志贺菌组氨酸激酶PhoQ有较强的结合能力。表2为化合物FDDDC1与志贺菌组氨酸激酶PhoQ的亲合力。

表2

注：K_D值为解离常数，代表化合物FDDDC1与志贺菌组氨酸激酶PhoQ的结合力，其值越小表示结合力越强。

实施例5化合物FDDDC1对细菌生长的抑制实验

本实施例使用美国Clinical and Laboratory Standards Institute(CLSI)推荐的标准试管稀释法：

1.将细菌接种于新鲜的MH液体培养基，37℃培养过夜。

2.将菌液用新鲜的MH液体培养基将菌液浓度校正至0.5麦氏比浊标准，再用MH液体培养基按1∶200稀释，向每只试管中加入1mL，加入1mL不同浓度梯度的化合物(溶剂DMSO终浓度保持0.1％)，37℃培养18小时。因化合物FDDDC1溶解于DMSO中，以0.1％DMSO+细菌作为对照，以无菌培养基为空白对照。

3.取出与空白对照比较，细菌不生长的浓度最低的一管即为化合物FDDDC1的最小抑菌浓度。

结果显示化合物FDDDC1对志贺菌生长没有明显的抑制作用。

实施例6MTT法检测化合物FDDDC1的细胞毒性

1.将新鲜培养的Vero细胞接种于96孔板，每孔100μL细胞(约5×10⁴细胞)，37℃，5％CO₂条件下培养24小时，使细胞长成单层。

2.弃去培养基，加入100μL/每孔新鲜的MEM培养基，其中含有不同浓度的化合物FDDDC1(溶剂DMSO终浓度保持0.1％)，每个样品采用6复孔上样，37℃，5％CO₂条件下继续培养24小时。因化合物溶解于DMSO中，因此设0.1％DMSO+细胞为对照。

3.每孔加入10μL MTT标记物，37℃、5％CO₂条件下培养4小时。

4.每孔加入100μL溶解液，37℃、5％CO₂条件下培养过夜。

5.将96孔板取出读取OD₅₇₀值，每个样品读数取6复孔的均值，计算不同浓度的化合物对Vero细胞生长的抑制率：

半数抑制量CC₅₀值采用Logit法计算。

结果表明，未观察到对Vero细胞具有毒性。

表3是化合物FDDDC1对Vero细胞的毒性作用。

表3

实施例6红细胞溶血实验：

1.将分离的健康人红细胞用无菌生理盐水洗3遍，并稀释至5％。

2.加入不同浓度的小分子化合物FDDDC1(溶剂DMSO终浓度保持0.1％)于5％红细胞悬液中，每孔200μl接种于96孔板上，每个样品采用三复孔。因所述小分子化合物溶解于DMSO中，因此设0.1％DMSO+细胞为阴性对照，设1％细胞穿透液Triton-100+细胞为阳性对照，并设两种常用抗生素四环素和环丙沙星作对照。37℃培养箱培养1小时，离心后取100μl上清移入另一块干净的96孔板，OD₅₇₀读数，每个样品读数取三复孔的均值。

结果表明：该小分子化合物对人红细胞均没有溶血作用。

表4是化合物FDDDC1对血红细胞的毒性作用。

表4

实施例7HeLa细胞侵袭实验

1.HeLa细胞于12孔板中长至半融合性单层后，以对数生长期的志贺菌进行感染(M.O.I.＝100)，900g×5min在37℃离心，然后于37℃培养60min。

2.PBS洗板三次后，加入庆大霉素使其终浓度为200μg/ml，再于37℃培养30min。

3.每孔加入1ml含0.1％Triton X-100的PBS，室温下10min后，将裂解液进行适当稀释后涂布于LB琼脂平板上，37℃培养过夜后进行菌落计数，计算出侵袭入细胞的细菌总数；

每个实验为三复孔，结果以存活细菌所占的百分比来表示。

结果如图1显示：志贺菌与化合物FDDDC1作用后，对HeLa细胞的侵袭率有显著下降(p＜0.01)；所述的FDDDC1的最小有效浓度为12.5μmol/L。

实施例8志贺菌感染小鼠角结膜

将志贺菌接种于TSB-刚果红平板，挑取红色(有毒力者)单克隆接种于LB肉汤中。将Sf9380与一系列倍比稀释的化合物[终浓度(μmol/L)为100、50、25、12.5]在37℃振荡培养8h后，将细菌浓度调整至5×10¹⁰/mL，选25g左右健康BALB/c小鼠，吸取上述浓度的细菌悬液滴入小鼠眼睛，细菌数约为5×10⁸/眼，轻轻按摩小鼠眼周围，使菌液均匀分布。每份样品接种于6只独立的小鼠眼睛，24h后观察小鼠角结膜发病情况。以接种经等量DMSO处理的Sf9380者为空白对照组，接种未经化合物处理的Sf9380者为阳性对照组，接种大肠埃希菌ATCC 25922者为阴性对照组。

结果表明：化合物FDDDC1能够明显抑制志贺菌所引起的小鼠角结膜炎症反应，降低24h和48h时的急性角结膜炎症程度，并加快炎症恢复速度，72h后炎症明显减弱；化合物FDDDC1的最小有效浓度为12.5μmol/L。对照组中，接种经等量DMSO处理的志贺菌菌液的小鼠表现为严重的角结膜炎症反应，炎症发展过程与Sf9380相似(P＞0.05)；接种大肠杆菌ATCC 25922或NS的小鼠则无角结膜炎症反应。

表5为化合物FDDDC1对小鼠角结膜炎的影响

注：志贺菌侵袭力强弱的评判标准：-：无角膜结膜炎或轻微刺激；+：轻微结膜炎或者延迟发病或者症状快速消退；++：角结膜炎，无脓性分泌物；+++：严重角结膜炎，有脓性分泌物。阳性对照组及空白对照组显示其毒力为+++，阴性对照组则为-。

注：Sf9380为阳性对照，ATCC 25922为阴性对照，DMSO为化合物溶剂对照。

Claims (5)

1.式（Ⅰ）结构的小分子化合物在制备抑制细菌信号转导系统PhoQ组氨酸激酶活性的制剂中的用途，所述制剂由式（1）化合物和0.1-2%二甲基亚砜组成；

所述的抑制细菌信号转导系统PhoQ组氨酸激酶活性的制剂用于抑制革兰阴性细菌的毒力。

2.按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的细菌为志贺菌、沙门菌或大肠杆菌。

3.按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的制剂为消毒液。

4.按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的制剂用于制备抑制志贺菌毒力的药物。

5.按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的制剂用于制备治疗由革兰阴性菌引起的疾病的药物。