CN102844330B - 针对hiv p17蛋白、能够中和p17与p17受体（p17r）结合的单克隆抗体 - Google Patents
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Abstract
本发明描述了一种抗HIV p17的单克隆抗体，其能够中和多个HIV-1P17蛋白突变体和p17R受体之间的结合。此外，描述了本发明的单克隆抗体可以作为针对HIV及其相关病症如AIDS、痴呆、淋巴瘤的药物使用。
Description
技术领域
本发明涉及一种针对HIV p17蛋白的单克隆抗体，所述抗体能够中和p17蛋白和在免疫活性细胞表面表达的p17蛋白受体（p17R）之间的结合。
背景技术
已知p17蛋白在AIDS的发病机理方面起重要作用。
也已知p17代表针对HIV-1的中和抗体的靶标，且高水平的抗p17抗体与较慢的AIDS病情发展是相关的。除了在病毒复制中的支持作用之外，p17还表现出若干免疫调节特性，这些特性在病毒发病情况下有重要意义。p17确实被证明可以增加HIV-1的体外复制，并影响除组成病毒的靶细胞如CD4+T淋巴细胞、NK细胞、单核细胞、浆样树突状细胞的增殖能力外，还影响其活化和分化状态。p17干扰免疫系统各种细胞的生理功能及其增加促炎症分子产生的能力，很可能是病毒引起的用以逃避免疫反应，同时创造一个更适合病毒感染和复制的场所的一种机制。近来，也观察到p17被输出到被感染细胞的外部，且其可以在被感染HIV-1病人的血清中检测到，其残留在淋巴结中，也可以在用抗逆转录病毒药物成功治疗且因此没有病毒复制的病人中检测到。这些发现导致相信在体外观察到的反应机制也可能同样发生在体内。
此外，在先前的研究中本发明人证实了p17蛋白通过与在若干免疫活性细胞表面表达的特异性受体（p17R）相互作用，而直接发挥其生物活性。本发明人也鉴定出与受体结合有关的p17N末端区域内的表位。该表位的氨基酸序列已被鉴定，并可用于设计长度为20个氨基酸、命名为AT20的合成肽，HIV-1BH10分离物（HIV-1B亚型）的p17的功能区域代表。连接有钥孔戚血蓝素（KLH）蛋白的合成肽AT20导致产生抗p17中和抗体，其能够封闭p17/p17R的相互作用，从而发挥其生物活性。
在后来的研究中，本发明人也已经证实用全长p17 BH10蛋白或合成肽AT20-KLH对动物进行免疫，可引起产生中和血清，其能够抑制下列蛋白结合到p17R，不仅包括p17 BH10蛋白，而且还有一系列这类蛋白的非洲突变体（African variants），分别被鉴定为S75X、S85X、S92X和S012X（Fiorentini等人.,Vaccine 26（2008）4758-4765）。然而，多克隆抗体表现出若干的缺点。首先，不论什么时候需要产生多克隆抗体，都需要诉诸于动物的免疫反应。第二，每次免疫反应中产生的多克隆抗体都必须要描述特征，并被检验其结合和中和的特性及其安全特征。
由于如所附的权利要求中所述的抗p17单克隆抗体，这些缺点现在已经克服，权利要求的内容是本说明书技术教导的一个完整部分。
发明内容
本发明的主题抗p17单克隆抗体，下面被命名为“MBA1抗体”，其表现出意料之外的特性，例如，即使其是单克隆抗体，却具有类似于多克隆抗体的宽范围的中和活性；但另一方面，其不能识别中和的AT20表位，而上述Fiorentini等人2008年的参考文献中描述的中和血清，以及先前被描述的且被命名为MBS3的抗p17中和单克隆(De Francesco等人.ProcNatl Acad Sci U S A.2002 Jul 23;99(15):9972-7;WO2003/016337)却可以识别中和的AT20表位。
下面的实验部分显示了现有技术的MBS3抗体和本发明的MBA1抗体两者之间结合和中和特性的比较。特别是，与现有技术的MBS3抗体相比，本发明的MBA1抗体观察到了更宽范围的中和活性。
归因于HIV-1 p17蛋白多种突变体和p17R受体之间的结合以及结合中和能力，本发明的MBA1单克隆抗体尤其适合用作治疗与人类免疫缺陷病毒相关的病症的药物。该表达“与人类免疫缺陷病毒相关的”意味着该种病症是直接或间接地由所述病毒引起的。优选地，与人类免疫缺陷病毒相关的病症是从由获得性免疫缺陷综合征（AIDS）、痴呆和淋巴瘤组成的组中选择的。
本发明的单克隆抗体可能以任一药学上可接受的方式给药。例如，该抗体可能通过非肠道途径给药，优选静脉注射或缓慢灌注。其他预期的给药方式有，例如，口服、鼻腔途径、眼用途径、直肠途径以及局部途径。因此，本发明的单克隆抗体可以配制成用于所希望的给药途径的任何适合的剂型。除了起活性成分作用的抗体之外，剂型还包括适合于所希望的给药途径的药学上可接受的辅料和/或载体。给药途径、剂型、药学上可接受的辅料和/或载体的选择在本领域技术人员的技能中已很充分。在特别优选的实施例中，本发明的单克隆抗体通过注射方式给药。在这种情况下，该抗体的给药剂量在约0.1mg/kg至约100mg/kg之间的范围内。如果该抗体是通过缓慢灌注方式给药的，可能使用如约30分钟到2小时的灌输周期。对于急性、慢性和间歇性的治疗，优选在一个月、两个月或更高的基准上重复给药。
具体实施方式
下面的实验部分描述了本发明的主题MBA1单克隆抗体的制造程序。进一步，报导了为了检测其结合和中和特性，本发明人所实施的研究。下面的实验部分以说明的方式单独提供，且其并不限制如权利要求所述的本发明的范围。
实验部分
1.免疫反应
第一次注射，用25μg/小鼠用在弗式完全佐剂中乳化的p17BH10蛋白免疫9周的雌性Balb/c小鼠，并用弗式不完全佐剂进行剩下3次的注射。每间隔7天通过腹腔途径进行上述免疫反应。最后一次免疫接种的3天后实施尾内免疫（intra-caudal immunization）。
2.细胞融合和杂交瘤细胞的产生
因此为了继续与骨髓瘤细胞（NSO）融合，利用无菌操作从每只小鼠中除去脾脏以回收其脾细胞，其在遗传上除去了次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）。将这样形成的细胞悬浮混合物与聚乙二醇轻轻地缓慢地混合在一起几分钟，然后将其转移到在96孔板上含有次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷的培养基（HAT培养基）中，在5%CO2及37°C条件下温育。细胞融合的当天视为第0天，大约3天后检测到第一个菌落，第一个杂交瘤细胞菌落大约在细胞融合后的15天出现。为了评定存在抗原特异性抗体的可能性，对上清液做筛选。筛选过程是通过ELISA技术完成的。收集阳性杂交瘤克隆，并将其克隆至合适的96孔板中，用以选择能产生抗体的杂交瘤细胞，并分离出源于单克隆的细胞系，从而获得能够针对p17 BH10蛋白及其非洲突变体（见下文）的MBA1单克隆抗体。
3.p17 BH10蛋白的非洲突变体的产生及特征
用病毒RNA提取试剂盒（Qiagen,Milan,意大利）从乌干达（Uganda）病人的质粒中分离出了HIV-1基因组RNA。然后用MULV逆转录酶（Applera,Monza,意大利）将提取物逆转录，并将所得到的cDNA用作通过Pfu DNA聚合酶完成高保真PCR的模板。用下面的引物扩增包括p17BH10基因的部分HIV-1基因组序列：UGF1（5’-GTG CCC GTC TGT TGTGTGA-3’,SEQ ID NO:1）和UGR1（5’-AAT CTT GTG GGG TGG CTC CTT3’,SEQ ID NO:2）用于第一步，UGF2（5’-ACA GGG ACC TGA AAG CGAAAG-3’,SEQ ID NO:3）和UGR1用于第二步。纯化PCR产物（StrataprepPCR纯化试剂盒;Stratagene,La Jolla,CA,美国），并将其插入到SrfI消化的pPCR-Script Amp SK(+)克隆载体（Stratagene）中。此后，检验核苷酸序列和插入片段的方位（CRIBI BMR,Padua,意大利）。用下面的引物通过PCR进一步扩增先前克隆的p17 BH10片段：UGp17For（5'-TAA GGA TCCATG GGT GCG AGA GCG TCA-3′,SEQ ID NO:4）和UGp17Rev（5'-CGGGAA TTC TCA GTA ATT TTG GCT GAC C-3′,SEQ ID NO:5），其分别包含限制性位点BamHI和EcoRI。将扩增得到的DNA片段以10:1比例（插入片段：载体）连接到原核生物的pGEX-4T表达载体（GE Healthcare,Piscataway,NJ,美国）上16°C持续3个小时。分别被命名为S75X、S85X、S92X和S012X的4个克隆产物，随后被转入到E.coli BL21（DE3）细胞（Stratagene）中。其核苷酸序列得以确认，且产物通过异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷（IPTG）的诱导得以表达，并通过谷胱甘肽-琼脂糖凝胶4B珠（GEHealthcare）纯化。S75X、S85X、S92X、S012X和GST蛋白通过反向高效液相色谱（HPLC）得到进一步纯化（>98%）。这些蛋白制剂中内毒素污染物的存在是通过LAL（鲎变形细胞溶解物）技术（BioWhittaker,Walkersville,ME）测定的。最后，这些蛋白被生物素-AH-N-羟基琥珀酰亚胺（生物素-AH-NHS,BioSPA,Milan,意大利）生物素化，为使其用于细胞荧光中和测试（cytofluorimetric neutralization test）。
4.ELISA
实施ELISA测试以选择分泌能够识别p17BH10蛋白及其非洲突变体（S75X、S85X、S92X和S012X）的抗体的杂交瘤细胞及克隆。96孔板的每个孔在100μl体积PBS，pH 7.2的条件下，用1μg/ml的p17 BH10、S75X、S85X、S92X和S012X在室温下温育过夜。第二天，在洗涤液（PBS/Tween20 0.1%）中洗涤若干次之后，在37°C下用每孔200μl PBS/BSA 3%封闭这些孔1小时，随后用要被检验的细胞上清液37°C温育这些孔1小时。4次洗涤后，加入标记有HRP酶的抗小鼠的山羊二抗（Thermo Scientific,Waltham,MA），其允许通过作用于OPD底物（Sigma-Aldrich,St Louis,MO）使其显影。通过使用自动读出器在492nm波长下完成光密度的读数。
5.蛋白免疫印迹
为了更详细的确认针对p17 BH10蛋白及其非洲突变体的抗体特异性，选择的杂交瘤细胞的上清液用蛋白免疫印迹技术进行测试，该技术允许检验抗体结合到变性的蛋白上的情况。首先，蛋白经受高温使其变性，并经受SDS-PAGE电泳。后一项技术允许变性的蛋白根据它们的大小在聚丙烯酰胺凝胶上运行，然后通过电场作用其被转移至硝酸纤维素膜上。为了显露出与这些蛋白相应的条带，用丽春红（Ponceau Red）对膜进行染色，并让其干燥。随后，在用PBS/BSA 5%封闭特异性位点并温育样品后，其经受免疫组织化学法检测，通过该方法，在用辣根过氧化物酶（HRP)标记的抗小鼠的山羊二抗温育并用DAB化合物（Sigma-Aldrich,St Louis,MO）显影后，可以评定MBA1单克隆抗体结合到蛋白（p17 BH10蛋白及其非洲突变体）的情况。
6.单克隆抗体同种型种类的测定
使用Isostrip单克隆抗体分型试剂盒（Saint-Cruz Biotechn）测定同种型，其特征在于能产生和选择MBA1单克隆抗体。
7.单克隆抗体的细胞荧光中性测试（cytofluorimetric neutralization test）
获得的单克隆抗体也要经受最优化的中性检验，以检验其封闭p17蛋白（BH10及其非洲突变体）和p17R受体之间相互作用的能力。为此，使用了一种肿瘤B淋巴细胞系，即Raji细胞系，其表达结合p17蛋白的表面受体（p17R）。第一，用p17BH10蛋白或其生物素化的非洲突变体温育抗体，以允许形成抗原-抗体复合物，然后加入Raji细胞4°C温育30’。若干次洗涤后，用链霉亲和素进一步温育，通过细胞荧光（cytofluorimetric）分析，来检测结合到p17R表面受体上且没有被单克隆抗体中和的蛋白存在的可能性。
8.核苷酸序列
通过使用RNA提取试剂盒（Qiagen,Milan,意大利），从分泌MBA 1单克隆抗体的克隆中分离出细胞RNA。通过使用高容量cDNA库试剂盒（High Capacity cDNAArchive Kit）（Applied Biosystem）使提取物经逆转录，且获到的cDNA作为通过PCR扩增编码单克隆抗体轻链（Vk）和重链（Vh）可变区的部分序列的模板。使用下面的引物来扩增这些特异的区域：Vk 5’正义:5’-CAGATCAGATCTCGTGATGACCCAG-3’,SEQ ID NO:6；3’Vk反义:5’-agcccgtttgagctccagcttgg-3’,SEQ ID NO:7；MuG102,Fd 5’正义:5’-TGTCCACCTCGAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGG-3’,SEQ ID NO:8；3’Vh反义:5’-gagactgtcaccggtgtgccttgg-3’,SEQ ID NO:9。
通过采用“T/A克隆”方法将PCR产物克隆到pGEM-T克隆载体（Promega）中，之后对包含插入片段的克隆进行测序和分析。
先前分离的小鼠Ig基因的轻链和重链可变区用限制性酶（Bgl II和SacI用于Vk;；Xho I和SgrAI用于Vh）消化后，被亚克隆至表达载体构建体中，分别被命名为L122S和L126S（Fiorentini S等人.,Scand J Immunol 55,284-292,2002）。
9.结果
形成的单克隆抗体，被命名为MBA1，结果对若干生物化学分子的特征非常有意义。免疫酶学ELISA和蛋白免疫印迹测试获得的结果说明MBA1识别三级构像和线性结构的p17BH10、S75X、S85X、S92X和S012X蛋白。此外，显示这种抗体不能识别AT20表位。
图1显示MBA1抗体对不同基质蛋白的结合反应性。图表显示MBA1单克隆抗体识别并结合有意义的蛋白（目标蛋白，the proteins of interest），与非相关的蛋白不同。蛋白免疫印迹技术也确认了这些结果。实际上MBA1单克隆抗体显示可结合到变性的p17 BH10蛋白及其非洲突变体上。
本发明人也鉴定了MBA1单克隆抗体的抗体同种型，其显示为一种IgG1/k链同种型的免疫球蛋白。
为了测定本发明中的单克隆抗体对p17BH10、S75X、S85X、S92X和S012X蛋白的中和结合能力，实施了进一步的测试。通过在Raji细胞上完成的细胞荧光分析，其中Raji细胞特征是在其表面存在p17R，用复合在检查的抗体上的蛋白温育，能注意到没有细胞结合到生物素化的p17蛋白及其非洲突变体上，因为单克隆抗体的存在，通过封闭p17-p17R相互作用，以限制性方式妨碍了其结合（图2）。本发明人检验了存在具有与MabMBA1同样特征的其他抗体时，p17和它的受体之间的相互作用是否会被改变：事实上，选择作为这个比较的MBA15单克隆抗体是IgG1k链免疫球蛋白，与MBA1一样，通过ELISA和蛋白免疫印迹显示其识别不同的p17蛋白，甚至在不同的表位上。然而，如图2显示，MBA15，不像本发明中的抗体，其不能改变检测的蛋白和它们的受体之间的相互作用。事实上，图2中描述的柱状图显示p17BH10蛋白及其非洲突变体能结合到所有分析的Raji细胞上表达的特异性受体。
最后，为了嵌合抗体本身，本发明人进行了关于编码被检测的MBA1单克隆抗体的重链（Vh）和轻链（Vk）可变区的核苷酸序列的研究。用特异性的引物分离出的Vh和Vk可变区，插入到包含其余的人类抗体区域的两种不同的表达载体构建体中，为了最后在单一的最终载体中组装嵌合抗体。MBA1单克隆抗体的重链和轻链可变区的核苷酸序列在序列列表中分别被命名为SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11。
显然，包含重链可变区和轻链可变区的任一单克隆抗体（重链可变区包含从核苷酸序列SEQ ID NO:10中获得的氨基酸序列，轻链可变区包含从核苷酸序列SEQ ID NO:11中获得的氨基酸序列）都在本发明的范围内。由于遗传密码的简并性，事实是一个氨基酸可由若干个核苷酸三联体编码，表达“从---中获得”意味着上述的核苷酸序列SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11没有限制的意思。
作为嵌合的可选情况，本发明的MBA1单克隆抗体可以通过本领域技术人员所熟知的传统技术，以人源化的形式制造，因此不需要进一步的描述。
10.MBA-1和MBS-3针对HIV p17蛋白系BH10及其非洲突变体的中 和能力的比较测定
通过蛋白免疫印迹技术测试了针对p17蛋白的单克隆抗体MAB-1（本发明）和MBS-3（现有技术），该技术允许检验抗体结合到变性的，从而呈线性的蛋白上的情况。
首先，根据SDS-PAGE技术，p17BH10蛋白及其非洲突变体（S92X、S85X、S75X和S012X）被变性且经受电场。在聚丙烯酰胺凝胶上电泳结束后，蛋白被转移至两张不同的硝酸纤维素膜上。为了显露出与这些蛋白相应的条带，从而检验其转移情况，用丽春红对膜进行染色，并让其干燥。在用PBS/BSA 5%封闭特异性位点并温育这两张膜后，实施免疫组织化学检测，通过该方法，每个具有两个单克隆抗体中一个的将会被测试（MAB-1和MBS-3），在用HRP标记的抗小鼠的山羊二抗温育并在X射线胶片（化学发光）上显影后，可以测定抗体结合到蛋白（p17 BH10蛋白及其非洲突变体）的情况。
单克隆抗体MAB-1和MBS-3也经受了最优化的中和测试，以检验它们封闭p17 BH10蛋白及其非洲突变体和它们的细胞受体（p17R)之间相互作用的能力。
使用Raji细胞，其是表达结合p17蛋白的表面受体（p17R）的一种肿瘤B淋巴细胞。
每个抗体用p17 BH10蛋白或其生物素化的非洲突变体温育，为了允许形成抗原-抗体复合物，然后用Raji细胞4°C温育30分钟。若干次洗涤后，通过细胞荧光分析，用链霉亲和素进一步温育，来检测结合到表面受体上且没有被单克隆抗体中和的蛋白的存在可能性。
检测的单克隆抗体（MBA-1和MBS-3）经免疫酶学测试，该测试显示这两种抗体达到的不同结果。
如图3显示（蛋白免疫印迹技术），单克隆抗体MBA-1以同样的亲和力结合到所有变性的p17 BH10、S75X、S85X、S92X和S012X蛋白上。相反，MBS-3以不同的亲和力结合到p17BH10蛋白和其突变体S75X、S92X和S012X蛋白上；而S85X突变体没有被识别。
进行细胞荧光测试以检验两个单克隆抗体MBA-1和MBS-3中和p17BH10、S75X、S85X、S92X和S012X蛋白结合到细胞受体的能力。所有分析的p17蛋白可以结合到在Raji细胞上表达的p17受体上（图4a-e）。向p17蛋白中加入MBA-1抗体完全抑制了它们与细胞受体相互作用的能力。相反，MBS-3单克隆抗体完全封闭了蛋白p17 BH10和S012X之间的相互作用，以及部分封闭了S75X、S92X与在Raji细胞上表达的p17受体之间的相互作用。相同的抗体不能封闭S85X突变体和p17细胞受体之间的相互作用（图4a-e）。
Claims (15)
1.一种针对人类免疫缺陷病毒HIV-1的p17或其功能片段的单克隆抗体，包含至少一个重链可变区和一个轻链可变区，所述重链可变区包含通过核酸序列SEQ ID NO:10获得的氨基酸序列，所述轻链可变区包含通过核酸序列SEQ ID NO:11获得的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，所述单克隆抗体是全长免疫球蛋白（Ig）。
3.根据权利要求2所述的单克隆抗体，所述单克隆抗体是IgG类免疫球蛋白。
4.根据权利要求3所述的单克隆抗体，所述单克隆抗体是同种型IgG1/k链的免疫球蛋白。
5.根据权利要求1所述的单克隆抗体，所述单克隆抗体是Fab片段。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的单克隆抗体，所述单克隆抗体是嵌合抗体。
7.根据权利要求1-5中任一项所述的单克隆抗体，所述单克隆抗体是人源化抗体。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的单克隆抗体，用作药物。
9.根据权利要求8所述的单克隆抗体，用作治疗与人类免疫缺陷病毒（HIV）相关的疾病的药物。
10.根据权利要求9所述的单克隆抗体，其中与人类免疫缺陷病毒相关的疾病选自由获得性免疫缺陷综合征（AIDS）、痴呆和淋巴瘤组成的组。
11.一种用于治疗人类免疫缺陷病毒（HIV）相关的疾病的药物组合物，包含治疗有效量的权利要求1-7中任一项所述的单克隆抗体，与一种或多种药学上可接受的赋形剂结合。
12.一种编码权利要求1-7中任一项所述的单克隆抗体的分离的核酸序列。
13.根据权利要求12所述的独立的核酸序列，包含核酸序列SEQ IDNO:10和/或核酸序列SEQ ID NO:11。
14.一种包含根据权利要求12或权利要求13所述的核酸序列的重组表达载体。
15.一种用权利要求14所述的重组表达载体转化的宿主细胞。
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| .1991, * |
| .1992, * |
| .1993, * |
| .1999, * |
| AKEMI OTA.Analysis of the Anti-HIV-1 of an Anti-p17-Derivative Peptide(P30-52) Monoclonal Antibody.< * |
| AKEMI OTA.Analysis of the Anti-HIV-1 of an Anti-p17-Derivative Peptide(P30-52) Monoclonal Antibody.<HYBRIDOMA>.1999, |
| HYBRIDOMA> * |
| Journal of Virology> * |
| MATTHIAS NIEDRIG.Charaterization of Murine Monoclonal Antibodies Directed Against the Submembrane Protein p17 of HIV-1.< * |
| MATTHIAS NIEDRIG.Charaterization of Murine Monoclonal Antibodies Directed Against the Submembrane Protein p17 of HIV-1.<HYBRIDOMA>.1993, |
| Momecular Immunology> * |
| SHANG F.Characterization fo monoclonal antibodies against the human immunodeficiency virus matrix protein, p17gag: identification of epitopes exposed at the surfaces of infected cells.< * |
| SHANGF.Characterizationfomonoclonalantibodiesagainstthehumanimmunodeficiencyvirusmatrixprotein p17gag: identification of epitopes exposed at the surfaces of infected cells.<Journal of Virology>.1991 |
| VERONIQUE ROBERT-HEBMANN.CLONAL ANALYSIS OF MURINE B CELL RESPONSE TO THE HUMAN IMMUNODEFFICIENCY VIRUS TYPE 1(HIV)-gag p17 AND p25 ANTIGENS.< * |
| VERONIQUE ROBERT-HEBMANN.CLONAL ANALYSIS OF MURINE B CELL RESPONSE TO THE HUMAN IMMUNODEFFICIENCY VIRUS TYPE 1(HIV)-gag p17 AND p25 ANTIGENS.<Momecular Immunology>.1992, |
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