CN102835389A - 玻璃化冷冻自动化操作系统及操作方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种玻璃化冷冻自动化操作系统及操作方法，系统包括计算机、XY电机驱动工作台、位于XY电机驱动工作台下的CCD摄像头、位于XY电机驱动工作台上的玻璃化冷冻器件、位于玻璃化冷冻器件上的倒置显微镜、位于玻璃化冷冻器件旁侧的三自由度自动化操作手、以及设于三自由度自动化操作手上的毛细管夹持器和玻璃毛细管，还包括与计算机相连的用于控制毛细管夹持器和玻璃毛细管的液压泵、与计算机相连的用于驱动三自由度自动化操作手的操作手驱动器以及与计算机相连的用于驱动XY电机驱动工作台的步进电机驱动器。本发明使用玻璃化冷冻自动化操作系统及操作方法来代替人工作业，将过程集中化，降低了操作的复杂性，可以大大提升工作效率。

Description

玻璃化冷冻自动化操作系统及操作方法

技术领域

本发明涉及玻璃化冷冻技术领域，特别是涉及一种玻璃化冷冻自动化操作系统及操作方法。

背景技术

胚胎或细胞的冷冻保存是人类辅助生殖技术中的重要环节，传统的冷冻方法耗时长，设备价格昂贵，且冷冻过程可能会形成冰晶，对细胞造成损伤，人们在不断摸索和研究中发明了玻璃化冷冻技术。

玻璃化冷冻技术是一种快速冷冻细胞或组织的方法，可避免冻融过程中细胞内冰晶的形成，最大限度的降低细胞损伤，方法简易，设备简单，在人类细胞、胚胎的冷冻保存中取得了不少进展。近年来，许多学者和专家致力于研究玻璃化冷冻技术在成熟卵母细胞、未成熟卵母细胞、精子及胚胎的各个发育时期冷冻保存中的应用，并陆续有健康婴儿出生的报道。

自1985年Rail和Fahy发明了玻璃化冷冻法以来，该方法获得极大推广，衍生了多种具有不同承载工具的玻璃化冷冻方法。根据冷冻过程中的胚胎冷冻主体承载工具的不同，具体可以分为细管法(一步法、二步法）、微滴法、电子显微镜铜网法、开放式拉长塑料细管法、玻璃微细管法、半细管法、封闭式拉长塑料细管法、固体表面玻璃化法、冷冻环法、开放式细管载体cryotop和密闭式细管载体cryotip等。

迄今为止，细胞的冷冻过程基本上都是手工完成。人在手工作业时，可能发生精神紧张、手部颤抖、视线错觉、疲劳等问题，会出现丢胚胎或细胞等操作错误，从而无法保证操作的稳定性、及时性、安全性等。

因此，针对上述技术问题，有必要提供一种玻璃化冷冻自动化操作系统及操作方法。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种玻璃化冷冻自动化操作系统及操作方法。

为了实现上述目的，本发明实施例提供的技术方案如下：

一种玻璃化冷冻自动化操作系统，所述系统包括计算机、XY电机驱动工作台、位于XY电机驱动工作台下的CCD摄像头、位于XY电机驱动工作台上的玻璃化冷冻器件、位于玻璃化冷冻器件上的倒置显微镜、位于玻璃化冷冻器件旁侧的三自由度自动化操作手、以及设于三自由度自动化操作手上的毛细管夹持器和玻璃毛细管，所述系统还包括与计算机相连的用于控制毛细管夹持器和玻璃毛细管的液压泵、与计算机相连的用于驱动三自由度自动化操作手的操作手驱动器以及与计算机相连的用于驱动XY电机驱动工作台的步进电机驱动器。

作为本发明的进一步改进，玻璃化冷冻器件包括若干阵列设置的液池。

作为本发明的进一步改进，液池设为6个，分别为液池①、液池②、液池③、液池④、液池⑤和液池⑥。

作为本发明的进一步改进，液池为方形，且所述液池的四个侧壁与底面的夹角为钝角。

作为本发明的进一步改进，每个液池的容积为75μL，深度为2mm。

作为本发明的进一步改进，液池中设有平衡液，所述平衡液包括ES溶液或VS溶液。

作为本发明的进一步改进，液池中平衡液的体积设为20μL。

相应地，一种玻璃化冷冻自动化操作系统的操作方法，所述方法包括：

S1、确定并添加玻璃化冷冻器件上对应序号的液池所应添加的平衡液；

S2、将玻璃化冷冻器件固定在倒置显微镜下的XY电机驱动工作台上，在倒置显微镜系统坐标的基础上，将玻璃化冷冻器件及液池的三维坐标信息输入计算机；

S3、通过CCD摄像头获取倒置显微镜物镜视野，并通过图像处理软件将物镜下的内容显示在计算机上；

S4、从保温箱中取出装有胚胎的培养皿，放在倒置显微镜下；

S5、通过计算机发出指令，驱动三自由度自动化操作手运动，从而带动玻璃毛细管在XYZ三方向移动，在倒置显微镜下观察玻璃毛细管尖端处的位置，确定毛细管尖端相对玻璃化冷冻器件的空间坐标信息，并输入计算机；

S6、将培养皿放置在玻璃化冷冻器件旁，使用移液管将胚胎从培养皿中移到液池中；

S7、控制三自由度自动化操作手，使得玻璃毛细管抓取、移动和释放胚胎，使得胚胎在每个液池中完成相应的冷冻步骤；

S8、将胚胎装载到密闭式细管载体中进行热封，并放入液氮中保存。

作为本发明的进一步改进，液池设为6个，分别为液池①、液池②、液池③、液池④、液池⑤和液池⑥，所述液池②设有ES溶液，液池③、液池④、液池⑤和液池⑥中设有VS溶液。

作为本发明的进一步改进，步骤S7具体为：

通过计算机给三自由度自动化操作手输入适当步进量，移动玻璃毛细管至液池①上方，驱动三自由度自动化操作手在Z方向运动，通过液压泵将胚胎吸入玻璃毛细管端部；

驱动三自由度自动化操作手移动玻璃毛细管，同时移动XY电机驱动工作台，使玻璃毛细管处于液池②上部，玻璃毛细管下降，将胚胎吐到液池②中ES溶液顶部，使胚胎在液池②中自由下降，进行平衡；

在玻璃毛细管中吸入适量ES溶液，再将胚胎吸入玻璃毛细管尖端，尖端上升，移动XY电机驱动工作台，使玻璃毛细管处于液池③上部，玻璃毛细管下降，将胚胎吐到液池③中VS溶液顶部，使胚胎在液池③中自由下降，进行平衡；

将胚胎吸入玻璃毛细管尖端，尖端上升，移动XY电机驱动工作台，使玻璃毛细管处于液池④上部，玻璃毛细管下降，将胚胎吐到液池④中VS溶液顶部，使胚胎在液池④中自由下降，进行平衡；

将胚胎吸入玻璃毛细管尖端，尖端上升，移动XY电机驱动工作台，使玻璃毛细管处于液池⑤上部，玻璃毛细管下降，将胚胎吐到液池⑤中VS溶液顶部，使胚胎在液池⑤中自由下降，进行平衡；

将胚胎吸入玻璃毛细管尖端，尖端上升，移动XY电机驱动工作台，使玻璃毛细管处于液池⑥上部，玻璃毛细管下降，将胚胎吐到液池⑥中VS溶液顶部，使胚胎在液池⑥中自由下降，进行平衡。

作为本发明的进一步改进，胚胎在液池②ES溶液中平衡的时间设为5-15min，胚胎在液池③和液池④VS溶液中平衡的时间设为5s，胚胎在液池⑤VS溶液中平衡的时间设为10s。

与现有技术相比，本发明使用玻璃化冷冻自动化操作系统及操作方法来代替人工作业，用液池来取代人工操作时所需的培养皿，将过程集中化，降低了操作的复杂性，可以大大提升工作效率，保证了操作的稳定性、及时性和安全性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明玻璃化冷冻自动化操作系统的示意图；

图2为本发明玻璃化冷冻自动化操作系统中玻璃化冷冻器件的示意图；

图3为本发明玻璃化冷冻自动化操作方法的流程图；

图4为本发明一实施方式中胚胎从培养皿中转移到玻璃化冷冻器件中的示意图；

图5为本发明一实施方式中玻璃毛细管从液池①中吸取胚胎的示意图；

图6为本发明一实施方式中胚胎从液池①转移至液池②的示意图；

图7为本发明一实施方式中玻璃毛细管吐出胚胎至液池②的示意图；

图8为本发明一实施方式中胚胎从液池②转移至液池③的示意图；

图9为本发明一实施方式中玻璃毛细管吐出胚胎至液池③的示意图；

图10为本发明一实施方式中玻璃毛细管从液池③中吸取胚胎的示意图；

图11为本发明一实施方式中胚胎从液池③转移至液池④的示意图；

图12为本发明一实施方式中玻璃毛细管吐出胚胎至液池④的示意图；

图13为本发明一实施方式中胚胎从液池④转移至液池⑤的示意图；

图14为本发明一实施方式中玻璃毛细管吐出胚胎至液池⑤的示意图；

图15为本发明一实施方式中胚胎从液池⑤转移至液池⑥的示意图；

图16为本发明一实施方式中玻璃毛细管吐出胚胎至液池⑥的示意图。

具体实施方式

本发明公开了一种玻璃化冷冻自动化操作系统，该系统包括计算机、XY电机驱动工作台、位于XY电机驱动工作台下的CCD摄像头、位于XY电机驱动工作台上的玻璃化冷冻器件、位于玻璃化冷冻器件上的倒置显微镜、位于玻璃化冷冻器件旁侧的三自由度自动化操作手、以及设于三自由度自动化操作手上的毛细管夹持器和玻璃毛细管，系统还包括与计算机相连的用于控制毛细管夹持器和玻璃毛细管的液压泵、与计算机相连的用于驱动三自由度自动化操作手的操作手驱动器以及与计算机相连的用于驱动XY电机驱动工作台的步进电机驱动器。

同时本发明还公开了一种应用玻璃化冷冻自动化操作系统的操作方法，该方法包括：

S1、确定并添加玻璃化冷冻器件上对应序号的液池所应添加的液体；

S2、将玻璃化冷冻器件固定在倒置显微镜下的XY电机驱动工作台上，在倒置显微镜系统坐标的基础上，将玻璃化冷冻器件及液池的三维坐标信息输入计算机；

S3、通过CCD摄像头获取倒置显微镜物镜视野，并通过图像处理软件将物镜下的内容显示在计算机上；

S4、从保温箱中取出装有胚胎的培养皿，放在倒置显微镜下；

S5、通过计算机发出指令，驱动三自由度自动化操作手运动，从而带动玻璃毛细管在XYZ三方向移动，在倒置显微镜下观察玻璃毛细管尖端处的位置，确定毛细管尖端相对玻璃化冷冻器件的空间坐标信息，并输入计算机；

S6、将培养皿放置在玻璃化冷冻器件旁，使用移液管将胚胎从培养皿中移到液池中；

S7、控制三自由度自动化操作手，使得玻璃毛细管抓取、移动和释放胚胎，使得胚胎在每个液池中完成相应的冷冻步骤；

S8、将胚胎装载到密闭式细管载体中进行热封，并放入液氮中保存。

本发明使用玻璃化冷冻自动化操作系统及操作方法来代替人工作业，将过程集中化，降低了操作的复杂性，可以大大提升工作效率。

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明中的技术方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

参图1所示，本发明的一种玻璃化冷冻自动化操作系统，该系统包括：

计算机5；

XY电机驱动工作台9；

位于XY电机驱动工作台9下的CCD摄像头2；

位于XY电机驱动工作台9上的玻璃化冷冻器件8；

位于玻璃化冷冻器件8上的倒置显微镜6；

位于玻璃化冷冻器件8旁侧的三自由度自动化操作手4；

设于三自由度自动化操作手4上的毛细管夹持器3和玻璃毛细管7；

与计算机5相连的用于控制毛细管夹持器和3玻璃毛细管7的液压泵1；

与计算机5相连的用于驱动三自由度自动化操作手4的操作手驱动器10；

以及与计算机5相连的用于驱动XY电机驱动工作台9的步进电机驱动器11。

本发明中自动化操作系统的玻璃化冷冻器件8是由医用聚碳酸酯材料注塑制成，此种材料无色透明，适合在显微镜下操作，且获FDA许可和达到ISO10999标准Part 1关于生物相容性要求，可以用来作为胚胎的冷冻器件。

玻璃化冷冻器件8包括若干阵列设置的液池，每个液池有对应的序号，倒入不同的平衡液、冷冻保护剂等，操作时按照序号依次自动进行，这样可以用液池来取代人工操作时所需的培养皿，将过程集中化，降低了操作的复杂性，可以大大提升工作效率。

参图2所示，在本发明的一优选实施方式中液池数量设为6个，呈3*2矩阵设置，每个液池上有各自的编号，分别为液池①81、液池②82、液池③83、液池④84、液池⑤85、液池⑥86，液池为方形，且液池的四个侧壁与底面的夹角为钝角。优选地，每个液池的容积为75μL，深度为2mm。液池中设有ES溶液或VS溶液，液池中ES溶液或VS溶液的体积设为20μL。

参图3所示，本发明的一种应用玻璃化冷冻自动化操作系统的操作方法，该方法包括：

S1、确定并添加玻璃化冷冻器件上对应序号的液池所应添加的液体；

S2、将玻璃化冷冻器件固定在倒置显微镜下的XY电机驱动工作台上，在倒置显微镜系统坐标的基础上，将玻璃化冷冻器件及液池的三维坐标信息输入计算机；

S3、通过CCD摄像头获取倒置显微镜物镜视野，并通过图像处理软件将物镜下的内容显示在计算机上；

S4、从保温箱中取出装有胚胎的培养皿，放在倒置显微镜下；

S5、通过计算机发出指令，驱动三自由度自动化操作手运动，从而带动玻璃毛细管在XYZ三方向移动，在倒置显微镜下观察玻璃毛细管尖端处的位置，确定毛细管尖端相对玻璃化冷冻器件的空间坐标信息，并输入计算机；

S6、将培养皿放置在玻璃化冷冻器件旁，使用移液管将胚胎从培养皿中移到液池中；

S7、控制三自由度自动化操作手，使得玻璃毛细管抓取、移动和释放胚胎，使得胚胎在每个液池中完成相应的冷冻步骤；

S8、将胚胎装载到密闭式细管载体中进行热封，并放入液氮中保存。

下面以自制的玻璃化冷冻器件为基础，具体介绍玻璃化冷冻的自动化操作过程。操作环境要求室温(20-27°C)，操作过程中显微镜平台不能过热，细胞在ES和VS溶液中平衡时，胚胎的曝光量要尽量小。具体步骤如下：

确定并添加玻璃化冷冻器件上对应序号的液池所应添加的液体，并给密闭式细管载体Cryotip标注必要信息；

将玻璃化冷冻器件固定在倒置显微镜下的XY电机驱动工作台上，在倒置显微镜系统坐标的基础上，将玻璃化冷冻器件及液池的三维坐标信息输入计算机；

轻轻颠倒ES和VS溶液瓶两次使溶液混合，在液池②82中滴有20μL的ES液滴，在液池③83、液池④84、液池⑤85、液池⑥86中各滴有20μL的VS溶液，分别为VS1溶液、VS2溶液、VS3溶液和VS4溶液；

通过CCD摄像头获取倒置显微镜物镜视野，并通过图像处理软件将物镜下的内容显示在计算机上；

从保温箱中取出装有胚胎的培养皿，放在倒置显微镜下，并在计算机屏幕上检查胚胎质量，选择质量最好的胚胎来进行玻璃化冷冻；

通过计算机发出指令，驱动三自由度自动化操作手运动，从而带动玻璃毛细管在XYZ三方向移动，在倒置显微镜下观察玻璃毛细管尖端处的位置，确定毛细管尖端相对玻璃化冷冻器件的空间坐标信息，并输入计算机；

将培养皿20放置在玻璃化冷冻器件8旁，使用移液管30将胚胎40从培养皿20中移到液池①81中(参图4所示)；

调节XY电机驱动工作台及倒置显微镜，使胚胎在计算机屏幕上可以清晰地显示，控制三自由度自动化操作手，使得玻璃毛细管抓取、移动和释放胚胎，使得胚胎在每个液池中完成相应的冷冻步骤。

参图5-16并结合图1所示，自动化操作步骤具体如下：

参图5所示，通过计算机给三自由度自动化操作手输入适当步进量，移动玻璃毛细管7在水平方向上靠近液池①81，在移动过程中，使玻璃毛细管7的尖端在竖直方向上明显高于玻璃化冷冻器件8，以防发生碰撞；

当玻璃毛细管7尖端到达液池①81上部时，驱动三自由度自动化操作手在Z方向运动，让玻璃毛细管7下降。当尖端在屏幕上变得清晰时，说明尖端到达细胞位置；

打开液压泵控制界面，输入所需负压参数，使玻璃毛细管尖端产生负压，将胚胎吸入玻璃毛细管端部。

参图6所示，驱动三自由度自动化操作手将玻璃毛细管7垂直上升5mm，然后沿着液池分布方向，以设定好的相邻两个液池之间的距离，向左移动XY电机驱动工作台，使玻璃毛细管处于液池②82上部，此时液池②82底部处于倒置显微镜焦点。

参图7所示，玻璃毛细管下降，尖端靠近ES溶液表面，增大压力液压泵，将胚胎吐到ES顶部，关闭液压泵。再将玻璃毛细管退回到原来高度，胚胎在ES液滴中自由下降。

开始计时，让胚胎在ES溶液中平衡5-15min。

接下来的后续所有步骤要在90-110s内完成。平衡结束后，玻璃毛细管以小步进量接近液池底部，当尖端也变得清晰时，可以认为尖端与胚胎已处在统一水平面上，在XY方向上移动玻璃毛细管使尖端靠近胚胎。

参图8所示，打开液压泵，产生负压，在玻璃毛细管中吸入适量ES溶液，再将胚胎吸入玻璃毛细管尖端；

尖端上升，然后沿着液池分布方向，向左移动XY电机驱动工作台，使玻璃毛细管处于液池③83上部，此时液池③83底部处于倒置显微镜焦点。

参图9所示，增加玻璃毛细管中压力，将胚胎吐出在VS1溶液中，卸去玻璃毛细管中压力，玻璃毛细管尖端位置不动，让胚胎在VS1溶液中保持5s。

参图10、11所示，玻璃毛细管中产生负压，将胚胎吸入尖端，再上升3mm（图10），驱动工作台XY方向电机，使工作台先向后移动一个液池距离，再向右移动两个液池距离，使玻璃毛细管处于液池④84上部（图11），此时液池④84底部处于倒置显微镜焦点。

参图12所示，玻璃毛细管尖端下降3mm，增加玻璃毛细管中压力，将胚胎吐出在VS2溶液中，卸去压力，玻璃毛细管尖端位置不动，让胚胎在VS2溶液中保持5s。

参图13所示，玻璃毛细管中产生负压，将胚胎吸入尖端，再上升3mm，然后沿着液池分布方向，向左移动工作台，使玻璃毛细管处于液池⑤85上部，此时液池⑤85底部处于倒置显微镜焦点。

参图14所示，玻璃毛细管尖端下降3mm，增加玻璃毛细管中压力，将胚胎吐出在VS3溶液中，卸去玻璃毛细管中压力，玻璃毛细管尖端位置不动，让胚胎在VS3溶液中保持10s。

参图15所示，玻璃毛细管中产生负压，将胚胎吸入尖端，再上升3mm，然后沿着液池分布方向，向左移动工作台，使玻璃毛细管处于液池⑥86上部，此时液池⑥86底部处于倒置显微镜焦点。

参图16所示，玻璃毛细管尖端下降，当尖端清晰时增加压力将胚胎吐出在VS4溶液底部。

最后将胚胎装载到准备好的密闭式细管载体Cryotip中并进行热封，并将密闭式细管载体Cryotip投入液氮保存。

由上述技术方案可以看出，本发明使用玻璃化冷冻自动化操作系统及操作方法来代替人工作业，用液池来取代人工操作时所需的培养皿，将过程集中化，降低了操作的复杂性，可以大大提升工作效率，保证了操作的稳定性、及时性和安全性。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (11)

1.一种玻璃化冷冻自动化操作系统，其特征在于，所述系统包括计算机、XY电机驱动工作台、位于XY电机驱动工作台下的CCD摄像头、位于XY电机驱动工作台上的玻璃化冷冻器件、位于玻璃化冷冻器件上的倒置显微镜、位于玻璃化冷冻器件旁侧的三自由度自动化操作手、以及设于三自由度自动化操作手上的毛细管夹持器和玻璃毛细管，所述系统还包括与计算机相连的用于控制毛细管夹持器和玻璃毛细管的液压泵、与计算机相连的用于驱动三自由度自动化操作手的操作手驱动器以及与计算机相连的用于驱动XY电机驱动工作台的步进电机驱动器。

2.根据权利要求1所述的玻璃化冷冻自动化操作系统，其特征在于，所述玻璃化冷冻器件包括若干阵列设置的液池。

3.根据权利要求2所述的玻璃化冷冻自动化操作系统，其特征在于，所述液池设为6个，分别为液池①、液池②、液池③、液池④、液池⑤和液池⑥。

4.根据权利要求2所述的玻璃化冷冻自动化操作系统，其特征在于，所述液池为方形，且所述液池的四个侧壁与底面的夹角为钝角。

5.根据权利要求2所述的玻璃化冷冻自动化操作系统，其特征在于，所述每个液池的容积为75μL，深度为2mm。

6.根据权利要求2所述的玻璃化冷冻自动化操作系统，其特征在于，所述液池中设有平衡液，所述平衡液包括ES溶液或VS溶液。

7.根据权利要求6所述的玻璃化冷冻自动化操作系统，其特征在于，所述液池中平衡液的体积设为20μL。

8.一种应用权利要求1所述玻璃化冷冻自动化操作系统的操作方法，其特征在于，所述方法包括：

S1、确定并添加玻璃化冷冻器件上对应序号的液池所应添加的平衡液；

S2、将玻璃化冷冻器件固定在倒置显微镜下的XY电机驱动工作台上，在倒置显微镜系统坐标的基础上，将玻璃化冷冻器件及液池的三维坐标信息输入计算机；

S3、通过CCD摄像头获取倒置显微镜物镜视野，并通过图像处理软件将物镜下的内容显示在计算机上；

S4、从保温箱中取出装有胚胎的培养皿，放在倒置显微镜下；

S5、通过计算机发出指令，驱动三自由度自动化操作手运动，从而带动玻璃毛细管在XYZ三方向移动，在倒置显微镜下观察玻璃毛细管尖端处的位置，确定毛细管尖端相对玻璃化冷冻器件的空间坐标信息，并输入计算机；

S6、将培养皿放置在玻璃化冷冻器件旁，使用移液管将胚胎从培养皿中移到液池中；

S7、控制三自由度自动化操作手，使得玻璃毛细管抓取、移动和释放胚胎，使得胚胎在每个液池中完成相应的冷冻步骤；

S8、将胚胎装载到密闭式细管载体中进行热封，并放入液氮中保存。

9.根据权利要求8所述的玻璃化冷冻自动化操作方法，其特征在于，所述液池设为6个，分别为液池①、液池②、液池③、液池④、液池⑤和液池⑥，所述液池②设有ES溶液，液池③、液池④、液池⑤和液池⑥中设有VS溶液。

10.根据权利要求9所述的玻璃化冷冻自动化操作方法，其特征在于，所述步骤S7具体为：

通过计算机给三自由度自动化操作手输入适当步进量，移动玻璃毛细管至液池①上方，驱动三自由度自动化操作手在Z方向运动，通过液压泵将胚胎吸入玻璃毛细管端部；

驱动三自由度自动化操作手移动玻璃毛细管，同时移动XY电机驱动工作台，使玻璃毛细管处于液池②上部，玻璃毛细管下降，将胚胎吐到液池②中ES溶液顶部，使胚胎在液池②中自由下降，进行平衡；

在玻璃毛细管中吸入适量ES溶液，再将胚胎吸入玻璃毛细管尖端，尖端上升，移动XY电机驱动工作台，使玻璃毛细管处于液池③上部，玻璃毛细管下降，将胚胎吐到液池③中VS溶液顶部，使胚胎在液池③中自由下降，进行平衡；

将胚胎吸入玻璃毛细管尖端，尖端上升，移动XY电机驱动工作台，使玻璃毛细管处于液池④上部，玻璃毛细管下降，将胚胎吐到液池④中VS溶液顶部，使胚胎在液池④中自由下降，进行平衡；

将胚胎吸入玻璃毛细管尖端，尖端上升，移动XY电机驱动工作台，使玻璃毛细管处于液池⑤上部，玻璃毛细管下降，将胚胎吐到液池⑤中VS溶液顶部，使胚胎在液池⑤中自由下降，进行平衡；

将胚胎吸入玻璃毛细管尖端，尖端上升，移动XY电机驱动工作台，使玻璃毛细管处于液池⑥上部，玻璃毛细管下降，将胚胎吐到液池⑥中VS溶液顶部，使胚胎在液池⑥中自由下降，进行平衡。

11.根据权利要求10所述的玻璃化冷冻自动化操作方法，其特征在于，所述胚胎在液池②ES溶液中平衡的时间设为5-15min，胚胎在液池③和液池④VS溶液中平衡的时间设为5s，胚胎在液池⑤VS溶液中平衡的时间设为10s。

Images