CN102827298B - 紫芝液体深层发酵菌丝体均一多糖及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开紫芝液体深层发酵菌丝体均一多糖，其特征在于，所述均一多糖的总糖含量为大于95％，且所述均一多糖的分子量为3000～10000道尔顿，优选7762.23道尔顿。本发明也公开上述均一多糖的制备方法。本方法提供的紫芝液体深层发酵菌丝体均一多糖的多糖含量更高、给药剂量更低、纯度更高，且其制备工艺亦适于工业化生产。

Description

紫芝液体深层发酵菌丝体均一多糖及其制备方法

技术领域

本发明涉及紫芝液体深层发酵菌丝体均一多糖GS-B-W-1、其制备方法及其在制备抗肿瘤药物中的用途。

背景技术

食药用真菌具有抗肿瘤抗病毒、降血脂、延缓衰老、护肝排毒、促进核酸和蛋白质生物合成等多种功效，在中国有悠久的使用历史。国内外大量研究表明，真菌多糖是从真菌子实体、菌丝体、发酵液中分离得到的，为真菌类药物的药效部位，是能够控制细胞分裂分化，调节细胞生长衰老的一类活性多糖。

紫芝(Ganodermasinense)作为灵芝属真菌(2005版中国药典)，其有较明显的抗肿瘤、提高免疫力的功效。由于其制备工艺不明确，多糖含量较低(一般＜60％)。另外紫芝粗多糖组分复杂，主要药效部位和组分尚未阐明。且由于紫芝子实体资源稀少，市场上少见紫芝产品。

紫芝粗多糖溶解度很差，粘度较大，颜色深，味重，其分子量从几千到上千万，分子量跨度很大，难找到合适的质量控制方法。研究表明，分子量是影响多糖组分药效的主要因素之一，若能将粗多糖分离纯化得到均一多糖，阐明其构效关系，不仅能提高药效水平，并且对质量控制有很大的帮助。

中国专利200710045369.4“一种紫芝发酵方法及制得的紫芝菌丝体”公开了一种紫芝液体深层发酵产生菌丝体的方法，该菌丝体用水提醇沉法提取得到的粗多糖含量在39～75％，其体内药理实验中，口服剂量为40mg/kg/天时有一定抗肿瘤活性。中国专利200710045368.x“紫芝菌丝体胞内多糖及其制备方法和应用”公开了一种从紫芝液体深层发酵产生的菌丝体中提取制备得到粗多糖的方法。该方法涉及的水提醇沉法提取得到粗多糖含量在39～75％。其药理实验的剂量也为40mg/kg/天(给药方式：口服喂药)。杨国红，杨义芳，金隽迪(紫芝液体深层发酵的抗肿瘤活性部位研究[J].中草药，2008，39(6)：877-880)对紫芝液体深层发酵的抗肿瘤活性多糖进行了研究，从紫芝菌丝体中提取得到胞内多糖，其药理实验的剂量也为40mg/kg/天(给药方式：口服喂药)。然而，以上专利申请和文章均未涉及多糖分子量、纯度及结构解析方面的研究。

鉴于现有技术的状况，需要寻找多糖含量高、具有明显的抗肿瘤活性且给药剂量比常规方法提取得到的粗多糖的更低的紫芝菌丝体抗肿瘤多糖组分。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种多糖含量高、抗肿瘤活性更明显且给药剂量更低的紫芝菌丝体抗肿瘤多糖组分。

如本发明所使用，“液体深层发酵”是发酵工业上常用的一种发酵方法，它的培养基是液态的。

如本发明所使用，“菌丝体”是菌丝集合在一起构成一定的宏观结构。

如本发明所使用，“均一多糖”是单糖通过聚合而成的多糖，聚合的糖有特定的结构单元。均一多糖可分为相同单糖形成的聚糖和不同单糖形成的杂多糖。

本发明的第一个目的在于提供一种紫芝液体深层发酵菌丝体均一多糖，将其命名为GS-B-W-1，其特征在于，所述均一多糖的总糖含量为大于95％，优选为大于98.5％；且所述均一多糖GS-B-W-1的分子量为3000-10000道尔顿，优选为7762.23道尔顿。

根据本发明的一个优选的实施方式，经TLC和HPLC分析可以得知，所述均一多糖GS-B-W-1中的多糖主要由半乳糖和葡萄糖组成，所述半乳糖、葡萄糖的摩尔比为1.8-2.2∶1，优选1.98∶1。

进一步，经高点酸氧化及Smith降解分析得知，所述均一多糖GS-B-W-1是具有分支的(1→4)-α-葡萄糖和半乳糖的聚糖，其主链上联有1→6连接的半乳糖，和少量未知单糖。

本发明的第二个目的在于提供一种紫芝液体深层发酵菌丝体提取物，其包含以上所述的均一多糖，所述均一多糖的总糖含量为大于95％，优选为98.5％；且所述均一多糖的分子量为3000-10000道尔顿，优选为7762.23道尔顿。

本发明结合膜技术和柱层析将不同分子量多糖分离，从而得到紫芝液体深层发酵菌丝体抗肿瘤均一多糖GS-B-W-1，该均一多糖GS-B-W-1在降低给药剂量、并且不增加毒性的前提下能达到与传统方法得到的紫芝液体深层发酵菌丝体多糖相当的药效。

超滤技术是指常温下以一定压力和流量，利用不对称微孔结构和半透膜分离介质、以错流方式进行过滤，使溶剂及小分子物质通过，高分子物质被滤膜阻留，从而达到分离过程无相变、分离效率高、无需添加化学试剂无污染、无需加热、能耗低、条件温和不破坏成分、操作方便、流程短的特点。利用膜技术能将不同分子量的样品分割开。

柱层析能按照不同的原理将复杂的混合物分离纯化，已得到单一组分为目的。而分离纯化的关键在于所选的填料，根据本发明的一个优选的实施方式，本发明所选择的两个填料分别是阴离子交换树脂和葡聚糖凝胶，前者是根据被分离组分离子交换能力的差别而实现分离，后者根据被分离组分分子的线团尺寸而进行分离。

本发明的第三个目的在于提供上述紫芝液体深层发酵菌丝体均一多糖GS-B-W-1的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：紫芝液体深层发酵菌丝体经水提醇沉得到粗多糖，粗多糖经超滤、浓缩和柱层析，得到紫芝液体深层菌丝体均一多糖GS-B-W-1。

上述制备方法简单易行、生产周期短、成本较低廉。

根据本发明的一个优选的实施方式，超滤步骤通过超滤膜进行。选择截留分子量为1-5万的超滤膜。更优选地，所述超滤膜的截留分子量为3万。

根据本发明的一个优选的实施方式，所述超滤膜可由聚酰胺聚醚砜膜或醋酸纤维素制成。

根据本发明的一个优选的实施方式，浓缩步骤通过纳滤膜进行。优选由聚酰胺复合材料构成的纳滤膜。优选截留分子量为150-300的纳滤膜。

根据本发明的一个优选的实施方式，柱层析步骤通过加负压进行。采取的仪器设备为蠕动泵，自动收集仪。

根据本发明的一个优选的实施方式，本发明所选择的两个填料分别是阴离子交换树脂和葡聚糖凝胶。

根据本发明的一个特别优选的实施方式，柱层析选择的填料阴离子交换树脂为DEAE-cellulose52。

根据本发明的一个特别优选的实施方式，柱层析选择的填料葡聚糖凝胶的型号为Sephadex-50。

本发明制备均一多糖GS-B-W-1的具体步骤如下：紫芝菌丝体(本发明所述“紫芝菌丝体”根据中国专利200710045369.4“一种紫芝发酵方法及制得的紫芝菌丝体”中公开的方法所得)加水提取，提取液减压浓缩后，醇沉(通常使用乙醇)，沉淀部分干燥至恒重后，再溶解于水，过滤，用一定分子量的超滤膜超滤，再用一定分子量的纳滤膜分别浓缩得到截留液和透过液，将上述透过液冷冻干燥，得到分子量小于3万的紫芝菌丝体多糖组分GS-B；再经过阴离子交换树脂，葡聚糖凝胶柱得到紫芝液体深层发酵菌丝体均一多糖GS-B-W-1。

本发明利用膜技术和柱层析将紫芝液体深层发酵菌丝体粗多糖纯化成均一多糖，药理实验表明纯化后均一多糖GS-B-W-1有明显的抗肿瘤作用的活性。

本发明方法得到的紫芝液体深层发酵菌丝体均一多糖GS-B-W-1含量为大于95％，优选为98.5％(苯酚-硫酸法检测)，其分子量为7762.23Da。将该均一多糖部位进行药理实验，GS-B-W-1在低浓度下即有显著的促进的T淋巴细胞增殖活性，而对LPS诱导小鼠脾脏B淋巴细胞增殖反应中，GS-B-W-1呈一定的量效关系，且未见对给药动物的毒性反应。

因此，本发明的第三个目的在于提供上述紫芝液体深层发酵菌丝体均一多糖GS-B-W-1在制备抗肿瘤药物和提高免疫力药物中的应用。

与现有的技术相比，本方法提供的紫芝液体深层发酵菌丝体均一多糖GS-B-W-1的多糖含量更高、给药剂量更低、纯度更高，且其制备工艺亦适于工业化生产。

附图说明

图1为本发明实施例1所得紫芝液体深层发酵菌丝体均一多糖GS-B-W-1的HPGPC图谱

图2为实施例1步骤3)中GS-B过DEAE的洗脱曲线。

图3为实施例1步骤4)中w(14-26)过Sephadex-50的洗脱曲线。

图4为GS-B-W-1水解后的TLC结果，其中1为木糖；2为鼠李糖；3为半乳糖；4为甘露醇；5为葡萄糖；6为GS-B；7为混合单糖；8为GS-B-W-1；9为阿拉伯糖；10为葡萄糖醛酸；11为半乳糖醛酸；12为岩藻糖。

图5A和5B分别为若干标准单糖混合物和GS-B-W-1水解并乙酰化后的GC色谱图，其中1为鼠李糖；2为阿拉伯糖；3为木糖；4为甘露糖；5为葡萄糖；6为半乳糖。

图6为高碘酸标准曲线。

图7A-7D分别为水、赤藓醇、甘油、实施例1制得的GS-B-W-1降解样品的HPLC图谱。

图8为实施例1制得的GS-B-W-1的紫外图谱。

图9为实施例1制得的GS-B-W-1的红外图谱。

图10为实施例1制得的GS-B-W-1的¹H-NMR图谱。

图11为实施例1制得的GS-B-W-1的¹³CNMR图谱。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，通过以下实施例来说明，但这些实施例不构成对本发明的限制。

实施例1：紫芝液体深层发酵菌丝体均一多糖GS-B-W-1的制备：

1)粗多糖的制备：

紫芝液体深层发酵菌丝体(所述紫芝液体深层发酵液通过中国专利200710045369.4“一种紫芝发酵方法及制得的紫芝菌丝体”中所述方法得到)具体方法如下：紫芝菌种(Ganodermasinense)从山东购得。平板培养基在121℃下消毒灭菌30分钟，28℃培养4-6天。摇瓶种子培养基121℃消毒灭菌30分钟，冷却后在无菌室接种，在28±1℃摇瓶间的摇床上，震荡培养5-7天，挑选好的摇瓶种子进发酵罐内培养5-6天，最后得到紫芝液体发酵菌丝体。

将菌丝体用水提取1～3h，提取液减压浓缩，加入乙醇沉淀，沉淀部分干燥至恒重，得粗多糖。

2)超滤分离：

取粗多糖用200倍的水溶，过滤，取水溶液进行外压式超滤处理(超滤膜可以是由聚酰胺制成、截留分子量为3万的超滤膜；或由聚醚砜膜制成、截留分子量为1万的超滤膜；或由醋酸纤维素制成、截留分子量为5万的超滤膜)，进样压力＝0.2Mpa，浓溶液流出压力＝0.15Mpa，将水溶液分为截留液和透过液。将透过液用纳滤膜浓缩(纳滤膜是聚酰胺复合材料构成的，截留分子量为150、200或250)，并冷冻干燥，得到透过液部分GS-B。

3)柱层析分离：

取GS-B1.5g，用少量去离子水溶液溶解，上已平衡好的DEAE-cellulose52纤维素柱，用去离子水洗脱，以10mL/min管收集洗脱液2个柱体积。每隔2～5管用苯酚-硫酸法测定其吸收值，并做洗脱曲线。洗脱曲线见附图2。

根据该洗脱曲线，分别合并主峰14#-26#、27#-42#，并浓缩冻干，称重。其中14#-26#【记为w(14-26)】占洗脱液80％量(1203.8mg)。取少量配成5mg/mL水溶液，进行HPGPC检测，可知，该洗脱部分主要由保留时间为31min峰的多糖组成，根据保留时间-分子量对数标准曲线，可知该流份w(14-26)平均分子量在5000左右。

故选用分离范围合适的Sephadex-50凝胶柱为下一步的纯化载体。

4)葡聚糖凝胶Sephadex-50的纯化：

取DEAE柱洗脱的w(14-26)1200mg，用少量去离子水溶解，上已平衡好的SephadexG-50柱，用去离子水洗脱，以5mL/min管，收集2个柱体积。每隔2管用苯酚-硫酸法测定其吸收值，并做洗脱曲线，洗脱曲线见附图3。

根据该洗脱曲线，合并8#-14#，浓缩冷冻干燥，称重，得到固体255mg，名为GS-B-W-1。

实施例2：苯酚硫酸法测定本发明紫芝液体深层发酵菌丝体均一多糖GS-B-W-1的多糖含量

具体步骤如下：

标品配制：精密称定干燥好的葡萄糖25mg，定溶至100ml，配成250ug/ml标品溶液，分别取0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3mL于试管中，加去离子水补足0.3mL，分别加5％苯酚0.7mL充分摇匀，快速加入浓硫酸4mL，50℃、40min水浴，冷却后测定吸光度。

空白配制：取0.6ml去离子水，加5％苯酚1.4ml，浓硫酸8ml，水浴加热，冷却，作空白液。

标准曲线绘制：将标准待测液和空白液用紫外分光光度法于488nm处测其吸收值，并做标准曲线。

样品配制：取GS-B-W-1样品精密称定5mg，加入10ml的去离子水中配制0.5mg/ml溶液，取0.05ml于试管中，加水补足0.3ml，按标品液依次加入苯酚、浓硫酸，水浴加热，冷却，作样品液。

检测：将待测样品用紫外分光光度法于488nm处测其吸收值，用标准曲线测得GS-B-W-1的多糖含量为98.5％。

实施例3：用葡聚糖标准品Dextron系列标定本发明紫芝液体深层发酵菌丝体均一多糖GS-B-W-1中多糖的分子量

具体方法如下：

色谱条件：TSK-GELGMPWxl色谱柱；流动相为水；流速：0.3mL/nin；柱温35℃；检测器为：示差检测器。

标品Dextron、GS-B-W-1样品分别用水溶解，进样。

测定葡聚糖Dextron系列和GS-B-W-1的保留时间，以Dextron的保留时间-Dextron系列的分子量对数值做标准曲线，将GS-B-W-1的保留时间带入标准曲线，可知GS-B-W-1为7762.23道尔顿。

实施例4：紫芝液体深层发酵菌丝体均一多糖GS-B-W-1的结构解析

1)完全酸水解：

取5mg实施例1制得的GS-B-W-1，放入安培瓶中，加入2mL，2mol/L的三氟醋酸(TFA)，充N₂后封管，在110℃下水解4h。试管内溶液减压蒸干，然后加入甲醇1～2mL蒸干，重复三次操作，以完全除去TFA。再向样品中加入0.5mL左右的水使样品溶解。

1.1GS-B-W-1水解后的TLC结果：

在高效硅胶板(型号：HSGF254)上分别点多糖水解样品、单糖及混合单糖，分别以丙酮-水(24∶1)；正丁醇-乙酸乙酯-异丙醇-醋酸-水-吡啶(35∶100∶60∶35∶30∶35)上行二次展开，取出晾干，用苯胺-邻苯二甲酸于110℃加热10min。TLC显示样品对应处有葡萄糖和半乳糖两个斑点，见附图4。

从TLC图可以看出，本发明GS-B-W-1是由半乳糖、葡萄糖组成的一种杂多糖。

1.2还原与乙酰化及气相分析：

1.2.1还原与乙酰化：

将水解后的样品溶于3mL左右的蒸馏水中，加入20mgNaBH₄的于室温下还2h(不时地摇振一下)，再逐滴加入冰醋酸破坏过量的NaBH₄，调节溶液的PH值至4～5之间，减压蒸干，加入1～2mL甲醇及一滴冰醋酸，再减压蒸干，如此重复三次，最后一次不加冰醋酸，然后于80～90℃真空干燥10～15min或室温下真空干燥(P₂O₅)5～6h。还原后的样品中加入2mL醋酐，密塞，100℃反应1h，减压蒸干，加入2mL甲苯，再蒸干，重复三次以完全除去过剩的醋酐。

1.2.2萃取及气相分析：

将乙酰化后的产物用氯仿和蒸馏水交替溶解转移到分液漏斗中，振摇后，静置分层，去除水层，再以等体积的蒸馏水洗涤二次，去处水层，氯仿层以无水硫酸钠干燥，振摇后放置10min，再过滤除去硫酸钠固体，将氯仿溶液浓缩至0.1mL左右后进行气相色谱(GC)分析。

1.2.2.1气相条件：

色谱柱：HP-121000mm×0.2mm弹性石英毛细管色谱柱；固定相：OV-225；载气：氮气；检测器：氢火焰离子化检测器(FID)；色谱条件：柱室起始温度130℃，保留5min。

程序升温4℃/min，终止温度240℃；汽化温度280℃；检测器温度250℃。

1.2.2.2GS-B-W-1气相结果：

GS-B-W-1水解并乙酰化后的GC色谱图(图5B)显示，有葡萄糖峰(6号峰)、半乳糖峰(5号峰)和一未知单糖峰(7号峰)，根据其峰面积和质量比可推得葡萄糖和半乳糖的摩尔比为1∶1.98，而7号峰占比例较小，这可能是TLC分析时未检出其他斑点的原因。

2)高碘酸氧化：

2.1高碘酸标准曲线：

30mmol/L高碘酸液配制：精密称取高碘酸钠322.08mg定溶于50mL容量瓶。

标准曲线的绘制：取8个250mL容量瓶分别依次加入高碘酸钠溶液0.2，0.4，0.6，0.8，1，1.5，2mL，加去离子水定容。放置10min后，以水作为空白，用分光光度法，在223nm的波长处测吸收度，以高碘酸钠μmol/L为横坐标，光密度值为纵坐标作标准曲线。见表1和图6。

表1、不同浓度高碘酸在223nm的吸收度

2.2高碘酸氧化反应：

精密称取GS-B-W-19.93mg于10mL容量瓶中，然后加入15mmol/LNaIO4定容至刻度。放置在暗处反应(4℃)，间隔时间(0h、2h、24h、48h、72h......)取样0.1mL，用蒸馏水稀释250倍，用紫外分光光度计，以蒸馏水作空白对照，在223nm波长处测吸光度值，直到吸光度值恒定为止。加乙二醇终止反应(中和剩余的高碘酸)，高碘酸氧化完成。

2.3用NaOH滴定甲酸的生成量：

0.1mol/LNaOH滴定液标定：精密称取105℃恒重的邻苯二甲酸氢钾0.6g溶于50mL新沸过的冷水，酚酞做为指示液，滴定至溶液显粉红色。

最终测得NaOH溶液浓度为0.092mol/L。

甲基红指示剂配制：精密称取0.1004g，加0.05mol/LNaOH溶液7.4mL使溶解，再加水稀释至200mL，即得。

取2mL上述氧化液，加1滴甲基红作指示剂，用0.0092mol/LNaOH(用邻苯二甲酸氢钾标定)滴定，计算得甲酸生成量。

2.4结果显示：

2.4.1吸光值恒定时测得A吸收值为0.415。高碘酸液对照初始A吸收值为0.607，而高碘酸液在72h后吸收值无变化。故可以得出高碘酸与样品反应的0.51mol。

2.4.2根据滴定最后计算得甲酸生成量为0.23mmol。

2.4.3通过NaOH滴定结果计算得知有甲酸生成，说明存在1→、1→6键型；而高碘酸消耗量高于甲酸生成量的二倍，说明存在被高碘酸氧化不产生甲酸的己糖残基1→2、1→2，6、1→4、1→4，6键型；甲酸生成量显示分子中1→、1→6键型的己糖残基约占23％，高碘酸消耗量及甲酸生成量显示分子中的糖残基均可被氧化。可以初步推断可能存在1→2糖苷键，1→4糖苷键，1→6糖苷键结构。

3)Smith降解反应

将乙二醇处理后的GS-B-W-1用高碘酸氧化后的溶液透析(Mw＝3500)，蒸馏水透析48小时。浓缩，加入NaBH₄还原过夜。用冰醋酸中和至pH为6～7，透析，减压蒸至2mL左右，进行冷冻干燥。将还原的样品放入安瓿瓶中，加入2mL2mol/LTFA，充N₂后封管，于110℃下水解4h，反应瓶中的溶液减压蒸干，再加入1～2mL的甲醇，蒸干，重复三次以除尽过量的TFA，水解后的样品用1mL水溶解，做HPLC考察。

3.1色谱条件：

液相色谱柱：TYPEUG80(4.6×250mm)

软件处理系统：Minennium32版GPC数据处理系统

检测器：Water2410示差折光检测器

流动相：乙腈∶水＝3∶1

柱温箱：35℃检测器温度：35℃

流速：1mL/min

对照品为赤藓醇、甘油。

3.2结果：见附图7A-7D。

GS-B-W-1降解产物HPLC检测出少量甘油和大量赤藓醇表明多糖GS-B-W-1含有可以产生甘油的键型，即1→、1→2、1→6、1→2，6和可生成赤藓醇的键型，即1→4、1→4，6，说明GS-B-W-1含还原端和1→4、1→6、1→4，6糖苷键，其中由1→4构成主链结构。

4)紫外图谱：见附图8。

取GS-B-W-1样品进行紫外全波长扫描，在260nm和280nm处未见吸收，证明不含核酸和蛋白质。

5)红外图谱：

取1mgGS-B-W-1样品，用溴化钾压片进行IR检测。结果见附图9。

GS-B-W-1红外光谱图有多糖特征吸收，3382cm^-1处宽峰强吸收为多糖中羟基O-H伸缩振动吸收峰，2923cm^-1处出现一个较弱的吸收峰为次甲基的C-H伸缩振动；1372cm^-1是O-H的弯曲振动吸收；1047cm^-1和1115cm^-1是C-O的伸缩振动；在835cm^-1的吸收峰是α-糖苷键的特征吸收，说明GS-B-W-1中存在α-糖苷键而没有β-糖苷键(因没有895cm^-1的特征吸收峰)；在1730cm^-1处没有吸收峰，说明不含糖醛酸。

6)核磁图谱：

核磁光谱(NMR)：取多糖样品10mg装入核磁管，溶于重水中，在核磁共振仪上进行¹H-NMR，¹³C-NMR等光谱分析。结果见附图10。

¹H-NMR图谱分析：主要解决多糖结构中糖苷键构型问题，由于多糖的信号大多堆集在化学位移δ3.5～5.5的狭小范围内，δ3.5～4为糖环质子信号。除C1上质子信号易解析外其他C2～C6的质子信号相互重叠交叉，解析困难。从附图10中可见C1质子化学位移位于δ4.8～5.3间，则证明GS-B-W-1含α型吡喃己糖，与红外结果相符。

¹³C-NMR图谱分析：如附图11，均显示多重峰，表示多糖结构的复杂性。通过比较化学位移已归属的取代单糖或简单寡糖来归属未知多糖，同时利用苷化经验，将GS-B-W-1的¹³C-NMR图谱信号归属如下：

δ71.9为取代后的C6信号峰，δ71.1为未取代的C5信号峰，根据半乳糖和葡萄糖中各个C的化学位移，推测δ92.862为α-D-葡糖糖的异头碳C1信号峰，δ61.495为α-D-葡萄糖的C4信号峰，推测葡萄糖以1→4连接；δ96.594为α-D-半乳糖的异头碳C1信号峰，δ71.180为α-D-半乳糖的C4信号峰，半乳糖以1→4连接；其余化学位移值δ65～72为糖环上非连接碳C2、C3、C5信号峰。δ63～65存在三组峰，证明另有三种未取代的C6，推测可能为不同连接方式的α-D-半乳糖与α-D-葡萄糖的C6。δ56.0可能为未知单糖的甲基部位的信号峰。

实施例6：实施例1制得的紫芝液体深层发酵均一多糖GS-B-W-1的药理活性

1)GS-B的体内抗肿瘤实验：

1.1动物：昆明种小鼠，雄性

1.2实验方法：

取生长良好的小鼠肝癌H22腹水或Lewis肺癌瘤块，用生理盐水以1∶4稀释(细胞浓度约1-2×10⁷个/ml)，每只小鼠右腋皮下接种0.2ml。

接种后次日起给药，给药体积为0.5ml/20g体重，小鼠肝癌H22连续腹腔注射7天，Lewis肺癌连续腹腔注射10天。双灵固本散经口灌胃。接种后10日解剖H22，14日解剖Lewis肺癌，取瘤块，称瘤重，结果判定根据以下公式：

1.3实验结果：

表1、GS-B对小鼠H22的抑制率

与对照组比较：^*P＜0.05，^**P＜0.01。

表2、GS-C对小鼠H22和Lewis的抑制率

与对照组比较：^*P＜0.05，^**P＜0.01。

由表1，表2可知分子量小于3万(GS-B)的多糖部位有一定的抗肿瘤作用。

2)GS-B-W-1的体外对人肿瘤细胞株的细胞毒作用(MTT实验)：

2.1实验材料及配制：

(1)细胞株：A549(人肺癌细胞株)、SKOV3(人卵巢癌细胞株)、K562(人白血病细胞株)、SMMC-7721(人肝癌细胞株)。上述细胞株由上海医药工业研究药理室保存，传代维持。

(2)DMEM完全培养基：添加10％新生牛血清(GIBCOBRL)、双抗；

(3)0.25％胰蛋白酶溶液(Trypsin)：购自Invitrogen公司，-20℃保存。

(4)磷酸缓冲液(PBS)：NaCl8g，KCl0.2g，Na₂HPO₄1.15g，KH₂PO₄0.2g，溶于1L双蒸水，121℃高压消毒20min，4℃保存。

(5)MTT(AMRESCO)溶液：用PBS配成5mg/ml溶液。

(6)溶解液：每100ml去离子双蒸水含SDS10g，异丁醇5ml，浓盐酸0.1ml。

(7)对照品：泰素BristolMyersSquibbSRL.批号：0E60359。

2.2实验方法：

(1)样品及对照品制备：将样品溶解于PBS或DMSO中，得到浓度为10mg/ml的溶液。再用PBS作梯度稀释，得到浓度分别为1000μg/ml、100μg/ml、10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml、0.01μg/ml的稀释样品。对照品原液为6mg/ml，用PBS作梯度稀释，得到浓度分别为1000μg/ml、100μg/ml、10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml、0.01μg/ml的稀释样品。

(2)将稀释好的样品和对照品加入平底96孔板中，每孔10μl，每点作两个平行测试。

(3)取处于对数生长期的细胞，细胞经胰酶消化并洗涤后悬浮于含10％血清的DMEM培养基中，并调节细胞悬浮液密度至2×10⁵细胞/ml。

(4)在平底96孔板中，每孔加入90μl细胞，最后一孔加入90μl培养基，于37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养48小时。

(5)每孔中加入20μl5mg/mlMTT溶液，继续在培养箱中保温3～4小时。

(6)每孔加入100μl溶解液，继续在培养箱中保温过夜，使生成的甲臢晶体充分溶解。测定570nm光吸收值。

(7)通过软件计算样品对各肿瘤细胞的IC50。

2.3实验结果：

由上表看出：GS-B-W-1对SKOV3、SMMC-7721、A549人肿瘤细胞株没有细胞毒作用。

3)GS-B-W-1的体外免疫实验(ConA和LPS诱导的小鼠脾脏淋巴细胞增殖活性测试的研究)

3.1动物：ICR小鼠，雌雄不限。

3.2实验方法：

3.2.1试剂配置：

L-DMEM完全培养基：按常规方法配置。

MTT溶液：用PBS配成5mg/mL溶液，4℃保存，两周内有效。

ConA：用无血清L-DMEM培养基配成10ug/mL溶液，0.22um微孔滤膜过滤除菌。

LPS：用无血清L-DMEM培养基配成40ug/mL溶液，0.22um微孔滤膜过滤除菌。

3.2.2脾细胞制备：

小鼠以颈椎脱位致死，无菌取脾脏，Ficoll分离脾细胞，以L-DMEM培养液洗三次，计数，用含10％胎牛血清的L-DMEM培养液配成2×10⁶cell/mL细胞悬液。

3.2.3小鼠脾脏淋巴细胞增殖实验：

将小鼠脾细胞悬液点于96孔培养板上，每孔100uL，设一个对照组，再加入50uL的ConA或LPS(终浓度为2.5ug/mL或10ug/mL)，最后加入不同量的GS-B-W-1(终浓度为10，50，100ug/mL)，每孔培养液补足为200uL。将细胞培养板置于含有5％CO₂，37℃培养箱中培养。72h后，加入MTT溶液(5mg/mL)10uL，置于5％CO₂，37℃培养箱中继续培养4h。取出反应物，离心(2000rpm，5min)，弃上清，每孔加入150uLDMSO，充分振荡，待凝块完全溶解后在酶标测定仪上570nm读出A值。

3.3实验结果：

在体外对小鼠脾脏淋巴细胞转化的影响的测试结果见表3，表4。

表3、GS-B-W-1体外对ConA诱导小鼠脾脏T淋巴细胞增殖的影响

^*P＜0.05，^**P＜0.01，与对照组相比，^*P＜0.05，^**P＜0.01。

表4、GS-B-W-1体外对LPS诱导的小鼠脾脏B淋巴细胞增殖的影响

表3和表4结果显示GS-B-W-1在低浓度下即有显著的促进的T淋巴细胞增殖活性，而对LPS诱导小鼠脾脏B淋巴细胞增殖反应中，GS-B-W-1呈一定的量效关系；提示GS-B-W-1通过提高机体免疫能力达到抗肿瘤作用。

Claims (15)

1.紫芝液体深层发酵菌丝体均一多糖，其特征在于，所述均一多糖的含量为大于95％；所述均一多糖的分子量为3000-10000道尔顿；且所述均一多糖主要由半乳糖和葡萄糖组成。

2.根据权利要求1所述的均一多糖，其特征在于，所述均一多糖的总糖含量为大于98.5％。

3.根据权利要求1所述的均一多糖，其特征在于，所述均一多糖的分子量为7762.23道尔顿。

4.根据权利要求1所述的均一多糖，其特征在于，所述半乳糖和葡萄糖的摩尔比为1.8-2.2∶1。

5.根据权利要求4所述的均一多糖，其特征在于，所述半乳糖和葡萄糖的摩尔比为1.98∶1。

6.紫芝液体深层发酵菌丝体提取物，其包含权利要求1-5任一所述的均一多糖，所述均一多糖的含量为大于95％；且所述均一多糖的分子量为3000-10000道尔顿；且所述均一多糖主要由半乳糖和葡萄糖组成。

7.权利要求1-5任一所述的均一多糖的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：紫芝液体深层发酵茵丝体经水提醇沉得到粗多糖，粗多糖再经超滤、浓缩和柱层析得到均一多糖。

8.根据权利要求7所述的均一多糖的制备方法，其特征在于，所述超滤步骤通过截留分子量为1-5万的超滤膜进行。

9.根据权利要求8所述的均一多糖的制备方法，其特征在于，所述超滤步骤通过截留分子量为3万的超滤膜进行。

10.根据权利要求8所述的均一多糖的制备方法，其特征在于，所述超滤膜由聚酰胺、聚醚砜膜或醋酸纤维素制成。

11.根据权利要求7所述的均一多糖的制备方法，其特征在于，所述浓缩步骤通过纳滤膜进行。

12.根据权利要求11所述的均一多糖的制备方法，其特征在于，所述纳滤膜的截留分子量为150-300。

13.根据权利要求11所述的均一多糖的制备方法，其特征在于，所述纳滤膜由聚酰胺制成。

14.根据权利要求7所述的均一多糖的制备方法，其特征在于，所述柱层析步骤所用的填料为阴离子交换树脂和葡聚糖凝胶。

15.权利要求1-5任一所述的均一多糖在制备抗肿瘤药物和提高免疫力药物中的应用。