CN102812131A - 病毒细胞嗜性的识别 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种识别微RNA或其靶mRNA的体外方法，在病毒为了进入细胞而利用细胞受体和至少一种细胞共受体感染细胞的过程中，根据病毒为进入细胞所利用的细胞共受体对所述微RNA或其靶mRNA的表达进行特异性改变，所述方法包括：i）在第一病毒利用第一共受体和至少一种其他病毒利用另一种共受体分别感染后，测定表达受体、第一共受体和至少一种其他共受体的待测细胞中的微RNA的表达水平；ii）识别微RNA，相对于未感染细胞的表达水平，在感染过程中所述微RNA的表达水平受到每种病毒的调节；iii）比较由此识别的微RNA；iv）选择微RNA，其表达水平的改变对于共受体的利用是特异性的；和v）可选地识别由此选择的微RNA的靶mRNA。
Description
技术领域
本发明涉及表征病毒细胞嗜性的方法，尤其是人类免疫缺陷病毒（HIV），特别是能够利用CXCR4和CCR5受体而进入细胞的HIV病毒。
背景技术
HIV病毒进入细胞涉及几种病毒蛋白，包括包膜蛋白gp41和gp120。HIV病毒复制周期的第一步涉及病毒通过gp120蛋白与CD4细胞蛋白的相互作用与辅助T4淋巴细胞结合。此外，为了使病毒和细胞膜发生融合，HIV病毒需要与细胞共受体相互作用。体内最重要的共受体为趋化因子CXCR4和CCR5的受体。不同共受体的利用与免疫缺陷的时间依赖性变化并从而与感染有关：在感染开始时，所谓的R5病毒与CCR5共受体相互作用，并且随后在稍后阶段，某种病毒（所谓的X4病毒）利用CXCR4共受体。在此阶段，病毒群包括R5和X4病毒的混合物，或具有双R5/R4嗜性的病毒。在某些情况下，病毒R5可直接诱导AIDS的发生，然而X4病毒的出现通常与该疾病的发展有关。因此必须能够尽早检测患者中X4病毒的出现。
因此，已经开发了一定数量的方法，其目的在于测定HIV病毒的细胞嗜性。
例如，TROFILE测试（MONOGRAM）是一种由Monogram Biosciences和Pfizer提出的HIV病毒的表型测试。首先，构建含有编码患者HIV病毒包膜的区域的载体库。随后将这些载体扩增并在表达无任何包膜蛋白的HIV病毒和表达荧光素酶基因的载体中克隆该编码包膜的区域。最后，从使用这些载体中获得的重组病毒来感染表达CD4和CCR5或CXCR4的细胞。通过测量由荧光素酶产生的光发射来测定病毒感染这些细胞的能力。该测试具有几个缺点，如2007年11月由TRT-5向Afssaps（法国保健品安全署，French Agency for the Safety of Health Products）和HAS“HauteAutoritéde la Santé”发出的通知。首先，其具有非常高的成本。此外，接收结果的时间为四至五周，这并不适应于在治疗变化情况下的快速决策。此外，在该时间内，某些患者中可能发生病毒嗜性的变化。此外，不能提供HIV-2型病毒的特征测试（profile test）。
因此，需要简单、快捷、可靠且廉价的替代测试以测定HIV病毒的细胞嗜性。本发明的目的是提供这样的测试。
发明内容
本发明产生于发明人的意外发现，即，在可能感染了HIV病毒的细胞中，miRNA表达的调节取决于HIV病毒为进入细胞所利用的共受体。
因此，本发明涉及识别微RNA或其靶mRNA的体外方法，在病毒为了进入细胞而利用细胞受体和至少一种细胞共受体感染细胞的过程中，根据病毒为其进入细胞所利用的细胞共受体对所述微RNA或其靶mRNA的表达进行特异性改变，该方法包括：
i）在第一病毒利用第一共受体和至少一种其他病毒利用另一种共受体分别感染后，测定待测细胞中表达受体、第一共受体和至少一种其他共受体的微RNA的表达水平；
ii）识别该微RNA，相对于未感染细胞中的表达水平，在感染过程中所述微RNA的表达水平受到每一种病毒的调节；
iii）比较由此识别的微RNA；
iv）选择微RNA，其表达水平的改变对于共受体的利用是特异性的；
v）可选地识别由此选择的微RNA的靶mRNA。
本发明还涉及在感染病毒的患者中识别病毒所利用的细胞共受体的体外方法，所述病毒利用细胞受体和至少一种细胞共受体进入细胞，该方法包括：
i）使来自可能包含病毒的患者的样本与待测细胞接触，所述待测细胞表达病毒的细胞受体和病毒的至少一种细胞共受体；
ii）测定待测细胞中至少一种miRNA和/或miRNA的至少一种靶mRNA的表达水平；
iii）将该表达水平与预定值进行比较；
iv）由此推断病毒是否利用了待测细胞所表达的细胞共受体。
具体实施方式
术语“miRNA”或“微RNA”是指一类长度通常为20至25个核苷酸的RNA，其涉及通过降解或阻断源于某些特定基因转录的mRNA的翻译而对这些基因进行转录后调节。miRNA的“靶mRNA”是指已知或确定被所述miRNA降解或翻译被阻断的mRNA。miRNA在Griffiths-Jones（(2004)Nucleic Acids Res.32:D109-D111），Griffiths-Jones等人（(2008)Nucleic Acids Res 36:D154-D158）和miRA数据库（miRBase,http://microRNA.sanger.ac.uk）中特别描述。
本文所使用的表述“病毒”包括所有类型的病毒。尤其是，病毒可选自其变异体或品种的致病性较强或较弱的病毒的群，例如逆转录病毒，特别是HIV病毒、流感病毒、冠状病毒、麻疹病毒、疱疹病毒（包括EBV、单纯疱疹病毒和CMV病毒）、乳头瘤病毒。优选地，病毒为逆转录病毒，其选自人类逆转录病毒，尤其是HIV、HTLV-1和XMRV。更优选地，病毒为HIV，并且尤其是HIV-1和HIV-2病毒（在HIV数据库(HIV databases），http://www.hiv.lanl.gov/content/index中特别描述）。如果如本发明所述的病毒为HIV，用于实施感染的病毒可为例如原型病毒如HIV-1、NL4.3、HIV-2ROD或HIV-1NLAD8病毒或来自患者的病毒。如本发明所述的HIV病毒可利用一种或多种共受体以进入靶细胞。优选地，在如本发明所述的识别微RNA的方法中，所使用的HIV病毒仅利用单一类型的共受体进入细胞。
术语“患者”是指被病毒感染的人类。优选地，该病毒为HIV。患者有可能随后患上AIDS（获得性免疫缺陷综合征）。患者有可能在接受抗逆转录病毒治疗，例如HAART（高效抗逆转录疗疗法）治疗。
如本发明所述的术语“受体”和“细胞受体”是指细胞表面结构，其通常为涉及病毒识别靶细胞的蛋白，并且通常导致该病毒与靶细胞结合。术语“共受体”和“细胞共受体”包括除细胞受体外的所有参与病毒进入的细胞表面蛋白。
当病毒为HIV时，术语“共受体”和“细胞共受体”更具体地包括除了病毒和细胞受体CD4间相互作用以外的所有参与病毒进入的细胞表面蛋白。HIV病毒进入宿主细胞涉及细胞和病毒膜之间的融合。特别地，共受体可选自由CXCR4、CCR5、CCR3、CCR2、CCR1、CCR4、CCR8、CCR9、CXCR2、STRL33、V28、gpr1、gpr15和ChemR23组成的组。优选地，共受体为CCR5或CXCR4。
CXCR4也被称为融合素（Fusin），LESTR和NPY3R。CRCR4基因在本文中优选地表示人类CXCR4基因的序列，其mRNA序列可以为例如SEQ ID NO:1或其任意等位基因或多态变异体以及存在于其他物种中的直系同源序列（ortholog sequence）。基因CXCR4编码具有由SEQ ID NO:2表示的序列的CXCR4蛋白或其任意天然变异体。
CCR5也被称为CKR-5和CMKRB5。基因CCR5在本文中优选地表示人类CCR5基因的序列，其mRNA序列可以为例如SEQ ID NO:3或其任意等位基因或多态变异体以及存在于其他物种中的直系同源序列。CCR5基因编码具有由SEQ ID NO:4表示的序列的CCR5蛋白或其任意天然变异体。
CCR3也被称为CC-CKR-3、CKR-3和CMKBR3。CCR3基因在本文中优选地表示人类CCR3基因的序列，其mRNA序列可以为例如SEQ IDNO:5或其任意等位基因或多态变异体以及存在于其他物种中的直系同源序列。CCR3基因编码具有由SEQ ID NO:6表示的序列的CCR3蛋白或其任意天然变异体。
CCR2也被称为CCR2b和CMKBR2。CCR2基因在本文中优选地表示人类CCR2基因的序列，其mRNA序列可以为例如SEQ ID NO:7或其任意等位基因或多态变异体以及存在于其他物种中的直系同源序列。CCR2基因编码具有由SEQ ID NO:8表示的序列的CCR2蛋白或其任意天然变异体。
CCR1也被称为CKR1和CMKBR1。CCR1基因在本文中优选地表示人类CCR1基因的序列，其mRNA序列可以为例如SEQ ID NO:9或其任意等位基因或多态变异体以及存在于其他物种中的直系同源序列。CCR1基因编码具有由SEQ ID NO:10表示的序列的CCR1蛋白或其任意天然变异体。
CCR4也被称为CKR-4。CCR4基因在本文中优选地表示人类CCR4基因的序列，其mRNA序列可以为例如SEQ ID NO:11或其任意等位基因或多态变异体以及存在于其他物种中的直系同源序列。CCR4基因编码具有由SEQ ID NO:12表示的序列的CCR4蛋白或其任意天然变异体。
CCR8也被称为ChemR1、TER1和CMKBR8。CCR8基因在本文中优选地表示人类CCR8基因的序列，其mRNA序列可以为例如SEQ ID NO:13或其任意等位基因或多态变异体以及存在于其他物种中的直系同源序列。CCR8基因编码具有由SEQ ID NO:14表示的序列的CCR8蛋白或其任意天然变异体。
CCR9也被称为D6。CCR9基因在本文中优选地表示人类CCR9基因的序列，其mRNA序列可以为例如SEQ ID NO:15或其任意等位基因或多态变异体以及存在于其他物种中的直系同源序列。CCR9基因编码具有由SEQ ID NO:16表示的序列的CCR9蛋白或其任意天然变异体。
CXCR2也被称为IL-8RB。CXCR2基因在本文中优选地表示人类CXCR2基因的序列，其mRNA序列可以为例如SEQ ID NO:17或其任意等位基因或多态变异体以及存在于其他物种中的直系同源序列。CXCR2基因编码具有由SEQ ID NO:18表示的序列的CXCR2蛋白或其任意天然变异体。
STRL33也被称为Bonzo、CXCR6和TYMSTR。STRL33基因在本文中优选地表示人类STRL33基因的序列，其mRNA序列可以为例如SEQ IDNO:19或其任意等位基因或多态变异体以及存在于其他物种中的直系同源序列。STRL33基因编码具有由SEQ ID NO:20表示的序列的STRL33蛋白或其任意天然变异体。
V28也被称为CMKBRL1、CX3CR1和GPR13。V28基因在本文中优选地表示人类V28基因的序列，其mRNA序列可以为例如SEQ ID NO:21或其任意等位基因或多态变异体以及存在于其他物种中的直系同源序列。V28基因编码具有由SEQ ID NO:22表示的序列的V28蛋白或其任意天然变异体。
gpr1或GPR1基因在本文中优选地表示人类gpr1基因的序列，其mRNA序列可以为例如SEQ ID NO:23或其任意等位基因或多态变异体以及存在于其他物种中的直系同源序列。gpr1基因编码具有由SEQ ID NO:24表示的序列的gpr1蛋白或其任意天然变异体。
gpr15或GPR15也被称为BOB。gpr15基因在本文中优选地表示人类gpr15基因的序列，其mRNA序列可以为例如SEQ ID NO:25或其任意等位基因或多态变异体以及存在于其他物种中的直系同源序列。gpr15基因编码具有由SEQ ID NO:26表示的序列的gpr15蛋白或其任意天然变异体。
Apj也被称为血管紧张素受体样受体、apelin受体（APLNR）和AGTRL1。Apj基因在本文中优选地表示人类Apj基因的序列，其mRNA序列可以为例如SEQ ID NO:27或其任意等位基因或多态变异体以及存在于其他物种中的直系同源序列。Apj基因编码具有由SEQ ID NO:28表示的序列的Apj蛋白或其任意天然变异体。
ChemR23基因也被称为CMKLR1和DEZ。ChemR23基因在本文中优选地表示人类ChemR23基因的序列，其mRNA序列可以为例如SEQ IDNO:29或其任意等位基因或多态变异体以及存在于其他物种中的直系同源序列。ChemR23基因编码具有由SEQ ID NO:30表示的序列的ChemR23蛋白或其任意天然变异体。
如本发明所述，“待测细胞”是指如本发明所述可能感染了病毒的任何细胞。优选地，当病毒为HIV时，如本发明所述的待测细胞表达如上所述的HIV病毒的CD4、第一和至少一种其他共受体。优选地，如本发明所述的待测细胞表达CXCR4和CCR5。如本发明所述的待测细胞可天然表达这些受体或经过基因工程改造以表达这些受体。如本发明所述的待测细胞可以为例如树突细胞、来自淋巴系的细胞（优选T淋巴细胞）或来自髓系的细胞（优选巨噬细胞）、上皮细胞或纤维母细胞。优选地，如本发明所述的待测细胞选自包含Jurkat细胞的组（在Schneider等Int.J.Cancer(1997)19(5):621-6中特别描述），例如细胞克隆Jurkat E6-1（ATCC No.:TIB-152）、Jurkat-CCR5细胞（在Alkhatib等人(1996)Science 272:1955-1958和AIDS试剂NIBSC，UK中特别描述）。优选地，如本发明所述的待测细胞为Jurkat-CCR5细胞。
本领域技术人员熟知用于感染如本发明所述的可能感染了HIV病毒的待测细胞的技术，并在Barré-Sinoussi等人（(1983)Science 220(4599):868-71）中特别描述。
可通过本领域技术人员公知的任何技术来测量待测细胞中微RNA的表达水平或靶mRNA的表达水平。已知许多方法可量化RNA，例如基于利用RNA序列的特异性寡核苷酸的基于逆转录PCR（RT-PCR）的方法，或在严格条件下利用探针来实现这些RNA杂交、这些RNA复制或成三倍的方法。当测得靶mRNA的表达水平后，就可以实施RT-PCR或制备具有单一探针的特异性cDNA芯片来实现所有mRNA的逆转录。如本发明所述的探针优选被安置在微阵列上。本领域技术人员可容易地确定严格的条件。例如，如本发明所述的严格条件可包括在相当于浓度为500mM至2MNaCl，优选1M NaCl所诱导的离子强度存在下，在40°C至50°C，优选50°C的温度下，持续10至20小时，优选16小时的杂交步骤。其他产品也可以作为缓冲溶液加入，如Tris或MES、EDTA、吐温（Tween）和BSA（牛血清白蛋白）。
由此测得的分别感染了利用第一共受体的第一病毒和利用另一种共受体的至少一种其他病毒的待测细胞中的微RNA或其靶mRNA的表达水平可实现微RNA或其靶mRNA的识别，与未感染细胞相比，所述微RNA或其靶mRNA的表达在感染过程中受每种病毒的调节。在感染每种病毒过程中表达受到调节的微RNA及其靶mRNA的识别，可通过将使用每种病毒感染后所测得的miRNA或其靶miRNA的表达水平与未感染细胞的所述miRNA或所述靶mRNA的表达水平进行比较来实现。优选地，为了使微RNA或其靶mRNA在待测细胞感染病毒的过程中被认为具有已调节的表达，与在未感染的待测细胞中的表达相比，该表达使比率（感染细胞中所述miRNA的表达/未感染细胞中所述miRNA的表达）的log2分别升高或降低了大于0.5或小于-0.5。
随后可对感染每种病毒的过程中所识别的表达受到调节的微RNA或其靶mRNA进行比较以选择miRNA或其靶mRNA，其中病毒利用共受体对所述miRNA或其靶mRNA的表达进行特异性改变。
如本发明所述的“利用共受体的特异性表达水平的改变”是指表达的改变、升高或降低，其足以识别病毒所利用的共受体。
在如本发明所述的方法中，“未感染的待测细胞”或“未感染来自患者的病毒的细胞”是指尚未与病毒接触以及感染病毒尤其是逆转录病毒的细胞接触的细胞，其细胞共受体呈现在待测细胞上但与病毒为进入待测细胞所利用的第一共受体或至少一种其他共受体不同。例如，该病毒可为VSV型或PFV-1病毒的双嗜性包膜（amphotropic envelope）假型化的HIV病毒。
例如，如果在第一HIV病毒利用CXCR4共受体感染Jurkat-CCR5细胞（表达CXCR4和CCR5）的过程中，与未感染的Jurkat-CCR5细胞中的miRNA或其靶mRNA之一的表达相比，miRNA或其靶mRNA之一的表达升高，而在第二HIV病毒利用CCR5共受体感染Jurkat-CCR5细胞的过程中，与未感染的Jurkat-CCR5细胞中的miRNA或其靶mRNA之一的表达相比，该miRNA或其靶mRNA之一的表达未升高，那么所述miRNA或所述靶mRNA的表达升高对HIV病毒所利用的CXCR4受体就是特异性的。
本发明还涉及识别微RNA或其靶mRNA的体外方法，在病毒为进入细胞而利用受体和至少一种细胞共受体感染细胞的过程中，根据病毒为其进入细胞所利用的细胞共受体对所述微RNA或其靶mRNA的表达进行特异性改变，包括：
i）在第一病毒利用第一共受体和至少一种其他病毒利用另一种共受体分别感染后，测定表达受体、第一共受体和至少一种其他共受体的待测细胞中微RNA的表达水平；
ii）比较由此测定的微RNA的表达水平；
iii）识别微RNA，其表达水平的改变对共受体的利用具有特异性。
在病毒利用第一共受体和至少一种其他病毒利用另一种共受体分别感染待测细胞后，由此测得的微RNA或其靶mRNA的表达水平可直接进行相互比较。该比较可识别微RNA或其靶mRNA，其表达的改变对于病毒对第一共受体或至少一种其他共受体的利用具有特异性。
如本发明所述的方法也可包括其他步骤以识别由此识别的独特微RNA的靶mRNA，其表达水平的改变对于病毒为进入细胞而对共受体的利用具有特异性。miRNA的靶标可在数据库中确定，尤其是miRBase（http://microrna.sanger.ac.uk/，以及在Griffiths-Jones等(2008)Nucleic AcidsRes.36,Griffiths-Jones等(2006)Nucleic Acids Res.34,Griffiths-Jones等(2004)Nucleic Acids Research 32中特别描述）和TargetScan（http://www.targetscan.org/，并在Lewis等(2005)Cell 120:15-20,Grimson等(2007)Molecular Cell 27:91-105,Friedman等(2009)Genome Research 19:92-105中特别描述）。
短语“来自患者的可能包含HIV病毒的样本”包括来自患者的并且可能含有病毒的所有生物液体或组织，例如外周血、生殖器粘膜、淋巴组织、脑脊髓液、胎盘或人乳。样本可与待测细胞直接接触。优选地，在与宿主细胞接触之前从样本中提取病毒。例如患者的病毒可来自生物样本的原代分离物（primary isolate），并通过任何本领域技术人员已知的方法获得，例如，根据Barre-Sinoussi等（(1983)Science 220(4599):868-71）所描述的技术，可通过将HIV感染患者的淋巴细胞与尤其对HIV血清阴性供体的淋巴细胞共培养来实施HIV病毒的分离。也可以处理感染了HIV病毒的患者的外周血以从细胞中分离血浆（如在Fang等(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:12110-4中特别描述的）。
为了应用识别利用细胞受体和至少一种细胞共受体而进入患者细胞的病毒所利用的细胞共受体的方法，对至少一种miRNA和/或该miRNA的至少一种靶mRNA的表达水平进行测量。优选地，由于表达水平的改变对于病毒对共受体的利用具有特异性而识别该miRNA和/或其靶mRNA。优选地，可通过本发明所述的方法识别该miRNA和/或其靶mRNA。
特别地，如本发明所述的识别患者中病毒方法可用于识别利用CXCR4和/或CCR5的病毒。优选地，由于表达水平的改变对于HIV病毒对CXCR4和/或CCR5受体的利用具有特异性而识别该miRNA和/或其靶mRNA。优选地，通过如本发明所述的识别miRNA的方法来识别该miRNA和/或其靶mRNA。
优选地，如本发明所述的方法用于识别患者体内利用CXCR4共受体的病毒的存在或缺乏。也可对不同时刻采集的来自相同患者的样本实施数次如本发明所述的方法以识别利用CXCR4受体的病毒的出现并由此监测该患者中疾病的发展。
预定值可为单一值，如指定miRNA或指定靶mRNA的表达水平或表达水平的平均值。
例如，为识别利用指定共受体的病毒，该预定值可以是细胞中指定miRNA或指定靶mRNA的表达值，其中所述细胞表达该共受体并感染了已知可利用该共受体而进入细胞的参比病毒。例如，为识别患者体内利用CXCR4和/或CCR5的病毒，该预定值可以是在感染了利用CXCR4或CCR5而进入细胞的参比HIV病毒后在表达CXCR4或CCR5的细胞中的指定miRNA或指定靶mRNA的表达值。
所获得的表达水平与预定值之间的比较使得能够确定所研究的病毒是否利用了与参比病毒相同的共受体进入细胞。例如，如果所获得的值接近预定值，则可推断待测病毒为进入细胞而利用的共受体与参比病毒所利用的共受体相同。优选地，接近值是指相差不超过50%、40%、30%、20%或10%的值，并且更优选小于5%。
参比值也可以是例如在患者的未感染细胞（即未受病毒感染的细胞）中的给定miRNA或给定靶mRNA的表达值。优选地，事先已显示细胞在感染利用指定共受体的参比病毒后，所述miRNA或所述靶mRNA的表达与在未感染细胞中的表达相比被特异性地调节、升高或降低。与事先测定的性质相同的miRNA或靶mRNA的表达值升高或降低表明病毒利用了相同的共受体。相同性质的表达升高或降低优选是指相同符号（分别为负或正）的比率（感染细胞中所述miRNA和/或靶mRNA的表达/未感染细胞中所述miRNA和/或靶mRA的表达）的log2平均值。在如本发明所述的用于识别感染患者的病毒所利用的共受体的方法中，优选通过测定至少一种miRNA和/或miRNA的至少一种靶mRNA的表达水平相对于未感染待测细胞的至少一种miRNA和/或miRNA的至少一种靶mRNA的表达水平是否升高或降低来实施用于比较表达水平与测定值的步骤（iii）。
例如，已显示在未感染细胞中的表达受到利用共受体CXCR4的参比HIV病毒的特异性改变（升高或降低）的一种或多种微RNA或靶mRA的表达的测量值可与感染了来自患者的病毒的细胞的所述微RNA或靶mRNA的表达的测量值进行比较。在缺乏特定微RNA的预定调节的情况下，该测试会识别出CXCR4不是来自患者的HIV病毒所利用的共受体。相反，如果观察到预定调节（升高或降低），则该测试会识别出CXCR4是患者的HIV病毒所利用的共受体，应该指出，该病毒可以是具有双重嗜性的病毒，例如可利用CCR5和CXCR4的病毒。
其表达已被测定的miRNA，可选自例如由
hsa-miR-574-5p（特别是SEQ ID NO:31,ugagugugugugugugagugugu）、hsa-miR-663（特别是SEQ ID NO:32,aggcggggcgccgcgggaccgc）、hsa-miR-149*（特别是SEQ ID NO:33,agggagggacgggggcugugc）、hsa-miR-575（特别是SEQ ID NO:34,gagccaguuggacaggagc）、hsa-miR-638（特别是SEQ ID NO:35,agggaucgcgggcggguggcggccu）、hsa-miR-181b（特别是SEQ ID NO:36,aacauucauugcugucggugggu）、hsa-let-7g（特别是SEQID NO:37,ugagguaguaguuuguacaguu）、hsa-miR-30a（特别是SEQ ID NO:38,uguaaacauccucgacuggaag）、hsa-miR-148a（特别是SEQ ID NO:39,ucagugcacuacagaacuuugu）和hsa-miR-9*（特别是SEQ ID NO:40,auaaagcuagauaaccgaaagu）组成的组。优选地，表达已被测定的mi-RNA为hsa-miR-638。
表达已被测定的miRNA也可以是序列SEQ ID NO:31至SEQ IDNO:40的等位基因或多态变异体以及存在于其他物种中的直系同源序列，所述存在于其他物种中的直系同源序列来自序列SEQ ID NOS:31至40的miRNA并执行相同功能，特别是调节相同靶mRNA的表达。例如，这些miRNA可来自序列SEQ ID NO:31至SEQ ID NO:40的miRNA，并存在一个至数个核酸突变。
表达已被测定的mRNA可例如选自由SEQ ID NO:31至SEQ ID NO:40的miRNA的靶mRNA或源SEQ ID NO:31至SEQ ID NO:40的miRNA组成的组。特别地，可在上述数据库中确定靶mRNA。
例如，选自包括hsa-miR574-5p、hsa-miR-663、hsa-miR-149*、hsa-miR-575、hsa-miR-638的组中的至少一种miRNA的表达升高或选自包括hsa-miR-181b、hsa-let-7g、hsa-miR-30a、hsa-miR-148a和hsa-miR-9*的组中的至少一种微RNA的表达降低表明CXCR4为患者的HIV病毒所利用的共受体。相反，选自包括hsa-miR574-5p，hsa-miR-663、hsa-miR-149*、hsa-miR-575、hsa-miR-638的组中的至少一种miRNA的表达未升高或选自包括hsa-miR-181b、hsa-let-7g、hsa-miR-30a、hsa-miR-148a和hsa-miR-9*的组中的至少一种微RNA的表达未降低表明CXCR4不是患者的HIV病毒所利用的共受体。
附图说明
图1：响应于具有CXCR4、CCR5嗜性的原代HIV-1分离株或具有双嗜性（dual）的病毒感染而进行的hsa-miR-638的表达。Jurkat-CCR5细胞感染了4种DUAL分离株（dual1、dual2、dual3、dual4），4种CXCR4分离株（X41、X42、X43、X44）和3种CCR5分离株（R51、R52、R53）。感染后三天，溶解细胞并通过针对hsa-miR-638n的RT-qPCR对RNA进行分析。通过未感染的Jurkat R5对照细胞（NI）的表达对感染细胞中hsa-miR-638的表达进行归一化。
实施例
材料和方法
病毒和细胞系
本研究采用的病毒为均利用共受体CXCR4的原型HIV-1NL4.3和HIV-2ROD病毒，利用共受体CCR5的病毒HIV-1NLAD8和来自利用CXCR4共受体（称为X41、X42、X43和X44的3种分离株）、利用CCR5共受体（称为R51、R52和R53的3种分离株）、或可利用共受体CXCR4和CCR5（称为dual1、dual2、dual3和dual4的4种分离株)的原代分离株的病毒，以及进入时不利用CD4、不利用CXCR4、也不利用CCR5的另一种逆转录病毒PFV-1。
使用以稳定方式表达CCR5的Jurkat和Jurkat-CCR5细胞系。
感染
-感染原型病毒
为了考虑与感染多重性有关的调节，在3天内使用两个感染剂量的HIV-1NL4.3、HIV-2ROD对Jurkat和Jurkat-CCR5细胞进行感染。使用HIV-1NLAD8或PFV-1感染Jurkat-CCR5细胞3天。
-感染来自原代分离株的病毒
在3天内使用病毒X41、X42、X43和X44、R51、R52、R53、dual1、dual2、dual3或dual4感染Jurkat-CCR5细胞。未感染的Jurkat-CCR5细胞用作对照（NI）。
微RNA表达的分析
-通过微RNA芯片进行分析
使用原型病毒感染三天后，提取RNA并通过微RNA芯片进行分析（LC Sciences或Affymetrix）。
-使用RT-PCR对hsa-miR-638的表达进行分析
使用来自原代分离株的病毒感染三天后，将细胞溶解并通过RT-qPCR对hsa-miR-368的表达进行分析。相对于未感染的Jurkat-CCR5对照细胞（NI）中hsa-miR-368的表达，将感染细胞中hsa-miR-368的表达进行归一化。
结果
实施例1：微RNA的识别
研究了利用共受体CXCR4的原型病毒HIV-1NL4.3和HIV-2ROD所诱导的微RNA表达的调节。为了限制个体间的差异并在相同的遗传背景下（可比较的微RNA序列）进行，在感染Jurkat细胞系和感染表达CCR5的Jurkat（细胞）系的过程中对这些调节进行研究。感染三天后，提取Jurkat细胞的RNA并使用微RNA芯片进行分析。表1示出了受到HIV-1NL4.3和HIV-2ROD调节的微RNA亚群。
表1.在1和100TCID50下，使用HIV-1NL4.3和HIV-2ROD感染Jurkat细胞和Jurkat-CCR5细胞的过程中可诱导细胞微RNA序列的显著调节（p<0.01）。
使用HIV-1NLAD8（具有R5嗜性，表2）和不利用CD4、不利用CXCR4、也不利用CCR5而进入的对照逆转录病毒PFV-1感染Jurkat-CCR5细胞也会导致微RNA表达的调节。
表2.在感染HIV-1NLAD8的过程中可诱导细胞微RNA序列的显著调节（p<0.01）。
通过比较这些表，可看出九种微RNA的表达在感染过程中系统性降低，而与HIV及其嗜性无关（表3）。这些微RNA的表达未受到PFV-1感染的影响。
表3.在感染NL4.3、ROD和NLAD8的过程中可诱导细胞微RNA序列的显著调节（p<0.01）。
此外，在感染NL4.3或ROD的过程中5种微RNA的表达升高，但在感染NLAD8的过程中未升高。最后，在感染NL4.3或ROD的过程中4种微RNA的表达特异性降低，但在感染NLAD8的过程中未降低。（表4）感染NL4.3或ROD过程中表达特异性升高或降低的微RNA在感染PFV-1的过程中未受影响。
表4.在感染NL4.3和ROD的过程中可特异性诱导细胞微RNA序列的显著调节（p<0.01）（升高：微RNA的表达在感染过程中升高，降低：微RNA的表达在感染过程中降低）。
这些结果说明通过病毒进入而诱导的细胞微RNA序列调节的重要性。这些分析也显示了利用本发明所述的方法基于细胞微RNA序列的改变来区分HIV对特定类型共受体（在本文中为CXCR4或CCR5）的利用的可能性。
实施例2：
为了验证由此获得的结果，使用病毒感染Jurkat-CCR5细胞（表达受体CXCR4和受体CCR5），所述病毒来自利用共受体CXCR4（X41、X42、X43和X44），利用共受体CCR5（R51、R52和R53）或可利用两种共受体CXCR4和CCR5（dual1、dual2、dual3和dual4）的原代分离株。
3天后测量感染或未感染（NI，对照）细胞中hsa-miR-638的表达。如预期并如图1所示，hsa-miR-638的表达在未感染细胞中未发生改变。在感染了仅利用CCR5作为共受体进入细胞的病毒（R51、R52和R53）的细胞中，该表达无统计学改变（图1）。另一方面，在感染了能够利用CXCR4共受体进入细胞的病毒（X41、X42、X43、X44、dual1、dual2、dual3和dual4）的细胞中，该表达显著升高（图1）。
这些结果表明仅涉及CXCR4共受体的感染诱导了hsa-miR-638表达的升高。
因此这些结果证实了实施例1中所获得的数据，如果必要，还可证明受感染细胞中该微RNA的表达水平使得能够确定病毒为感染该细胞所利用的共受体，从而能够识别该病毒嗜性。
Claims (16)
1.一种用于识别微RNA或其靶mRNA的体外方法，在病毒为了进入细胞而利用细胞受体和至少一种细胞共受体感染所述细胞的过程中，根据病毒为了进入细胞所利用的细胞共受体对所述微RNA或其靶mRNA的表达进行特异性改变，所述方法包括：
i）在第一病毒利用第一共受体和至少一种其他病毒利用另一种共受体分别感染后，测定表达受体、第一共受体和至少一种其他共受体的待测细胞中的微RNA的表达水平；
ii）识别所述微RNA，相对于未感染细胞中的表达水平，在感染过程中所述微RNA的表达水平受到每种病毒的调节；
iii）比较由此识别的微RNA；
iv）选择微RNA，其表达水平的改变对于共受体的利用是特异性的；
v）可选地识别由此选择的微RNA的靶mRNA。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述待测细胞表达第一共受体和第二共受体，并且感染了为进入所述细胞而利用所述第一共受体的第一病毒和利用所述第二共受体的第二病毒。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述病毒为逆转录病毒。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，所述病毒为HIV病毒。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述HIV病毒之一所利用的所述共受体选自由CXCR4、CCR5、CCR3、CCR2、CCR1、CCR4、CCR8、CCR9、CXCR2、STRL33、V28、gpr1、gpr15和ChemR23组成的组。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，第一HIV病毒所利用的共受体为CXCR4，而第二HIV病毒所利用的共受体为CCR5。
7.根据权利要求4至6中任一项所述的方法，其中，所述待测细胞为Jurkat-CCR5细胞。
8.一种用于识别感染病毒的患者中的病毒所利用的细胞共受体的体外方法，所述病毒利用细胞受体和至少一种细胞共受体进入细胞，所述方法包括：
i）使可能包含病毒的患者样本与待测细胞接触，所述待测细胞表达所述病毒的细胞受体和所述病毒的至少一种细胞共受体；
ii）测定所述待测细胞中至少一种miRNA和/或miRNA的至少一种靶mRNA的表达水平；
iii）将所述表达水平与预定值进行比较；
iv）由此推断所述病毒是否利用了由待测细胞表达的细胞共受体。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述预定值为未感染的待测细胞中的miRNA或mRNA的表达水平。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其中，所述病毒为HIV病毒，并且其中所述待测细胞表达细胞受体CD4。
11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述待测细胞表达细胞共受体，所述细胞共受体选自由CXCR4、CCR5、CCR3、CCR2、CCR1、CCR4、CCR8、CCR9、CXCR2、STRL33、V28、gpr1、gpr15和ChemR23组成的组。
12.根据权利要求10所述的方法，其中，所述待测细胞表达CXCR4。
13.根据权利要求10至12中任一项所述的方法，其中，所述微RNA选自由hsa-miR574-5p、hsa-miR-663、hsa-miR-149*、hsa-miR-575、hsa-miR-638、hsa-miR-181b、hsa-let-7g、hsa-miR-30a、hsa-miR-148a和hsa-miR-9*组成的组。
14.根据权利要求13所述的方法，其中，选自包括hsa-miR574-5p、hsa-miR-663、hsa-miR-149*、hsa-miR-575、hsa-miR-638的组中的至少一种微RNA的表达升高或选自包括hsa-miR-181b、hsa-let-7g、hsa-miR-30a、hsa-miR-148a和hsa-miR-9*的组中的至少一种微RNA的表达降低表明CXCR4是HIV病毒所利用的共受体。
15.根据权利要求8至14中任一项所述的方法，其中，通过RT-PCR或借助于微芯片来测量微RNA的表达水平或mRNA的量。
16.根据权利要求10至15中任一项所述的方法，其中，所述待测细胞选自由Jurkat细胞和Jurkat-CCR5细胞组成的组。
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