CN102802770A

CN102802770A - 仿生膜及其用途

Info

Publication number: CN102802770A
Application number: CN201080032811XA
Authority: CN
Inventors: 彼得·霍姆·延森; 杰斯珀·森诺高·汉森; 托马斯·维辛; 马克·爱德华·佩里; 克劳斯·赫利克斯·尼尔森
Original assignee: Aquaporin AS
Current assignee: Broadcom membrane material (Beijing) Co., Ltd.
Priority date: 2009-06-19
Filing date: 2010-06-18
Publication date: 2012-11-28
Anticipated expiration: 2030-06-18
Also published as: WO2010146366A1; DK200900758A; CN102802770B; KR20120050970A; DK177144B1; AU2010261557B2; JP2012529984A; JP5690821B2; EP2442894B1; DK2442894T3; CA2765768A1; US20120080377A1; EP2442894A1; US20130277307A1; BRPI1011801A2; IL216936A0; US20150360183A1; WO2010146365A1; SG176832A1; WO2010146365A8

Abstract

公开了液膜系统，其形式为含有生物通道的整体液膜(bulk liquid membrane，BLM)、含有生物通道的乳液液膜(emulsion liquid membrane，ELM)和含有生物通道的支撑(固定化)液膜(supported liquid membrane，SLM)，或其组合，其中所述液膜系统是基于由形成双分子层的两亲化合物(如脂质)所形成的囊泡，其中已经掺入了生物通道，并且其中所述囊泡还包含稳定性油相。所述膜系统的用途包括通过正渗透从液体水介质中提取水，例如用于盐水的脱盐。

Description

仿生膜及其用途

发明领域

本发明涉及适合于水提取的液膜系统(liquid membrane system)的用途，更特别涉及具有生物通道(如蛋白质通道)的液膜系统，所述生物通道掺入到两亲性囊泡(vesicle)双分子层中，用于从含水介质中提取水和/或小的溶质。更特别地，所述液膜系统是水通道蛋白(aquaporin)液膜，其由两亲性分子囊泡状分散系中的水通道蛋白组成，特别用于从含水液体介质中提取纯水，例如在正渗透应用中。此外，本发明涉及用于测量膜蛋白环境亲水性的荧光测定，其中所述测定是基于使用环境敏感性荧光探针进行了荧光标记的膜蛋白。

发明背景

如US 4360448(A)中所公开，液膜分离方法已经用于从水溶液中去除溶解的物质，如离子。这涉及从水溶液中去除溶解物质的方法，其包括使所述水溶液与乳液接触，所述乳液包含外相(exterior phase)和内相(interior phase)，所述外相的特征在于与所述水溶液不混溶，但对所溶解的物质仍然具有可渗透性，所述内相含有反应物，如离子交换化合物，其能够将所溶解的物质转换成不可渗透形式。溶解的物质透过外相，进入内相，在本文它们转换成不可渗透形式，并因此留在所述乳液的内相中。将耗尽所述溶解物质的水溶液与所述乳液分开，并将乳液循环再利用。然而，当水溶液或介质中(如生物液体中)存在多种或不明的离子或溶质时，通过该方法或类似方法去除溶质变得越来越复杂，因为必须为每一种待去除的物质设计特定的反应物。在(WO 87/002380)Production of Low-Ethanol Beverages by Membrane Extraction中描述了液膜提取方法用途的另一实例，其涉及设计用于从酒和其他饮料中选择性去除乙醇而同时保留水和许多其他有机组分的膜提取系统。因此，至今已经发展了用于从例如含水液体中选择性去除溶质的液膜分离方法。由于意识到需要从含水液体来源中选择性去除或提取水，本发明人已经设计了适合于使用了解自水通道蛋白的选择性水通道从含水液体中去除或提取纯水的液膜方法。

基于荧光的活性测定对于可溶性蛋白质而言是十分成熟的，但对膜蛋白而言却不是这样。对此可能的原因是当从其天然环境(生物膜)中取出时这些膜蛋白十分脆弱。此外，市售蛋白质种类的可用性仅限定于少数膜蛋白。这与大量(克规模)表达和纯化膜蛋白的困难有关。膜蛋白通常在重建到充分模拟该蛋白质天然环境的仿生膜中后保留其功能。目前没有得到满足的需求是对脂膜组分筛选其在产生满足膜蛋白需要(即特定的亲水和疏水区或层)的仿生膜制剂中的可用性。同时，这种测定提供了关于膜蛋白折叠状态的有用信息。

发明概述

宽泛地说，本发明涉及液膜系统，其形式为含有生物通道的整体液膜(bulk liquid membrane，BLM)、含有生物通道的乳液液膜(emulsionliquid membrane，ELM)和含有生物通道的支撑(固定化)液膜(supported liquid membrane，SLM)，或其组合，其中所述液膜系统是基于形成双分子层(其中已掺入了生物通道)的两亲化合物(如脂质)所形成的囊泡，并且其中所述囊泡还包含稳定性油相(stabilizing oilphase)。在一个优选的实施方案中，所述液膜系统是含有水通道蛋白的液膜系统，如含水通道蛋白的整体液膜(BLM)、含水通道蛋白的乳液液膜(ELM)和含水通道蛋白的支撑(固定化)液膜(SLM)，和/或其组合，其中所述液膜系统在两亲分子的分散系中包含生物通道，如水通道蛋白水通道。所述液膜系统可用于一系列应用中，包括通过正渗透从液体含水介质中提取水，例如用于盐水的脱盐。

因此，第一方面，本发明提供液膜系统，其形式为含生物通道的整体液膜(BLM)、含生物通道的乳液液膜(ELM)和含生物通道的支撑(固定化)液膜(SLM)，或其组合，其中所述液膜系统包含由一种或多种两亲化合物形成的囊泡，所述两亲化合物形成其中已掺入有生物通道的双分子层，其中所述囊泡还包含稳定性油相。

在另一方面，本发明提供从含水液体中提取水的方法，其包括以下步骤：

a)将一定量的前述权利要求中任一项所述液膜系统混合到第一含水液体中，以形成悬浮液，所述第一含水液体的渗透压低于囊泡，

b)只要存在渗透压梯度，允许所述悬液中的囊泡从所述第一液体中吸收纯水并膨胀，

c)从第一液体中分离已膨胀囊泡，和

d)将来自步骤c)的所述囊泡重悬于第二含水液体中，所述第二含水液体的渗透压超过已膨胀囊泡的压力，从而只要存在渗透压梯度则允许囊泡中所提取的水流入所述第二液体并稀释所述第二液体，使得囊泡处于非膨胀状态。

在另一方面，本发明提供用于从含水液体介质中提取纯水的装置，其包含一种或多种本文所述液膜。

在另一方面，本发明提供无溶剂的巨型蛋白质囊泡(giant proteinvesicle)，其基本由水分散系中的油、两亲性脂质和跨膜蛋白通道组成，其中所述脂质与蛋白质的摩尔比为约1∶50到约1∶400。

在另一方面，本发明提供包含本文所述巨型蛋白质囊泡的组合物。

在另一方面，本发明提供制备巨型蛋白质囊泡的方法，所述巨型蛋白质囊泡基本由水分散系中的油、两亲性脂质和跨膜蛋白通道组成，其中所述脂质与蛋白质的摩尔比为约1∶50到约1∶400，所述方法包括以下步骤：

a)从干燥的脂质溶液制备脂质体，所述干燥的脂质溶液已经在含有去污剂的缓冲液中进行了再水化并通过约100nm到约500nm孔径的滤器挤出，

b)将来自a)的脂质体与跨膜蛋白溶液混合，其中所述蛋白任选地与荧光标记连接，

c)使用约10kDa的分子量截留将来自b)的混合物透析过夜，

d)分离步骤c)中形成的脂蛋白体囊泡，例如通过离心分离，

e)任选地获得所形成GPV的与所用荧光标记相容的吸收谱，以验证跨膜蛋白正确插入到囊泡膜中，和

f)将步骤d)中获得的脂蛋白体在油相溶液(其含有与步骤a)中相同的脂质)中的脂质混合，例如以约1∶3v/v到约1∶12v/v的摩尔比混合，由此导致由所述脂蛋白体形成GPV。

在任一具体情况中，在本文公开的方法的一般框架中，本领域技术人员能够根据所制备巨型蛋白质囊泡样品的大小和所用试剂的特性来选择适当的具体条件。

例如，步骤c)中使用的条件利用约1到约10mL/分钟(更优选约1到约5mL/分钟，最优选约3mL/分钟)的透析液流。

例如，步骤d)中的分离利用离心，例如约10,000-20,000rpm(例如14,200rpm)离心约1-5分钟(例如约90秒)。

例如，步骤f)中的混合利用在约4℃翻滚旋转过夜。

在另一方面，本发明提供制备巨型蛋白质囊泡的方法，所述巨型蛋白质囊泡基本由水分散系中的油、两亲性脂质和跨膜蛋白通道组成，其中所述脂质与蛋白质的摩尔比为约1∶50到约1∶400，所述方法包括在翻滚混和后由所述两亲性脂质、跨膜蛋白通道和油的含水混合物进行囊泡的自组装。

在另一方面，本发明提供根据本文所述方法制备的巨型蛋白质囊泡用于通过正渗透提取水的用途。

在另一方面，本发明提供根据本文所述方法制备的巨型蛋白质囊泡用于从血透析过程中所损失的患者血浆中重新提取纯水的用途。

在另一方面，本发明提供具有开放或闭合夹层结构的支撑液膜，其中基本平的多孔过滤材料在脂蛋白体层的一侧或两侧提供支撑，由此固定所述层。

在另一方面，本发明提供复合滤膜或滤盘，其通过将含水通道蛋白的脂蛋白体或巨型蛋白质囊泡的层置于过滤材料之间来产生，所述过滤材料选自超滤膜、纳滤膜和微滤膜。

在另一方面，本发明提供微乳液形式的液膜系统，其包含具有膜结合或掺入的生物通道或蛋白通道(如油相中的水通道蛋白水通道)的脂质囊泡，并且其适于从液体含水介质中提取水。

在另一方面，本发明提供制备所述微乳液的方法。所述液膜系统还可以容纳或固定在接触器模块中或基本平的多孔夹层结构中。

在另一方面，本发明提供用于测定膜蛋白环境的亲水性的测定，其中所述测定是基于使用环境敏感性探针进行了荧光标记的膜蛋白，当所述探针所附着的蛋白质重建到仿生膜(如脂双分子层膜或相应的两亲膜)中时，可以测定所述探针的荧光。

在另一方面，本发明提供用于确定成膜脂质与膜蛋白的特定组合是否能够形成所述膜蛋白在其中正确折叠的仿生膜的方法，所述方法包括：

(a)向成膜脂质混合物中引入用荧光标记进行了标记的膜蛋白，其中所述荧光标记的荧光特性取决于蛋白质与脂质之组合所形成的仿生膜中该膜蛋白的环境；

(b)检测来自用荧光标记进行了标记的膜蛋白的荧光信号；和

(c)由所述荧光信号确定所述脂质与膜蛋白的组合的膜是否能形成蛋白质正确折叠的仿生膜。

在另一方面，本发明提供确定膜蛋白是否能够在仿生膜中正确折叠的方法，所述方法包括：

(a)将用荧光标记进行了标记的膜蛋白引入用于测定所述膜蛋白是否能够在仿生膜中正确折叠的系统，其中所述荧光标记的荧光特性取决于该仿生膜中所述膜蛋白的环境；

(b)检测来自用荧光标记进行了标记的膜蛋白的荧光信号；和

(c)由所述荧光信号确定所述膜蛋白是否在仿生膜中正确折叠。

在另一方面，本发明提供仿生膜，其用于测定形成该仿生膜的膜蛋白的活性和/或功能，其中所述膜蛋白包含荧光标记，所述荧光标记的荧光特性取决于仿生膜中膜蛋白的环境，其中可通过检测来自所述荧光标记的荧光信号来测定所述膜蛋白的活性或功能。

在另一方面，本发明提供包含本文所述仿生膜的传感器。

现在通过举例而非限制的方式，参考所附图和实施例来描述本发明的实施方案。

附图简述

图1显示了三种类型液膜的一般原理：整体液膜(BLM)、乳液液膜(ELM)和支撑液膜(SLM)。

图2显示了液膜模块中的中空纤维和螺旋状创伤分隔模块。

图3显示了双模块中空纤维支撑液膜的原理图。

图4显示了使用本发明囊泡浓缩水溶液的装置和方法的原理图。

图5显示了提供营养饮料的方法的原理图，所述营养饮料包含通过正渗透得到的纯饮用水。

图6显示了在均一电解质超滤后正渗透中使用本发明囊泡的原理图。这是从任何水溶液或液体中提取水的完整应用的一个实例。

图7显示了在用于产生渗透压的压力延缓渗透中使用本发明囊泡的原理图。

图8显示了液膜制剂和脂蛋白体微乳液(液膜)的浓缩之间的关系。

图9是说明计算的基本参数的图。

图10是正渗透批量室单元的概略图。

图11是用于正渗透的过滤杯的图。

图12是显示抽取液(draw solution)和原料液(feed solution)之间重量摩尔渗透压浓度差异随时间变化的图。

图13是在其膜中掺入了SoPIP2；1蛋白的DOPC囊泡的液膜制剂的显微镜图片，显示了200μm的比例尺用于比较。

图14是重建到巨型蛋白质囊泡中的以荧光团badan^TM标记的水通道蛋白SoPIP2；1的荧光图。

图15是显示SoPIP2；1GPV制剂的正渗透流QA的图。

图16与图15列出的结构相同，显示的是非水通道蛋白/空制剂。

图17显示了附着有四个badan^TM标记的AqpZ四聚体的二级结构。

图18显示了badan-SoPIP2；1和badan-AqpZ的荧光光谱。

图19显示了荧光光谱作为波长之函数的归一化强度。

图20显示了重建到两种不同脂质囊泡中的两种不同水通道蛋白的GP比值。

图21显示了概略图，其显示了本发明液膜所模拟的正常肾的盐梯度和逆流。

发明详述

本文所述含水通道蛋白的液膜系统可以是含水通道蛋白的乳液液膜(ELM)的形式，其中所述液膜包含两亲分子分散相中的水通道蛋白，优选包含脂蛋白体形式的囊泡，其具有掺入到两亲性囊泡双分子层(如脂双分子层等)中的功能性水通道蛋白。

本发明含水通道蛋白的乳液液膜(或Aqp-ELM)可用于水提取，其如下实现：将其混合到或悬浮于第一含水液体中，所述第一含水液体的渗透压低于所述Aqp-ELM囊泡，这会使纯水从所述第一液体通过水通道蛋白选择性地转运到膨胀过程中的囊泡中。从第一液体中提取纯水后，可以分离囊泡(例如可通过离心分离)，并将其重悬于第二含水液体中，所述第二含水液体的渗透压大于含有所提取纯水的囊泡的压力。所提取的水现在将从收缩过程中的囊泡中流入第二液体中，只要存在渗透压梯度。第二含水液体应优选可与成品(纯化的)水分离，低毒或无毒，并且可化学插入到液膜中。第二含水液体(抽取液)的实例是葡萄糖和果糖的混合物，其已经用于海水脱盐，并且最近已经获得了这样的抽取液，其基于以特定比例将氨和二氧化碳气体组合在可热去除铵盐的高浓缩抽取液中，参考J.O.Kessler，和CD.Moody，Drinking water fromsea water by forward osmosis，Desalination 18(1976)297-306；J.R.McCutcheon，R.L.McGinnis，和M.Elimelech，Desalination by a novelammonia-carbon dioxide forward osmosis process：influence of drawand feed solution concentrations on process performance.J.Membr.Sci.278278(2006)114-123)，以及Method and apparatus for producingpotable water from seawater using forward osmosis By Kirts，RichardEugene。或者，可通过加热到接近60℃从稀释的抽取液中容易地分离水，以产生淡水、氨和二氧化碳。然后氨和二氧化碳可再用作抽取液的溶质，参考Low(2009)。

U.S.Pat.Appl.Publ.(2009)、US 2009308727A120091217公开了淡化海水的方法和装置，其使用碳酸氢铵正渗透脱盐法。海水通过膜装置的一侧泵送，而抽取液通过膜装置的另一侧泵送。抽取液从海水中抽取水分子通过膜进入抽取液，并且抽取液分离器接收加热的抽取液，其然后分解成氨、CO₂和水。将引用水与氨和CO₂气体分开。然后，氨气和CO₂气体与一部分饮用水流再结合，以重新形成碳酸氢铵抽取液。本发明的一个实施方案涉及本发明液膜系统在US 2009308727A1中公开的方法和装置中的用途。在本发明的另一实施方案中，含水通道蛋白的液膜系统用于从血液透析所得透析液中重新提取水。本发明的液膜系统在改进血液透析方法中具有至少两种有用的应用：

i)生产本文描述的超纯水可替换用于目前必需的水纯化的十分精密的系统，这是目前恢复患者血浆中的水含量所必需的，

ii)产生透析液时使用的正渗透过程后，同时去除了来自患者血浆的大量水，这可使用本文描述的任何方法中的水通道蛋白液膜来提取。

本文所述含水通道蛋白的囊泡(Aqp-ELM)能够反复膨胀和收缩。通常，囊泡在其与第一含水液体接触之前预收缩，所述第一含水液体具有低于囊泡内部的渗透压，并且期望从中提取水。从所述第一含水液体中分离膨胀的囊泡后，可以将吸收的水提取到抽取液中，所述抽取液具有高于膨胀囊泡内部的渗透压。已经显示，含短杆菌肽A通道的DOPC囊泡的的体积可通过水转运膨胀多达约16％，参考M.Goulian等，Biophysical Journal，第74卷，January 1998，第328-337页。也已经显示，凝胶填充的DOPC囊泡的体积可收缩原始体积的约80％，参考A.Viallat等Biophysical Journal，86卷，April 2004，第2179-2187页。在本发明的一个方面中，含水通道蛋白的囊泡是无溶剂制备的巨型蛋白质囊泡(GPV)形式。本文第一次公开了GPV及制备它们的方法。本发明的GPV的特征在于使用油稳定，而不是溶剂。此外，本发明GPV的制备可不使用电转化。另外，可以在真正的囊泡形成之前，以mol/mol分数，即通过荧光光谱术(其中信号强度与蛋白质含量正相关)精确地测定蛋白质含量。

直径约20nm的小型单层磷脂酰胆碱(small unilamellarphosphatidylcholine，SUV)囊泡对渗透压敏感。这种囊泡通过根据所应用的盐梯度而膨胀或收缩来响应于渗透压。这对于低于或高于其晶液态转换温度(crystal-to-liquid transition temperature)的蛋磷脂酰胆碱和二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱的小型单层囊泡而言都是正确的。在渗透梯度存在下，因存在水通道蛋白，H₂O的流入和流出与离子的移动解偶联。在渗透诱导的SUV收缩和膨胀的过程中，磷脂双分子层的完整性维持在囊泡不破的程度上，因此外部介质和囊泡腔之间不会出现平衡，除非膜含有水通道蛋白。

第一含水液体或来源相的典型渗透压为约100mOsm到约500mOsm或1000mOsm，而第二含水液体或接收相的典型渗透压为100到1000mOsm更高，以获得合适的渗透压力差。海水的重量摩尔渗透压浓度(osmolality)为2000-2400mOsm，主要是由于氯化钠。这是血浆正常重量摩尔渗透压浓度的8倍，后者为每千克约275-299毫渗摩尔。我们的肾能产生的最浓的尿为1400mOsm，远低于海水的水平。

此外，本发明涉及液膜系统，其为例如乳液液膜(ELM)的形式，其中所述液膜包含脂质囊泡，其在具有生物通道的分散系中含有膜整合的两亲性分子，优选为囊泡分散系的形式(例如脂蛋白体形式)，其具有掺入到两亲性囊泡双分子层中(如脂双分子层，两亲嵌段共聚物即式AB-BA、ABA或ABC，或杂合两亲膜，如基于PEG缀合的两亲物的脂质体(例如聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺缀合物(PEG-PE)))中的生物通道(例如水通道蛋白)。除了水通道蛋白以外，所述生物通道包含氮化硼纳米管、碳纳米管和两亲性孔形成分子和跨膜通道分子，其选自跨膜蛋白，如β-桶孔，如α-溶血素和OmpG、FomA、VDAC；跨膜肽孔(丙甲菌素、缬氨霉素、短杆菌肽A)，包括合成肽、离子通道，如Boon，M.和Smith，BD；2002(″Synthetic membrane transporters″.CurrentOpinion in Chemical Biology 2002，6：749-756)所概述，和离子选择性离子载体(ionophore)，如钠选择性ETH 157、钾选择性SQI-Pr和缬氨霉素、氯化物离子载体三辛基氯化锡等。

通过在富集的油相中产生脂质囊泡(或GPV颗粒)来稳定本发明的脂蛋白体。这种做法的一种方式是将囊泡外的水更换成其他溶剂。为了提供不扰乱GPV双分子层或干扰GPV双分子层倾向降低的溶剂环境，可将包含油相的非极性溶剂更换成显示更高程度亲水性的化合物，或可选择分子大小更大的非极性溶剂。也优选低毒性的化合物。已知天然油脂化合物形成显示物理稳定性和无毒的相对稳定的脂质乳液。这些油脂包括鲨烯、角鲨烷、α-生育酚、类何帕烷、异戊二烯(例如，酯化多萜醇)、泛醌(Q10)、霍霍巴油(jojoba oil)、轻矿物油、亚麻子油、大豆油、磷脂稳定的鲨烯或大豆油(或大豆油、磷脂质和甘油的乳液，intralipid^TM)等。此外，高级烷烃，如癸烷、十一烷(undedane)、十二烷等可用于油相中，众所周知的是，这些油脂化合物仅可忽略不计的程度透过脂双分子层。鲨烯也是碳氢化合物溶剂的实例，由此可使黑色脂膜变成“无溶剂”[White S.，Biophys.J.，23卷，1978]。本发明中优选降低通常用于脂质囊泡乳液中的有机溶剂的含量，以获得少溶剂的或甚至无溶剂的囊泡组合物。

在另一方面，本发明还涉及荧光测定，例如使用萘衍生物荧光分子(例如荧光团6-溴乙酰基-2-二甲基氨基萘(badan^TM))作为探针，其可共价附着到蛋白质的Cys残基上。所述探针对其所接触的分子环境的亲水性敏感，产生450nm到550nm范围内的最大荧光发射。当badan探针被疏水暴露时，其产生最大荧光发射量，在450nm处。相反，当badan探针被亲水暴露时(例如水)，其具有低荧光发射量，在约550nm处具有发射最大值。上文所述之间的亲水/疏水条件产生了badan荧光性质的上述特征之间的发射最大值和荧光量。下文表1是有用荧光探针的列表。

缩写：	化学名：
		Badan	6-溴乙酰基-2-二甲基氨基萘
Acrylodan	6-丙烯酰基-2-二甲基氨基萘
		Laurdan	6-十二烷酰-2-二甲基氨基萘
Prodan	6-丙酰基-2-二甲基氨基萘

1，5-IAEDANS	5-((((2-碘乙酰基)氨基)乙基)氨基)萘-1-磺酸
		IAANS	2-(4′-(碘乙酰胺)苯胺基)萘-6-磺酸
MIANS	2-(4′-马来酰亚胺基苯胺基)萘-6-磺酸，钠盐

本测定提供可用于对两亲仿生膜中膜蛋白的分配(从而对膜蛋白的折叠状态)进行测定和/或成像的信息。通过该测定获得的信息类型取决于目的膜蛋白的特定膜结合类型和荧光探针在蛋白质上的位置。本发明的一个示例性实施方案是使用badan^TM在水通道蛋白分子上进行荧光标记，其中通过光谱术或显微镜成像来测量蛋白质成功重建到仿生膜中的程度。

该测定特别可用于蛋白质重建过程的优化，和/或仿生膜配方(磷脂和其他整体膜组分，如胆固醇等)的选择，以适应于各膜蛋白(如水通道蛋白)的特殊需要。

此外，所述方法可用于产生基于荧光标记的膜蛋白感受器，以及产生测定膜蛋白的亲水性/疏水性接触的测定法。本发明还提供产生用于测定蛋白活性的基于荧光的膜蛋白感受器的新方法。

定义

术语液-液提取用于使用液膜进行的分离方法。在本发明中是液-水提取，因为是将水提取到液膜中。

使用液膜时，通用术语“水提取”在本文与通用术语“水分离”一起使用。

本文使用术语“囊泡”和同义词“脂质体”来指代两亲化合物(如磷脂)的近球形液体结构。当蛋白质掺入到囊泡中时，该术语与术语“脂蛋白体”互换使用，所述脂蛋白体具有掺入的两亲蛋白质，例如跨膜蛋白，包括水通道蛋白。脂质体可形成为多种大小的单层或多层结构，其中一层是一个两亲性双分子层。因此，几种类型的囊泡或脂质体均包括在本发明之内：MLV(multilamellar vesicle，多层囊泡)、SUV(SmallUnilamellar Vesicle，小型单层囊泡)和LUV(Large Unilamellar vesicle，大型单层囊泡)或GUV(Giant Unilamellar Vesicle，巨型单层囊泡)。两亲分子(如磷脂)可作为双分子层或单分子层自组装成很小的球体，比正常细胞更小。双分子层结构是囊泡或脂质体。单分子层结构称为胶束。在本发明的上下文中，术语“脂蛋白体”不旨在指通常用于药物递送目的的主要由用于包装蛋白质的球形脂质结构组成的脂质体。本发明的囊泡以的特征在于具有适于插入和整合跨膜蛋白的两亲性膜。优选地，跨膜蛋白在整合到囊泡膜中时保留其天然的三维构象，因此所述蛋白质保留其功能性。本发明囊泡的一种特别常见的形式是相对均一大小的“巨型蛋白质囊泡”或GPV，其直径为约20到25μm到约400到约500μm到高达约1000μm，典型平均直径为约100到约250μm。

用于形成本发明的GPV的囊泡优选是合适的脂质混合物的均一大小的单层囊泡，通常通过径迹蚀刻(track-etched))聚碳酸酯滤器挤出制成，参考″Vesicles of variable sizes produced by a rapid extrusionprocedure″，L.D.Mayer，M.J.Hope和P.R.Cullis，Biochimica etBiophysica Acta 858(1986)161-168，″Effect of Extrusion Pressure andLipid Properties on the Size and Polydispersity of Lipid Vesicles″，D.G.Hunter和B.J.Frisken，Biophysical Journal 74(6)1986，2996-3002，″Osmotic properties of large unilamellar vesicles prepared byextrusion.″B L Mui，P R Cullis，E A Evans，和T D Madden，Biophysical Journal 64(2)1993，443-453。挤出滤器的优选孔径是0.200微米，产生约0.15+-0.06μm的囊泡。这不排除使用更小或更大孔径的滤器。也有用于囊泡或脂质体制备的其他方法，例如通过醚蒸发方法，参考D.Deamerand A.D.Bangham，Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-Biomembranes 443卷，Issue 3，7September 1976，第629-634页，并且已经描述了几种方法用于制备超声放射产生的直径约250埃的小型单层囊泡(Szoka，F.& Papahadjopoulos，D.(1980)Annu.Rev.Biophys.Bioeng.9，467-508)；通过凝胶过滤或透析从去污剂/磷脂胶束的水分散系中可控地去除去污剂，例如胆汁盐或Triton X-100；向水中注入乙醇或其他溶剂中的磷脂溶液，并通过蒸发去除有机溶剂；通过弗氏细胞压碎器使用高压将未超声的水磷脂分散系挤出。然而，本文第一次显示，可以不使用电铸(electroformation)而制备巨型蛋白质囊泡。

如本文所用，术语“脂质”优选涵盖两亲性脂质，例如磷脂、磷酸甘油酯、鞘脂和心磷脂，及其混合物，例如磷脂，如1，2-二棕榈酰-sn-磷脂酰胆碱(DPPC)，或磷脂的混合物。在本文通过援引并入的WO2006/122566中的表1中列出了有用的脂质。

如本文所用，术语“生物通道”将表示任何横跨膜的通道或孔，如可掺入到两亲囊泡双分子层中用于从含水液体介质中提取水和/或小溶质的蛋白质通道。所述术语还包括形成孔的膜内涵体，如功能性蛋白质通道，例如水通道蛋白，其掺入到两亲囊泡双分子层中，如脂双分子层，由两亲嵌段共聚物自组装成的双分子层，例如式AB-BA、ABA或ABC，或杂合两亲膜，如基于PEG缀合的两亲物的脂质体(例如，聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺缀合物(PEG-PE))等。该术语还包含显示支持水转运(例如以单列水分子转运)的纳米管，即某些氮化硼纳米管和碳纳米管。该术语还包括其他两亲性孔形成分子，包括跨膜通道分子，其选自跨膜蛋白，例如β-桶孔，如α-溶血素和OmpG、FomA、VDAC，跨膜肽孔(丙甲菌素、缬氨霉素、短杆菌肽A)，离子通道，如钾通道或钠通道等。

如本文所用，术语“水通道蛋白”应该表示任何有功能的水通道，如WO/2006/122566″Membrane for filtering of water″以及Tamir Gonen和Thomas WaIz，Quarterly Reviews of Biophysics(2006)，39：4：361-396，Cambridge University Press中描述的跨膜蛋白。本文所用优选的水通道蛋白选自Aqp 4、Aqp 1、Aqp Z、SoPIP2；1以及单体、二聚体、四聚体和更多聚体的寡聚物，及其功能性变体，包括突变、缀合和截短形式的一级序列。

术语“含水液体”和“水液体介质”在本文中用于包括水溶液；天然水源；生物来源的液体，如果汁和蔬菜汁、血、乳和尿；废水源；含水的混悬液、分散液、乳液等。

如本文所用，术语“渗透压”应该表示渗透水流从含水液体中经过半透性膜进入含更高浓度水溶质的区室的过程中所产生的压力。潜在渗透压(potential osmotic pressure)是当通过选择性透过膜从蒸馏水中分离时可在溶液中产生的最大渗透压。如范托夫方程描述，通过在单位体积溶质中溶质“颗粒”的数量来测定潜在渗透压。

术语“正渗透”(forward osmosis，FO)表示这样的过程，其中半透性膜两侧的渗透压差是运输水通过膜的驱动力。FO过程导致原料流的浓缩和高度浓缩流(称为抽取液)稀释，参考Cath等，Journal of MembraneScience，281(2006)70-87。

术语“第一含水液体”对应于“原料”液或来源相。

术语“第二含水液体”对应于“抽取”液或接收相，也称为提馏溶液(stripping solution)。

本文所述液膜所用的术语“标准形式因子”表示用于液膜提取设施的现代工业设备和装置标准。

如本文所用，术语“液膜接触器”将表示为允许相之间通过水通道蛋白整体液膜以进行质量转移为目的而彼此接触的设备或组合物。本文所用的接触器的实例包括双模块中空纤维模块、多束中空纤维接触器，如Liqui-Cel^TM接触器、中空纤维pertractor和两室接触器系统，参考http://sschi.chtf.stuba.sk/MembraneLab/Equipment.htm。

并未所涉及的术语“正确折叠”指膜结合蛋白(如跨膜蛋白等)的二级和三级结构。正确折叠的蛋白质根据其是α-螺旋，β-桶还是混合的膜蛋白而折叠成其天然的二级结构，并且多亚基蛋白(如四聚体水通道蛋白)的亚基折叠在一起形成三级结构，前提是满足所需要的环境条件，例如极性、水合作用、亲水性、疏水性或两亲特性。正确折叠对这些的蛋白质的功能和活性是必需的。

聚体实施方案

使用本发明水通道蛋白液膜对于从盐原料液(如海水)的脱盐中生产淡水尤其有利，其中水通道蛋白水通道的特异性纯水运输和氯化物排斥特性提供了独特的方法条件。本发明的一个有意义的实施方案是在产生淡水的正渗透过程中使用水通道蛋白液膜(例如，乳液液膜、支撑乳液液膜或整体液膜)，其中盐水是原料液，而含CO₂/NH₃的水溶液是抽取液，其具有通过加热至约58℃而容易地去除所溶解的气体的优点，参考McGinnis和Elimelech，Desalination，207(2007)370-382；和QuirinSchiermeier，″Purification with a pinch of salt″，Nature，452，20March2008。

在下表中说明了水通道蛋白脂蛋白体形式的本发明液膜的实例：

表2.两种不同囊泡直径而言每升ELM/BLM的膜表面积

表3.两种不同囊泡直径而言每升ELM/BLM的组分

下文详细解释的图1至19说明了本发明：

图1显示了三种类型液膜的一般原理：整体液膜(BLM)、乳液液膜(ELM)、支撑液膜(SLM)。在水通道蛋白液膜的情况下，载体由嵌入两亲囊泡双分子层(如磷脂双分子层等)中的水通道蛋白水通道组成。对于所有三种液膜类型，来源相和接收相均是水溶液，其中接收相比来源相具有更高的渗透梯度。

图2显示了液膜模块中的中空纤维和螺旋状创伤分离模块。对于两种模块，构建块(build up)均作为来源相与接收相之间的接触器起作用。来源相和接收相均是水溶液，其中所述接收相具有比来源相更高的渗透梯度。

图3显示了以整体液膜作为载体的双模块中空纤维支撑液膜的原理图。在水通道蛋白整体液膜是载体的情况下，水通道蛋白整体液膜会通过水通道蛋白水通道从来源相中提取水，进入接收相。来源相和接收相均是水溶液，其中所述接收相具有比来源相更高的渗透梯度。

图4显示了使用本发明的囊泡浓缩水溶液的装置和方法的原理图。在水通道蛋白乳液液膜是载体的情况下，水通道乳液液膜将从待浓缩的溶液中提取水，进入水通道乳液液膜，从而产生浓缩的溶液。

图5显示了使用水通道蛋白乳液液膜作为载体系统通过正渗透提供包含纯引用水的营养饮料的方法的原理图。作为实例，水通道蛋白乳液液膜将从尿液中将水提取到水通道蛋白乳液液膜中。将水通道蛋白乳液液膜和浓缩的尿液进行相分离，然后水通道乳液液膜会与具有更高渗透梯度的接收水溶液混和。然后水从水通道蛋白乳液液膜中被提取到接收溶液中，并将水通道蛋白乳液液膜和接收溶液进行相分离，产生水从尿液转移到另一溶液中的最终结果，在该实例中所述另一溶液是葡萄糖和蛋白质的溶液。

图6显示了在正渗透中使用本发明的囊泡然后对均一电解质进行超滤或除去溶解气体的原理图。这是从任何水溶液或液体中提取水的完整应用的一个实例。作为实例，水通道蛋白乳液液膜从废水溶液中将水提取到水通道蛋白乳液液膜中。将水通道蛋白乳液液膜和浓缩的废水溶液进行相分离，然后将水通道蛋白乳液液膜与具有更高渗透梯度的接收水溶液混和。然后将水从水通道蛋白乳液液膜中提取到接收溶液中，并将水通道蛋白乳液液膜和接收溶液进行相分离，产生水从废水溶液转移到另一溶液中的最终结果，在该实例中所述另一溶液是另一电解质的溶液或溶解气体的溶液。

图7显示在压力延缓渗透(pressure retarded osmosis)中使用本发明的囊泡产生渗透压的原理图。实例显示了双模块中空纤维支撑液膜的原理，其中以整体液膜作为载体整合到压力延缓渗透系统中用于产生渗透压。在水通道蛋白整体液膜是载体的情况下，水通道蛋白整体液膜会通过水通道蛋白整体液膜中的水通道蛋白水通道将水从来源相中提取到接收相中。压力延缓渗透中来源相的实例是半咸水/淡水，接收相是海水或甚至海水的卤水。从半咸水中将水提取到海水中使得能够产生通过压力梯度驱动的涡轮收集的渗透压。

图9.在正渗透单元小室的该图示中，K_原料(t)用于原料液的实测电导率，K_抽取(t)用于抽取液的实测电导率，ΔV_Q(K_渗透)用于所测量原料流的体积。宽箭头表示流经液膜空间的方向。

以下公式可用于测量流量并计算穿过正渗透批量单元小室的截留率(rejection rate)。

流：Q(t)≈ΔV(t)，其中ΔV(t)从移液管中读取

流量计算为：

其中A是液膜接触面积流量作为渗透压的函数：

用于各个移动溶质分子的溶液的渗透压计算：

∏＝cRT[Quantities，Units and Symbols in Physical Chemistry，2.11章，国际纯粹及应用化学联合会，1993]

c：个体移动溶质的摩尔浓度

G：气体常数，0.08206L·atm·mol^-1·K^-1

T：绝对温度

对于偏离理想状况的溶液，上式变成：

其中是渗透系数。对于25摄氏度的0.15M蔗糖溶液，

[Sten-Knudsen，′Stoftransport，membranpotentialer og elektriske impulserover biologiske membraner′Akademisk Forlag 1995]。可从用于特定溶液的渗透压测定来测定

实例

室温22摄氏度下0.2M山梨醇(D-山梨醇)的渗透压(bar)：

摩尔·L^-1·0.08206L·atm·摩尔^-1·K^-1·295K·1,01325bar·atm^-1＝9.9bar

此处假定

盐截留，参考图9：

通过使用含有完全离子化的强电解质的抽取液和原料液，本文将电导率K用作简单的浓度度量。抽取液电导率的提高反映了稀释到抽取体积(V₀是初始抽取体积)中的渗透体积中渗透离子的量(Q(t))：

量R(‘盐截留’)可定义为：

结果：

在使用根据实施例1制备的AQP液膜的实验中，在其中使用20barD-山梨醇抽取液的正渗透批量单元小室中获得了以下盐截留值(表4)：

t(分钟)	R
		3	1.00
7	1.00
		33	0.93

图10显示了本发明用途的应用，其中通过正渗透从原料液中提取水通过复合滤膜或滤盘进入抽取液中，所述复合滤膜或滤盘通过将脂蛋白体分子层夹在选定的过滤材料(如在表3中列出的那些)之间来产生。在图10中，正渗透设置由两部分(上部和下部)组成，其可装配在含液膜溶液(8-具有水通道蛋白的囊泡)的中央部分周围，所述液膜溶液通过注入通道(6)注入两滤膜(4)之间。通过间隔物/膜固定器(2)来限定膜之间的体积。与O-环(7)连接的钳夹系统(1)和螺丝保证紧密配合，并因此确保密封系统。它还含有原料液区室(3)和抽取液区室(9)，两者均可配有搅拌装置(未显示)。可通过水平测量管(5)进入区室。

外罩单元的装配：

1/将磁力搅拌棒置于抽取液区室(9)中。

2/将两个滤器/滤膜(4)置于膜固定器/间隔物部分(2)的‘阳台’的每一侧。将两个O-环(7)放置在每一侧每一滤器的外部，密封液膜区室(8)。将该膜夹层放置在抽取液区室部分上，并将原料区室置于上方。夹住并紧固整个单元。

3/使用水平测量管将抽取区室装满合适的液体。向液膜区室中注入液膜样品。用合适的液体装满原料区室。

将图10中显示的外罩单元用于透过水通道蛋白液膜的正渗透过程的实例。

在装配的单元中，两个Alfa Laval纳滤膜Alfa Laval-NF(代码517819)用作液膜区室的支撑物。对于抽取液，使用0.8M山梨醇(D-山梨醇，85529Sigma BioUltra)。样品体积是300μL的液膜乳液，如实施例6实验部分中所述。磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液，Sigma P-5368(0.138M NaCI，0.0027M KCI，0.01M磷酸二氢钾和磷酸氢二钾和磷酸钠)用作原料。

实验开始时间是在搅拌下添加原料液时。可见的是水柱在测量管中的位置。通过测量管，在一定时间点插入探针，以测量抽取液或原料液的电导率(Microelectrodes Inc.MI-900Conductivity electrode，ThermoScientific Orion 3-Star Conductivity meter)。测量抽取柱随时间的升高，并由此正确地以每单位面积的量和每单位时间单位面积的量来计算流速和流量。在水柱上升的同时测量原料液和抽取液的电导率。

本发明的支撑液膜液也可以采用开放或闭合夹层结构的形式，其中基本平的多孔过滤材料在脂蛋白体层的一侧或两侧提供支撑，因此固定所述层。在下文表5中列出了过滤材料的实例。

表5.滤膜类型、制造商和孔选择性的说明

缩写列表：

MF：微滤，NF：纳滤，UF：超滤，RO：反渗透，RC：再生纤维素，-as：不对称的，-s：对称的

除了本文图所阐明的本发明的具体实施方案外，本发明的液膜系统可用于生物传感器应用中，用于检测具有生物通道调节效果(如抑制和激活)的化合物和用于药物筛选。一个实例是在固定的脂蛋白体制剂中掺入功能性钾通道，并在化合物文库中对通道的抑制或阻断进行筛选。Judge SI和Bever CT已经显示了鉴定用于治疗多发性硬化的药物的这种原则，参照参考文献部分。

实施例部分

实施例1.制备水通道-BLM/ELM：脂蛋白体

制备脂蛋白体

根据Maria Karlsson等(FEBS Letters 537(2003)68-72)描述的方法获得纯化的SoPIP2；1，并通过在磷酸盐缓冲液(PBS)10mM，NaCI150mM，pH 7.5中以200的脂质/蛋白质摩尔比(lipid-to-protein molarratio，LPR)与用1％OG(去污剂，辛基葡糖苷)增溶的DOPC(1，2-二油酰磷脂酰胆碱)脂囊泡(10mg/ml)混和而重建到囊泡中。混合物在室温下在Float-A-LyzeróG2透析盒(Spectrum Laboratories Inc.CA，USA)中以8-10.000Da的截留分子量以磷酸盐缓冲的盐水缓冲液透析2天，每天更换两次缓冲液(样品体积：透析缓冲液体积最小为1∶1000)。以相同方式制备不含蛋白质的对照囊泡。

制备整体液膜

在不混和的情况下，以1∶5的脂蛋白体∶脂质悬液比例向如上所述制备的SoPIP2；1脂蛋白体中温和地加入脂质悬液，所述脂质悬液由溶解在鲨烯中的DOPC组成。将其置于4℃，翻转过夜。所得整体液膜乳液可直接使用，或可通过在14.000rpm下离心10分钟然后使用所得三相溶液(上相：脂质/鲨烯，中间相：蛋白质/脂质/鲨烯，下相：磷酸盐缓冲盐溶液)的中间相来进行浓缩。在4℃储存待用。在图8中阐明了该实施例的原理。

实施例2.制备用于无溶剂的水通道蛋白BLM的脂质混合物

材料和化学试剂

磷脂(DOPC)、甘油酯(单油酰基甘油酯)、鲨烯、亚麻酸(两者均储存在+5℃)、戊烷、标记的磷脂(例如，Texas

DHPE，SigmaAldrich)。

设备

真空干燥器，标准实验设备，吸水流。

所需要的实验室工作时间

1小时+过夜储存

用于脂质混合物/溶液的制备步骤，其中脂质/脂肪酸/鲨烯的比例是1/6/35

1)在N₂下从氯仿储存液中干燥10mg脂质，置于真空下30分钟

2)加入200μL鲨烯

3)加入20μL亚麻酸(使用Hamilton和通过隔膜的移液器)

4)温和混匀，优选在N₂流下进行

5)加入300μL戊烷，混匀，或者5)如果使用脂质标记，那么使用标记的脂质的氯仿相(通常大约50μL)，以混和三组分相。如下继续进行，去除氯仿。

6a)在N₂流下蒸发戊烷，然后在真空下直至戊烷蒸发干净

6b)在乙醇和干冰中冻融样品5次

7)在抽吸泵下使乳液脱气

8)顶部是N₂气，盖上盖子和封口膜并进行标注

9)储存于-80℃过夜。

本文制备的无溶剂和少溶剂的脂质混合物尤其适合于掺入两亲性跨膜蛋白，如水通道蛋白。可将实施例1的脂蛋白体制剂加入到实施例1中提及的方法所制备的少溶剂脂质混合物中。

实施例1和2的BLM制剂可用于以下应用中。分离图8中显示的BLM乳液相后，这可存放在过滤单元中，如

过滤设备中，小心地完全盖上过滤盘，任选地使用过量的体积。该过滤设备现在可以用于从水介质中提取纯水，只要利用所放置的水通道BLM在过滤盘两侧建立了渗透压差或梯度。图8显示了质膜制剂与如实验部分(例如实施例1)中所述制备的脂蛋白体微乳液(液膜)之间的关系。基本上通过连续阶段形成液膜：从脂质中蒸发掉氯仿，将所述脂质重溶在缓冲液(PBS)+1％OG(去污剂)中，并使用例如LIPEX桶挤出机等，将该脂质溶液通过200nm聚碳酸酯滤器挤出高达约20次，以获得直径约200nm的均一囊泡。蛋白质SoPIP2；1与经挤出的囊泡在缓冲液(PBS)+1％OG中混和至期望的脂质/蛋白质摩尔比(LPR)，用PBS缓冲液透析≥48小时。

实施例3.使用鲨烯作为稳定剂或油相并使用DOPC作为两亲性脂质来制备水通道蛋白脂蛋白体和对照油/水乳液。

材料和化学试剂

脂蛋白体样品和大单层脂质(LUV)样品(使用与脂蛋白体制剂中相同的脂质)。

鲨烯(最小98％纯度，Sigma-Aldrich S3626)。

磷脂，如氯仿中的DOPC或干粉(Avanti Polar Lipids Inc.)；对照乳液使用与脂蛋白体制剂中相同的脂质。荧光脂质探针：2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-(7-硝基-2-1，3-苯并

二唑-4-基(NBD-PE)，(Avanti Polar Lipids Inc.)

特殊设备

Mini LabRoller(Labnet).1.5mL微型管，无菌。

所需的实验室工作时间

20分钟的工作量以及约60分钟+过夜的额外温育时间；使得总样品制备时间为大约18小时。。

制备脂质体(LUV)

1.将20ml的PBS与0.26g OG混和至浓度为1.3％。

2.在10ml PBS/OG中，加入100mg豆脂(asolectin)至10mg/ml的浓度。

3.充分搅拌。

4.使用脂质挤出机挤出11次。

制备脂蛋白体

1.从挤出的脂质体的量和收到的储存液中蛋白质的浓度开始，加入蛋白质以实现脂蛋白体中期望的蛋白质浓度

2.透析至少20小时。

制备鲨烯油相原料

用10mg/mL磷脂和荧光标记的脂质制备2mL鲨烯

1.在8ml玻璃管中称量20mg豆脂。

2.加入50μL氯仿中的DPhPE/TR(0.33mg/ml)和50μL纯氯仿。

3.保持30分钟，以再水化并溶解。

4.加入2mL鲨烯并剧烈振荡10分钟。

5.将样品置于N₂气流下(30-45分钟)。

6.将样品置于干燥器中，真空1小时。

7.密封并储存样品于4℃待用。

制备油相(鲨烯)原料

用10mg/mL磷脂和荧光标记的脂质制备2mL鲨烯

1.在6ml玻璃管中加入氯仿中2mL 10mg/mL磷脂。

2.在N₂气流下蒸发溶剂(30-45分钟)，以获得脂质膜，或者

3.当使用磷脂干粉时，向20mg磷脂中加入50μL氯仿，以获得2mL的液态磷脂。

4.向来自2的脂膜(保证脂膜是溶解的)或来自3的液态脂质中加入100μL的1mg/mL NBD-PE(氯仿)。

5.加入2mL鲨烯(Sigma-Aldrich)-温和混和

6.将样品置于N₂气流下(30-45分钟)，然后置于真空干燥器中

7.使N₂气轻柔地流过样品，然后加上盖子、封口膜并储存在-80℃。

制备油/水SoPIP2；1或FomA脂蛋白体乳液

-体积比：3∶1的脂蛋白体∶鲨烯(＝25％体积/体积o/w.)

-在使用前使原料在室温下热平衡。

1.在1.5mL微型管中加入：

-200μL鲨烯-脂质原料(油相原料)

-如实施例1中所述制备的600μL脂蛋白体原料

2.将样品置于Mini LabRoller中，并在冰箱中使样品滚动过夜(上层，约T＝8-10℃)

制备油/水对照脂蛋白体乳液

-与上文相同，使用LUV原料代替脂蛋白体原料

3.使用后，利用N₂气流对脂质体和鲨烯-脂质原料充气。脂质体原料必须在冰箱中保存于5-10℃下，鲨烯-脂原料储存在-80℃冰箱中。

-鲨烯-脂质油相原料将能够用于10次乳液制备

-用于一组乳液的材料：1.2mg水通道蛋白(SoPIP2；1)或FomA、40mg磷脂、400μL鲨烯。

实施例4.使用鲨烯作为稳定剂或油相并使用豆脂作为两亲性脂质无溶剂地制备AQP油/水脂蛋白体乳液。本实施例提供了制备脂蛋白体(或GPV)乳液的替代方法。

材料和化学试剂

鲨烯(Pan Asian Marketing Co.Ltd)

磷脂：来自Fluka(#11145)的大豆的豆脂

荧光脂质探针：DPhPE/TR(Avanti Polar Lipids Inc.)

设备(除了标准的实验室设备以外)

Mini LabRoller^TM(Labnet)

圆底试管

LIPEX^TM挤出机(Northern Lipids Inc.)

所需要的实验室工作时间

白天1∶2.5小时制备时间+实验室滚动过夜，共约19.5小时。

制备脂质体

1.将20ml的PBS与0.26g OG混和至1.3％的浓度。

2.在10ml PBS/OG中，加入100mg豆脂至10mg/ml的浓度。

3.充分搅拌，以产生脂质体。

4.将脂质体挤出11次，以产生单分散的脂质体分散相。

5.步骤4的替代方案：排除步骤4，直接使用脂质体而不进行挤出。

制备脂蛋白体

1.从挤出的脂质体的量和收到的储存液中蛋白质的浓度开始，加入蛋白质，以实现脂蛋白体中期望的蛋白质浓度

2.透析至少20小时。

制备鲨烯油相原料

用10mg/mL磷脂和荧光标记的脂质制备2mL鲨烯

1.在8ml玻璃管中称出20mg豆脂。

2.加入50μL氯仿中的DPhPE/TR(0.33mg/ml)和50μL纯氯仿。

3.保持30分钟以再水化并溶解。

4.加入2mL鲨烯，并剧烈振荡10分钟。

5.将样品置于N₂气流下(30-45分钟)。

6.将样品置于干燥器中，真空1小时。

7.加盖并储存样品于4℃待用。

制备油/水AQP脂蛋白体乳液

-体积比：3∶1的脂蛋白体∶鲨烯

-在使用前使原料在室温下热平衡。

1.在8mL玻璃瓶(圆底)中加入：

-600μl鲨烯-脂质原料(油相原料)

-1800μl脂蛋白体原料

2.将样品置于Mini LabRoller中，并在黑暗中滚动样品过夜

3.第二天，在显微镜下观察进行质量监控

实施例5.应用如上制备的BLM

本发明的BLM制剂可适当地掺入到设计用于浓度抽取液-液质量转移的中空纤维模块中，例如Manuel Aguilar & Jose Luis Cortina″Solvent Extraction and Liquid Membranes″，CRC Press，2008中4.21部分中描述的和图4.1(b)中显示的Liquid-Cel extra-flow 10x28接触器，所述参考文献的内容以援引方式并入本文。本发明的液膜乳液可掺入到微孔性中空纤维膜中，并且使用盐水作为原料液、适当浓缩的抽取液，可从盐水原料中提取纯水或脱盐水。

实施例6.制备单层脂质体和SoPIP2；1脂蛋白体

如下进行脂质体的蛋白质重建：通过氮气从20mg脂质中蒸发氯仿，然后在玻璃干燥器中真空干燥2小时，随后在含有1％OG的2mLPBS，pH 7.4中再水化成脂质浓度10mg/ml的流体。使用LIPEX桶挤出机(Northern Lipids Inc.，Burnaby，BC，Canada)将流体通过200nm聚碳酸酯滤器挤出21次，以产生脂质体。

从瑞典Lund University生物化学系的Per Kjellbom和UrbanJohansson教授处获得了菠菜水通道SoPIP2；1蛋白，并根据Tornroth-Horsefield等2006(Susanna Tornroth-Horsefield等2006.Structuralmechanism of plant aquaporin gating，439卷，Nature，第688-694页)进行表达和纯化。

从新加坡南洋科技大学生物科学学院结构与计算生物学处助理教授Jaume Torres处获得了来自大肠杆菌(E.Coli)的细菌水通道蛋白-Z。在大肠杆菌菌株BL21(DE3)细菌培养物中过量表达了功能性的水通道蛋白-Z，其表达为具有烟草蚀纹病毒切割位点的His标签蛋白质。融合蛋白具有264个氨基酸和27234Da的分子量。来自大肠杆菌DH5α的基因组DNA用作扩增AqpZ基因的来源。使用添加了烟草蚀纹病毒切割位点(TEV)(AqpZ N端的ENLYFQSN)的基因特异引物扩增AqpZ基因。用酶NdeI和BamHI消化扩增的AqpZ，然后将其连接到同样消化的6-His标签表达pET28b载体DNA中。通过PCR筛选验证阳性克隆。然后通过DNA测序证实构建体的正确性。

大肠杆菌菌株BL21(DE3)用于表达蛋白质。将含有50μg/ml卡那霉素的Luria液体培养物在37℃下温育13-16小时，稀释100倍到新鲜LB培养液中，并繁殖到约1.2-1.5的密度(600nm处的OD)。在35℃下加入1mM IPTG 3小时诱导重组蛋白的表达，然后离心。

在0.4mg/ml溶菌酶、50单位的Bensonase和3％正辛基β-D-吡喃葡糖苷存在下，将收集的细胞重悬浮在冰冷的结合缓冲液(20mMTris pH 8.0，50mM NaCl，2mM β-巯基乙醇，10％甘油)中。将样品在微流化器中在12,000Pa下进行5次裂解循环。通过40,000×g离心30分钟沉淀不溶物质。使上清液经过Q琼脂糖快速流动柱(AmershamPharmacia)，并收集流出液。用NaCl将流出液补足至300mM，然后上样到预平衡的Ni-NTA柱上。用100倍柱体积的洗涤缓冲液(20mMTris pH 8.0，300mM NaCl，25mM咪唑，2mM β-巯基乙醇，10％甘油)洗涤柱，以去除非特异性结合的物质。用5倍柱床体积的洗脱缓冲液(20mM Tris pH 8.0，300mM NaCl，300mM咪唑，2mM β-巯基乙醇，10％甘油，含有30mM正辛基β-D-吡喃葡糖苷)洗脱与Ni-NTA琼脂糖结合的物质。进一步利用阴离子交换层析；monoQ柱(GE healthcare)纯化AqpZ。在上样到MonoQ柱上之前，使用Amicon浓缩器，膜截留10,000Da来稀释和浓缩混和样品，使盐和咪唑浓度达到约10mM。阴离子交换层析过程中使用的缓冲液是(A)20mM Tris pH 8.0，30mM OG，10％甘油和(B)20mM Tris pH 8.0，1M NaCl，30mM OG，10％甘油。将从离子交换柱上洗脱的含有AqpZ的峰级分合并。将纯化的AqpZ保存在-80℃。

菠菜SoPIP2；1和大肠杆菌Aqp-Z水通道蛋白的荧光标记

用badan^TM标记水通道蛋白跨膜蛋白(菠菜水通道蛋白SoPIP2；1或大肠杆菌AqpZ)。在微光下进行badan^TM衍生蛋白质的合成和处理。为了进行反应，向SoPIP2；1中加入来自20mM badan^TM储存液(溶解在二甲基甲酰胺中)的10倍摩尔过量的badan^TM，得到10mg/ml蛋白质溶液。使反应在4℃滚动旋转下进行20小时。在聚丙烯酰胺凝胶Econo-Pac 10DG脱盐柱(Bio-Rad)上使反应混合物脱盐，对于SoPIP2；1，使用PBS，1％OG，1％甘油，pH 7.4，而对于Aqp-Z，使用20mM Tris，30mM OG，pH8。所得荧光标记的水通道蛋白储存在4℃待用。

通过将蛋白质混合物与脂质体以200的脂质/蛋白质摩尔比(LPR)混合对badan^TM标记的SoPIP2；1或AqpZ进行重建。通过UV/Vis吸收光谱测定蛋白质浓度，对于SoPIP2；1，使用280nm处46660M^-1 cm^-1的消光系数，对于AqpZ，使用36370M^-1 cm^-1的消光系数。使用10,000道尔顿的分子量截留和3ml/分钟的透析液流量，在动态微量透析仪透析设备(Spectrum Laboratories Europe，Breda，The Netherlands)中将混合的蛋白质和脂质体溶液透析24小时。以相同的方式制备对照囊泡，但不含蛋白质。所得的脂蛋白体或脂质体储存在4℃待用。

制备巨型蛋白质囊泡

通过将单层脂蛋白体与溶剂溶液或者油相和脂质混和来形成巨型蛋白质囊泡(GPV)，所述油相由含有与所用脂蛋白体中所用脂质匹配之脂质的溶液中的癸烷或鲨烯(10mg/ml)组成，例如当DOPC是用于脂蛋白体的脂质时，那么在溶液中使用DOPC。为了形成GPV，向将溶剂或油相和脂质溶液轻柔地加入脂蛋白体中至1∶3v/v的比例，并且在4℃下滚动旋转混和所述溶剂或油相和脂质或脂蛋白体溶液，导致从小单层脂蛋白体形成GPV，参考图13和14。所形成的GPV与不含TM蛋白的并行形成的脂质囊泡(对照囊泡)相比是稳定的，并且具有约25μm到约400μm的直径。观察到的是，对照囊泡极难制备，并且特征在于没有结构且不稳定。

在制备AqpZ脂蛋白体和巨型蛋白质囊泡中使用相同的方案，其中优选使用脂质(如DPhPC)，而非DOPC。

badan^TM-水通道蛋白的荧光光谱术和显微术

使用Varian Cary Eclipse荧光分光计(Varian Inc.，Palo Alto，CA，USA)，以380nm的λ_ex(激发波长)和400到700nm记录的发射来进行荧光光谱术。

badan^TM标记的水通道蛋白SoPIP2；1和AqpZ的荧光发射特性对荧光探针badan的局部环境中的极性敏感。如果探针周围的局部环境变得更疏水或亲水，则badan^TM的荧光最大发射量分别发生蓝移或红移。饱和量的SDS引起最大发射量的红移。可比较badan^TM标记的水通道蛋白的迁移和未迁移的荧光强度峰的一般极化(generalized polarization，GP)值，来定量发射谱的改变。通过以下计算GP值：GP＝I_b-I_b/I_g+I_g，其中I_b和I_g分别对应于发射谱蓝边界和绿边界处的强度。

使用Varian Cary Eclipse荧光分光计(Varian Inc.，Palo Alto，CA，USA)，以400nm的λ_ex(激发波长)和425到700nm记录的发射进行荧光光谱术。从对应于带通滤波器量程的发射光谱计算I_b和I_g，所述带通滤波器应用于荧光共聚焦显微镜成像。

在共聚焦显微镜(model LSM 510META；Carl ZeissMicroimaging)上以双通道设置同时获得分别覆盖420-480和505-550nm荧光发射范围的GP图像。

使用Urbana-Champaign的University of Illinois的荧光动力学实验室开发的Globals软件包分析荧光数据，以获得GP图像和相关的GP柱状图(每个像素的GP值的分布)(Beechem，J.M.；Gratton，E.InTime-Resolved Laser Spectroscopy in Biochemistry，Proc.of SPIE；Lakowicz，J.编辑，1988；909卷，第70-81页)。

水通道蛋白SoPIP2；1的GP比值在PBS中测定为+0.4，而当暴露于100mM SDS时测定为-0.4。

另一方面，水通道蛋白AqpZ的GP比值在PBS中测定为+0.0，而当暴露于100mM SDS时测定为-0.3，参考图20。

SDS使荧光探针变得更为亲水暴露(从PBS中转换到100mMSDS中)，这是在荧光发射波长中观察到转移(因此也观察到GP比值改变)的原因。我们将此解释为，与重建后正确折叠的蛋白质相关联的GP比值对于SoPIP2；1和AqpZ而言分别为约+0.4或+0.0。相反，与重建后未折叠/不正确的蛋白质相关联的GP比值对于SoPIP2；1和AqpZ而言分别为约-0.4或-0.3。宽柱状图之间或宽柱状图的GP比值表明了非均质重建的蛋白质(正确折叠的和不正确折叠的蛋白质的混合物)，参考图18、19和20。

实施例7.制备稳定化的GPV样品

在利用10mg/mL磷脂(与脂蛋白体制备中的组分相同，参考实施例1)和荧光标记的脂质制备2mL油相时，使用以下步骤：

1.在4mL玻璃管中加入2mL磷脂DOPC(1，2-二油酰磷脂酰胆碱)10mg/mL磷脂(氯仿)(Avant Polar Lipids Inc.)

2.在N₂气流下使脂质膜干燥(45分钟)

3.加入100μL氯仿(其中溶解有1mg/mL 2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-(7-硝基-2-1，3-苯并

二唑-4-基(NBD-PE)，(Avanti PolarLipids Inc.)(任选地进行标记))，并溶解脂质膜

4.加入2mL鲨烯(S3626，Sigma-Aldrich)-温和混匀

5.将样品置于N₂气流下(45分钟)，然后在干燥器中，真空30分钟。

6.在液氮中使用乙醇(96％等级)冻融5次。

7.将样品置于室温下，并使N₂气轻柔地流过。

8.所制备的样品直接使用，或储存：加上盖、封口膜，并储存在-80℃。

在使用脂蛋白体和鲨烯制剂以3∶1的脂蛋白体∶鲨烯体积比将油相的水包油分散剂制备到脂蛋白体水相中并形成稳定的GPV样品时，使用以下步骤：

1.在使用前，使a/中制备的脂蛋白体(根据实施例1制备的)和鲨烯在室温下热平衡。

2.在4mL圆底微型管中加入：

-400μL制备的鲨烯样品

-1800μL制备的脂蛋白体

3.应用温和的N₂气流

4.用alu-箔和实验室薄膜(Parafilm)包裹样品。将样品瓶置于MiniLabRoller^TM Rotator(LabNet International)或类似的仪器中，并在通风橱或冰箱中以至少10℃滚动样品过夜。

收集稳定化的GPV样品

5.进一步使用前使来自4的样品平衡30分钟。

样品在视觉上显示为3相：上相是鲨烯的有机相，下层水相，以及扩散的第三中间相，其体积高达1200μl，富集有经稳定化的GPV颗粒。

6.取出中间相，例如使用注射器或分离漏斗，并用作相关水提取或透析单元中的液膜。

图14显示了根据制造商的方案用荧光团6-溴乙酰基-2-二甲基氨基萘(Molecular Probes，Inc.制备的badan^TM，29851Willow Creek Road，Eugene，OR 97402-9132，USA)标记并重建到巨型蛋白质囊泡中的水通道蛋白SoPIP2；1的荧光图像。使用装配有Roper Cascade冷帧转移CCD单色照相机的Zeiss Axioplan2直立荧光显微镜(Carl Zeiss，Jena，Germany)获得图像。用于获得图像的滤镜设置是390nm激发和435-465nm发射滤镜(蓝色通道)。该单色图像清晰地显示了囊泡外壳(液膜)中标记的SoPIP2；1蛋白的存在。此外，图13和14均显示，由单层脂蛋白体制备的蛋白质囊泡(GPV)主要是单层的。另外，图像清晰地显示了因油相的稳定作用而导致GPV的紧密堆积。这是本发明液膜乳液或囊泡制剂显著不同于可比较的脂质体制备的独特特征，参考NorbertMaurer等(Biophysical Journal，80卷，May 2001，第2310-2326页)的图6、7和8中的显微镜图像，其显示了在液体水相中分散而不相互接触的脂质体。

图17显示了附着有四个badan^TM的AqpZ四聚体的二级结构。此处，附着位置是在Cys 9上，其定位在通常占据脂双分子层膜的疏水区的蛋白质表面上。

图18显示了badan-SoPIP2；1和badan-AqpZ的荧光光谱术。光谱显示了当水通道蛋白重建到大肠杆菌总脂提取物脂质中时，蛋白质怎样响应于逐渐增加的SDS量。亲水性的提高导致红移和荧光发射量的下降，而疏水性的提高导致光谱蓝移和荧光发射量的同时增加。

图19.感测由鲨烯或癸烷油稳定剂制成的SoPIP2；1液膜(或GPV)中badan周围的疏水性，并与PBS中的脂蛋白体比较。因为癸烷具有渗透进入膜中的能力，badan-SoPIP2；1在癸烷油稳定剂中变得更为疏水，并因此提高了蛋白质中的探针周围的疏水性。

实施例8.通过在过滤器底沉积和/或浸渍产生支撑的水通道液膜

以下实例方法利用离心力将液膜样品离心到过滤单元上，在这种情况下所述过滤单元是孔径0.45μm的微孔性PTFE膜。本实施例适用于根据实施例4制备的脂蛋白体乳液。

应用以下步骤：

1.使用Millipore Ultrafree-CL离心式滤器单元(带有PTFE 0.45微米滤器)，并吸取400μL液膜样品到过滤杯中，将过滤杯放到滤液收集管中。

2.将管插入到离心栏式转子中。

3.将样品在2-4000RPM下离心10分钟到30分钟，使过量的水渗透到收集管中。液膜油水乳液的垫层保持沉积在PTFE微孔滤器中。

4.加入小体积(约1mL)的PBS缓冲液。

5.在400RPM下离心样品30分钟，以确定加入的缓冲液不渗透到收集管中。

6.去除加入的缓冲液体积

在图11中显示了滤器单元的图，其中(1)是过滤杯，(2)是抽取液，(3)是收集管，(4)是液膜(在油相(鲨烯)中含脂蛋白体的水)，(5)是原料液。所显示的浓度(例如对任何合适的抽取液为3M，对任何合适的原料液为200mM)仅为说明性目的。

将滤器单元用于正渗透

1.在过滤杯的垫层上插入Millipore微量滤器(Millipore Durapore 0.45微米)，直径10mm，高度30mm。

2.在垫层上应用渗透梯度-在过滤杯上添加高盐浓缩体积(原料液)，如3M氯化钾溶液。

3.将过滤杯浸到充有低渗透原料液含量的原料液的新收集管中。

4.随时间测定过滤杯的抽取液上方的渗透性。

图12是阐明将含AQP的LM与参照(不存在AQP)比较的测量保留在原料液中的渗透性程度的图。所述图显示了抽取液和原料液之间渗透性差异随时间的变化。圆点：AQP液膜，方点：液膜中无AQP。该图清楚地显示，AQP LM沉积物具有比非AQP LM沉积物更高的离子注入速率。如下获得渗透性：在样品管中用25μL实验用水(18.2Mohm-cm电导率的Millipore滤器单元递送水)稀释25μL样品，并在Gonotec Osmomat 030冰点测定渗透压计中进行测量。

将滤器单元应用于反渗透

1/在过滤杯垫层上方插入Millipore微量过滤器，如millipore Durapore0.45微米。放入一定体积的待过滤原料水(例如高盐或其他渗透物浓度的)。

2/用盖子关闭过滤杯通向管的上方出口。

3/置于新的收集管中。

4/施加压力(0.2bar到几bar)。

5/收集渗透液并测定其电导率或渗透性。

实施例9.对正渗透结构筛选UF/NF包封膜和PBS原料/山梨醇抽取的组合对流量性能的影响

目标是测试以下包封和原料/抽取组合(原料流动小室(batch flowcells))。我们利用PBS抽取液和山梨醇原料液，在UF/NF过滤的夹层包封的批量流动小室中测试了液膜LM1制剂的正渗透性能。我们还使用了含水通道蛋白的样品(SoPIP2；1PLM)以及不含水通道蛋白的样品(对照LM)。在图15和16中显示了结果。

材料

包封材料：UF(ETNA 10kDa Alfa Laval)/NF(NF-99Alfa Laval)

原料/抽取：PBS/山梨醇(0.82M)

缩写列表：

PLM：蛋白质液膜，LLM：脂质体液膜，LM：液膜，LM1：液膜制剂和制备物nr1，SoPIP2：菠菜叶水通道蛋白，UF：超滤膜，FO：正渗透。

抽取液和原料液

使用具有18.2MΩcm电阻率(Millipore MilliQ系统)的纯水制备D-山梨醇(Sigma-Aldrich)的抽取液。磷酸盐缓冲盐溶液(PBS，Sigma-Aldrich)用作原料液。

抽取液的终浓度是0.82M d-山梨醇，其为20bar渗透压的溶液(使用Morse计算：∏＝iMRT)。PBS原料液(～150mM NaCl)的渗透压为7bar。

流动小室和过滤器

使用图10的批量流动小室，并且根据标准预制方案制备并装配包封滤器。

平层包封过滤器，命名法和类型：NF：NF-99(Alfa Laval)，UF：ETNA 10kDa(Alfa Laval)

液膜样品

根据实施例3制备Aqp-SoPIP2液膜(GPV-LM1)，和非蛋白质LM1。

流速和截留特性

根据本文的方程来完成渗透物转运特性的测定

结论

在批量小室中用D-山梨醇抽取液和PBS原料液证明了AQP LM的正渗透作用。在3分钟后测定到达高1.3kg/m2h的起始渗透通量率，远高于UF和NF膜可能的流量率。发现UF/NF(活化层(表皮侧)分别朝向原料液和抽取液)包封模式是可行的。

图15为显示SoPIP2；1GPV制剂的正渗透作用流量QA、面积归一化流量的图。结果在批量流动小室中使用0.82M的D山梨醇作为抽取液和PBS缓冲液(Sigma-Aldrich)作为原料液获得。将所述GPV样品包埋在具有分别朝向抽取液和原料液的主动过滤层的UF(朝向原料液)和NF(朝向抽取液)结构的夹层中。图16：具有与图15列出的相同的结构，显示了非水通道蛋白/空制剂。观察到一定的初始流量，随后未观察到渗透流。在该结构中，朝向原料液的滤膜为UF滤膜。LLM-LM1未显示出渗透流。

本研究使用包封膜滤器和抽取液及原料液研究了PLM1-LM1正渗透作用的性能。一个重要的目的是鉴定对我们的原料小室装置中对正渗透抽取有最小影响的液膜支撑滤器。保持液膜完整的被动渗透包封允许我们将渗透流仅归因于水通道蛋白的活性。

实施例10.本发明的液膜系统作为用于免疫测定的生物感受器和用于传染病的药物发现的用途

具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)的主要外膜蛋白FormA是三聚体蛋白，其展示与其他肠细菌扩散孔道蛋白相似的渗透性。每一FormA单体具有扩散孔道蛋白典型的β桶基序，其由16个反向平行的β链组成。FomA孔道蛋白作为电压依赖性通道蛋白起作用。可根据上文实施例3制备液膜乳液，所述液膜乳液具有整合了FomA通道的功能性液膜。

FomA传感器测定将构建成巨型单层囊泡测定，并在下文用作监测传感的膜片钳设备。该膜片钳设备例如可以是开发为port-a-patch膜片钳设备的自动膜片钳装置(Nanion Technologies GmbH，Munich，Germany)。FomA孔道蛋白是潜在的药物靶标，其可用于革兰氏阴性菌感染性疾病的药物开发或免疫测定中。我们的初步研究已经显示，环糊精可阻断FomA。这在之前从未描述过。环糊精阻断FomA的独特特征可用于产生基于FomA的随机传感测定(stochastic sensing assay)。某些药物如抗抑郁药可与环糊精结合(Li-Qun Gu等2000)，其进而被所述蛋白质(在该情况下是FomA)记录。

实施例11.掺入有AqpZ的单层嵌段共聚物囊泡(蛋白聚合体，proteopolymersomes)

根据W02009/076174的实施例2和其中描述的其他实施例制备蛋白聚合体，并将其(而不是脂蛋白体)用于制备整体液膜。该整体液膜可用于本发明的正渗透应用中，例如本文图10和图11中描述的应用中。

本发明的液膜可用于多种众所周知的接触器模块中，如平片状模块和中空纤维模块，并且不限于本文显示的用途和应用。此外，本发明的液膜乳液可直接整合到具有合适孔径分布的支持层中。例如，本文所述具有约200到400或500nm平均直径的蛋白质囊泡能够被吸附到具有该直径的滤膜的孔中。

实施例12.本发明液膜系统在血液透析系统中的用途

肾是在许多动物(包括脊椎动物和一些无脊椎动物)中具有重要功能的器官。它们的功能是从血液中去除废物，因此代表了血液的天然过滤器。在产生尿的过程中，肾排泄废物，如尿素和铵；肾也负责水、葡萄糖和氨基酸的再吸收。每天有180L水进入肾，而几乎全部这些水体积均被再回收(约排泄0.5L)。尿中的盐浓度可以高达血液中的4倍。尿中水再生回收和盐浓缩的原因与肾的结构和水通道蛋白的功能有关。肾作为复杂的正渗透系统发挥功能。在肾中，薄的升支、厚的升支和远端小管是高度不透水的，而其他区段是透水的。这在肾中产生了盐梯度，这是正常肾功能必需的渗透过程的驱动力。

在该上下文中，水通道蛋白在近端小管和收集管中富集。后者负责水的再吸收和尿相比于血液中盐的浓缩。在肾衰竭中，肾不能正常发挥功能，这可能是由于多种医学问题。血液透析是从肾衰竭的患者血液中去除废物如离子(例如K⁺和PO₄ ^3-)和尿素以及游离水的医学方法。

在血液透析中，在正渗透过程中使用矿物离子的无菌透析溶液，以通过半透膜去除所述废物。然而，同时从血液中去除了过量的水，必须对此进行补偿。因此，纯水在血液透析中是必需的。此外，透析患者暴露于大量的水，其与透析浓缩物混和形成透析物，其中即使痕量的矿物污染物或细菌内毒素都可过滤到患者的血液中。即使非常低浓度的金属离子(如来自玻璃器皿的铝离子)以及低水平的内毒素也都可引起这方面的问题。为此，用于血液透析的水在使用前进行仔细的纯化。一种纯化步骤包括迫使水通过微孔性反渗透膜。这样，过滤掉小的溶质，如电解质。可通过使水通过含有离子交换树脂的水槽来完成剩余电解质的最终去除，所述离子交换树脂去除任何剩余的阴离子或阳离子，并分别用羟基和氢分子替换它们，留下超纯水。

即使这种程度的水纯化都可能不够。近来的趋势是使该最终纯化的水(与透析浓缩液混和后)通过透析仪的膜。通过去除杂质，尤其是水经过最初的水纯化系统后在其中传代的细菌来源的那些杂质，这提供另一层保护。

在改善血液透析方法中，本发明的液膜系统具有至少两种有用的应用：

1.产生如本文所述的超纯水可替换在血液透析中用于水纯化的非常精密的系统。

2.在如上所述的其中大量来自患者血浆的水被同时去除的正渗透过程后，这可以在任何本文所述方法中使用水通道蛋白液膜来提取。为此，可产生盐梯度和逆流，模拟本发明液膜两侧的正常肾功能，其然后构成了正渗透过程的必要驱动力，参考图21。这将保证患者自身的血浆水的再利用，并消除来自外部水中存在的污染物(无论怎样纯化)的风险。

尽管为了清晰和理解的目的已经非常详细地描述了上述发明，但是本发明技术人员从阅读本公开内容中明白的是，可进行形式和细节上的多种修改。例如，可以多种组合使用上述所有技术和装置。所有出版物、专利、专利申请和/或该申请中引用的其他文件为所有目的以相同程度以援引方式整体并入本文，就如同每一出版物、专利、专利申请和/或其他文件为所有目的单独以援引方式并入一样。

参考文献：

US4360448(A)“Water in oil emulsions useful in liquid membrane”，Publication date：1982-11-23，Inventor(s)：Li Norman N；Cahn Robert P；Shrier Adam L，Applicant(s)：Exxon Research Engineering Co.WO/1987/002380“Production of Low-Ethanol Beverages by Membrane Extraction”，Publication Date：23.04.1987，Inventor：MATSON，Stephen，L，Applicant：SEPRACOR，INC.[US/US]；33Locke Drive，Marlborough，MA 01752(US)

WO/2009/076174“highly permeable polymeric membranes”，publication date：18.06.2009，inventors：KUMAR，Manish，CLARK，Mark，M.，ZILLES，Julie，BRZELAKOWSKI，Mariusz，NEHRING，Rainer，MEIER，Wolfgang.

Tamir Gonen and Thomas Walz，Quarterly Reviews of Biophysics(2006)，39：4：361-396，CambridgeUniversity Press.

Cath et al.，Journal of Membrane Science，281(2006)70-87.

http://sschi.chtf.stuba.sk/MembraneLab/Equipment.htm.McGinnis and Elimelech，Desalination，207(2007)370-382.

Quirin Schiermeier，“Purification with a pinch of salt”，Nature，452，20March 2008.

Manuel Aguilar & Jose Luis Cortina“Solvent Extraction and Liquid Membranes”，CRC Press，2008.Judge SI，Bever CT(July 2006).″Potassium channel blockers in multiple sclerosis：neuronal Kv channelsard effects of symptomatic treatment″.Pharmacol.Ther.111(1)：224-59.

Karlsson，M.et al.FEBS Letters 537(2003)68-72.

Analytical and bioanalytical chemistry[1618-2642]Hansen yr：2009vol：395iss：3pg：719.Preliminary studies of seawater desalination using forward osmosis.Low，S.C.Desalination and WaterTreatment(2009)，7(1-3)，41-46.

Norbert Maurer et al.，Biophysical Journal，Volume 80，May 2001，pp 2310-2326

L.D.Mayer et al”Vesicles of variable sizes produced by a rapid extrusion procedure”，Biochimica etBiophysica Acta 858(1986)161-168

D.G.Hunter and B.J.Frisken，“Effect of Extrusion Pressure and Lipid Properties on the Size andPolydispersity of Lipid Vesicles”，Biophysical Journal 74(6)1986，2996-3002

B L Mui et al，“Osmotic properties of large unilamellar vesicles prepared by extrusion.”BiophysicalJournal 64(2)1993，443-453.

D.Deamer and A.D.Bangham，Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-Biomembranes Volume 443，Issue 3，7September1976，Pages 629-634

Szoka，F.&Papahadjopoulos，D.(1980)Annu.Rev.Biophys.Bioeng.9，467-508)

Claims

1.液膜系统，其形式为含有生物通道的整体液膜(BLM)、含有生物通道的乳液液膜(ELM)和含生物通道的支撑(固定化)液膜(SLM)或其组合，其中所述液膜系统包含由一种或多种两亲性化合物形成的囊泡，所述两亲性化合物形成其中已掺入有生物通道的双分子层，并且其中所述囊泡还包含稳定性油相。

2.权利要求1的液膜系统，其中所述生物通道是水通道蛋白水通道。

3.权利要求1的液膜系统，其中所述生物通道选自氮化硼纳米管、碳纳米管、两亲性孔形成分子，包括跨膜通道分子β-桶孔，如α-溶血素和OmpG、FomA和VDAC；跨膜肽孔丙甲菌素、缬氨霉素和短杆菌肽A，包括其衍生物和合成肽；离子通道，或离子选择性离子载体。

4.前述权利要求中任一项的液膜系统，其中所述两亲性化合物是脂质。

5.前述权利要求中任一项的液膜系统，其中所述油相包含选自以下的组分：固醇、鲨烯、角鲨烷、α-生育酚、类何帕烷、异戊二烯类包括酯化多萜醇、泛醌(Q10)、霍霍巴油、轻矿物油、亚麻子油、大豆油、花生油、磷脂稳定的鲨烯或者大豆油、磷脂与甘油的乳液，以及烷如癸烷、十一烷、十二烷；及其混合物。

6.前述权利要求中任一项的液膜系统，其中所述生物通道以相对于囊泡表面积为1％到约70％的比例存在。

7.前述权利要求中任一项的液膜系统，其中所述囊泡具有高至1000μm的近似最大直径。

8.从含水液体中提取水的方法，其包括以下步骤：

a)将一定量的前述权利要求中任一项所述液膜系统混合到第一含水液体中以形成悬液，所述第一含水液体的渗透压低于所述囊泡，

b)允许所述悬液中的囊泡从所述第一液体中吸收纯水并膨胀，只要存在渗透压梯度，

c)从所述第一液体中分离已膨胀的囊泡，和

d)将来自步骤c)的所述囊泡重悬于第二含水液体中，所述第二含水液体的渗透压高于已膨胀囊泡的压力，以允许囊泡中提取的水流入所述第二液体并稀释所述第二液体，只要存在渗透压梯度，使得囊泡处于非膨胀状态。

9.权利要求7的方法，其中所述第一含水液体选自天然水源，如海水、河水、湖水、半咸水、雨水；对水通道蛋白水通道无毒的废水；或生物流体，包括酒、果汁和蔬菜汁、乳、全血、血浆、尿、唾液、汗或匀浆组织。

10.权利要求7或8的所述方法，其中通过离心或过滤进行从第一液体中分离已膨胀囊泡的步骤。

11.权利要求8至10任一项的方法，其中所述方法用于将海水脱盐，其中盐水是原料液或第一含水液体，含C0₂/NH₃的水溶液是抽取液或第二含水液体。

12.用于从含水液体介质中提取纯水的装置，其包含一个或多个权利要求1到7任一项的液膜。

13.权利要求12的装置，其中所述装置是双模块中空纤维支撑液膜接触器模块或液体小室外流膜接触器。

14.无溶剂巨型蛋白质囊泡，其基本由水分散系中的油、两亲性脂质和跨膜蛋白通道组成，其中所述脂质与蛋白质的摩尔比为1∶50到约1∶400。

15.组合物，其包含权利要求14的巨型蛋白质囊泡。

16.制备巨型蛋白质囊泡的方法，所述巨型蛋白质囊泡基本由水分散系中的油、两亲性脂质和跨膜蛋白通道组成，并且其中所述脂质与蛋白质的摩尔比为约1∶50到约1∶400，所述方法包括以下步骤：

a)从干燥的脂质溶液制备脂质体，所述干燥的脂质溶液已经在含有去污剂的缓冲液中进行了再水化，并通过约100nm到约500nm孔径的滤器挤出，

c)使用约10kDa的分子量截留将来自b)的混合物透析过夜，

d)分离步骤c)中形成的脂蛋白体囊泡，例如通过离心分离，

e)任选地获得所形成GPV的与所用荧光标记相容的吸收谱，以验证所述跨膜蛋白正确插入到囊泡膜中，和

f)将步骤d)中获得的脂蛋白体与油相溶液中的脂质以约1∶3v/v到约1∶12v/v的摩尔比混合，所述油相溶液含有与步骤a)中相同的脂质，由此导致由所述脂蛋白体形成GPV。

17.制备巨型蛋白质囊泡的方法，所述巨型蛋白质囊泡基本由水分散系中的油、两亲性脂质和跨膜蛋白通道组成，并且其中所述脂质与蛋白质的摩尔比为约1∶50到约1∶400，所述方法包括在翻转混和后由所述两亲性脂质、跨膜蛋白通道和油的含水混合物进行囊泡的自组装。

18.权利要求16或权利要求17的方法，其中所述脂质是豆脂。

19.权利要求16或权利要求17的方法，其中所述脂质是DOPC或DPhPC或DOPS或天然脂质提取物，如大肠杆菌总脂质提取物，或大豆混和磷脂，或其组合混合物。

20.权利要求16到19中任一项的方法，其中所述跨膜蛋白选自水通道蛋白如SoPIP2；1和AqpZ；以及跨膜蛋白如FomA。

21.权利要求16到20中任一项的方法，其中所述跨膜蛋白与荧光标记相连。

22.权利要求21的方法，其中所述荧光标记是萘衍生物，如本文表1中列出的那些或其荧光功能性衍生物。

23.权利要求22的方法，其中所述萘衍生物是6-溴乙酰基-2-二甲基氨基萘。

24.根据权利要求16到23中任一项的方法制备的巨型蛋白质囊泡用于通过正渗透提取水的用途。

25.根据权利要求16到24中任一项的方法制备的巨型蛋白质囊泡用于从血液透析过程中所损失的患者血浆中重新提取纯水的用途。

26.具有开放或闭合夹层结构的支撑液膜，其中基本平的多孔过滤材料在脂蛋白体层的一侧或两侧上提供支撑，由此固定所述层。

25.复合滤膜或滤盘，其通过将含水通道蛋白的脂蛋白体或巨型蛋白质囊泡的层置于过滤材料之间来产生，所述过滤材料选自超滤膜、纳滤膜和微滤膜。