CN102802659B - Lcat治疗贫血和红细胞功能障碍的用途 - Google Patents

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Abstract

公开了通过施用增加内源性LCAT或LCAT活性水平的物质来治疗特征为贫血或红细胞功能障碍的病症的方法。还公开了治疗其中红细胞具有降低的与变形性、氧合作用相关的功能、增加的粘连和聚集性、降低的一氧化氮功能、或减少的寿命、增加的游离胆固醇或异常磷脂含量的病症的方法。还公开了治疗特征为红细胞中游离胆固醇异常浓度的病症的方法，以及正常化红细胞的游离胆固醇含量的方法。

Description

LCAT治疗贫血和红细胞功能障碍的用途
相关申请的交叉引用
本申请要求2009年6月12日提交的美国临时申请序号61/186,668和2010年9月9日提交的美国临时申请序号61/241,223的优先权。美国临时申请序号61/186,668和美国临时申请序号61/241,223的全部内容在此通过引用并入。
发明领域
本发明大体上涉及医学领域，特别是治疗特征为贫血和/或在变形性、氧合作用、聚集、一氧化氮代谢或寿命方面具有异常功能的红细胞的疾病。
背景技术
血流中红细胞(RBC)的质量和数量经常在生理应激增加期间下降，导致贫血和增加的发病和死亡风险。已经与贫血发生相关联的生理应激包括自身免疫病、大手术、创伤、感染性疾病、癌症、病危、糖尿病、肝病、肾病、心衰竭和寄生虫病。循环中升高水平的炎性细胞因子的存在证明，全身性炎症是所有这些情况共同的特征。即使在因为血红蛋白病而易患贫血例如镰形细胞贫血病或地中海贫血的人中，炎性细胞因子水平频繁升高并且可以加重疾病症状，特别是在病危期间。
升高的炎性细胞因子水平的一个结果是酶卵磷脂:胆固醇酰基转移酶(LCAT)的肝生成减少。正常而言，LCAT从肝释放入血浆以促进血浆脂质周转并维持血液中与血液灌注组织中胆固醇和磷脂的平衡。过量胆固醇从组织例如动脉去除，并递送至肝以通过称为反向胆固醇运输(RCT)的过程在胆汁中分泌。在PCT的第一步中，胆固醇从组织细胞穿越至循环中的高密度脂蛋白(HDL)。在第二步中，酶LCAT通过催化脂肪酸从磷脂酰胆碱(PC)(还称为卵磷脂)转酯为胆固醇以形成胆固醇酯(CE)，增强了HDL携带胆固醇的能力。CE产物在HDL内部累积，直至它在肝中以HDL-受体被去除。通过HDL递送至肝的CE被转化成胆固醇和胆汁酸，其在胆汁中分泌。
降低的血浆LCAT活性的健康后果在具有家族性LCAT缺陷(FLD)的人中最明显，家族性LCAT缺陷(FLD)是其中缺乏血浆LCAT活性的罕见遗传病。LCAT活性的缺乏导致血浆CE水平的极大降低，反映为降低的HDL和低密度脂蛋白，以及过量LCAT底物在血浆中积累。FLD的主要健康后果是角膜中脂质的扩散累积导致的视力下降、最终肾脂质累积(肾小球硬化)导致的肾衰竭和溶血性贫血。
脂质代谢疾患(例如低LCAT活性导致的那些)导致的血浆脂蛋白脂质组成的畸变伴随RBC脂质含量的改变。响应于血浆脂质改变的RBC脂质改变可以改变RBC性能和存活，因为这些性质依赖于细胞脂质含量。可能发生的RBC脂质改变的类型在FLD受试者中是明显的，其中RBC富含胆固醇和PC并且神经鞘磷脂(SM)含量降低。这些RBC脂质异常取决于LCAT缺陷导致的血浆脂蛋白脂质紊乱的证据获自实验，其中在正常血浆输注入FLD受试者之后发生RBC胆固醇含量的临时正常化(Muryama等人AmJHematol16129-117，1984)。RBC脂质的这种临时正常化可能由于LCAT、HDL、载脂蛋白A-I或具有FLD患者中缺乏或极大减少的其他血浆因子的补充。
在减少的血浆LCAT活性的较不严重病例中发现贫血和LCAT活性之间没有关联。例如，具有较温和形式的LCAT缺陷的鱼眼病患者表现出小于10％的正常血浆LCAT活性，但是具有正常的血红蛋白和血细胞比容(Rousset等人.CurrOpinEndocrinolDiabetesObes16：163-171，2009)。类似地，对肝病受试者的研究发现，较低的LCAT活性与贫血之间没有关联(LWPowell等人(1975)AustNZJMed5101107)，或者LCAT活性与RBC脂质异常之间没有关联(RACooper等人(1972)JClinInvest513182-3192)。
尽管生理应激下的人RBC中存在类似于FLD患者中检测的那些有害脂质改变的证据，但是LCAT和RBC水平或脂质之间没有明显关系。异常的RBC脂质组成的实例包括具有肝病的人和脂蛋白脂酶缺陷或Tangier疾病导致的血脂障碍的人RBC中增加的PC/SM比例的报道。我们(图1)和其他人也已经发现不处于病危中的镰形细胞贫血病患者的RBC中PC/SM比例增加。而且，报道了糖尿病、心脏病(包括急性冠状动脉综合征)、高胆固醇血症、镰形细胞贫血病患者以及太空飞行后的人中RBC中胆固醇富集。
改变的RBC脂质组成的结果还不完全了解，但是在升高的RBC胆固醇情况下存在膜蛋白活性变得异常的证据。来自肝病患者的胆固醇富集RBC表现出降低的Mg++-ATP酶和乙酰胆碱酯酶活性。胆固醇富集与磷脂酰丝氨酸从内部到细胞外膜表面增强的转移有关，这是网状内皮系统对RBC清除增强的信号。增加的RBC胆固醇可以减少RBC变形性并诱导异常的RBC形态，两者都可以影响经由毛细血管的RBC运输。跨膜气体交换是基本的RBC功能，也受到胆固醇升高的影响。
目前证据表明，异常的RBC脂质组合物可能对红细胞功能具有有害作用，因此需要正常化RBC脂质组成的方法和治疗红细胞功能障碍的方法。
发明概述
文献中关于HDL-C和内源性LCAT活性之间的相关性没有一致意见。我们做出惊人的发现：通过注射重组人LCAT增加血浆LCAT水平快速导致胆固醇从组织去除。此外，HDL-C快速增加。考虑到HDL与RBC之间存在平衡，这些惊人结果指示LCAT的输注也可用于快速校正血细胞脂质异常并改善血细胞功能。
经常报道血浆HDL-C水平在生理应激情况下减少并且鉴于RBC和脂蛋白之间直接的脂质交换而可能是RBC脂质含量畸变的重要因素，所述生理应激例如：自身免疫病、大手术、创伤、感染性疾病、癌症、病危、糖尿病、肝病、肾病、心衰竭和寄生虫病。贫血在其中HDL减少的情况下是非常流行的。
本公开内容涉及通过施用治疗有效剂量的LCAT而增加LCAT浓度和/或活性高于正常人LCAT浓度和/或活性来调节红细胞膜脂质含量的方法。
本公开内容的一个实施方案是治疗患有特征为红细胞功能障碍的病症的患者的方法，该方法包括给受试者施用治疗有效量的LCAT。
另一实施方案是治疗患有特征为贫血或红细胞降低的变形能力、降低的氧合作用、降低的一氧化氮功能、增加的粘连和/或聚集或降低的寿命或其任意组合的病症的患者的方法，该方法包括给有相应需要的患者施用治疗有效量的LCAT。
在另一实施方案中，治疗患有特征为贫血或红细胞降低的变形能力、降低的氧合作用、降低的一氧化氮功能、增加的粘连和/或聚集或降低的寿命或其任意组合的病症的患者的方法包括：测定基线的RBC变形性或RBC氧合作用或RBC聚集或粘连或RBC寿命；给有相应需要的患者施用治疗有效量的LCAT；和测定LCAT施用之后的变化，其中RBC变形性或RBC氧合作用的增加或减少的RBC聚集或粘连或增加的RBC寿命指示病症改善。
在一些实施方案中，被治疗的病症是镰形细胞贫血病、糖尿病、地中海贫血、类风湿病、自身免疫病、关节炎、肝病、肝硬变、肝炎、刺状红细胞增多、败血症、痴呆、贫血、或微血管疾患、炎性疾患、寄生虫病、勃起功能障碍、癌症、子痫前期、病危或创伤。
另一实施方案是治疗患有特征为RBC膜中高水平FC的病症的患者的方法，包括给有相应需要的受试者施用治疗有效量的LCAT。另一实施方案是治疗患有特征为RBC膜中高水平FC的病症的患者的方法，包括：测定FC与PL的基线比例，给有相应需要的受试者施用治疗有效量的LCAT，并在施用LCAT之后测定FC与PL的比例，其中FC与PL的比例的降低指示病症的改善。另一实施方案是减少患者中血细胞的FC含量的方法，包括给患者施用治疗有效量的LCAT。
另一实施方案是治疗患有特征为RBC膜中增加的PC/SM比例的病症的患者的方法，该方法包括给有相应需要的患者施用治疗有效量的LCAT。另一实施方案是治疗患有特征为RBC膜中增加的PC/SM比例的病症的患者的方法，包括：测定PC与SM的基线比例，给有相应需要的患者施用治疗有效量的LCAT，并测定施用LCAT之后的PC与SM比例，其中PC与SM比例的降低指示病症改善。另一实施方案是减少患者中血细胞的POSM比例的方法，包括给患者施用治疗有效量的LCAT。
附图简述
图1显示正常受试者和镰形细胞贫血病受试者的RBC的磷脂组成。
图2是描绘注射LCAT之后人ApoA-I转基因小鼠中血浆HDL-C的增加的图。
图3描绘LCAT-敲除/载脂蛋白A-I转基因小鼠在注射重组人LCAT之后组织的胆固醇含量。
发明详述
本文使用的术语″治疗有效量″表示当根据期望的治疗方案施用时引发期望的治疗作用或响应的LCAT的量。优选的治疗有效量是增加血浆LCAT水平至高于正常水平的LCAT的量。
本文使用的″LCAT水平″指LCAT的血浆浓度。
如本文使用的，LCAT的″正常水平″表示目前没有接受可能改变LCAT水平的任何药物治疗的普通健康未治疗受试者中存在的LCAT血浆浓度。″正常水平″和″内源性水平″在本文可互换使用。
为了避免怀疑，本文对″治疗(treatment)″或″治疗(treating)″的提及包括治愈性、缓解性和预防性的治疗。
″受试者″和″患者″可互换使用。
本文提及有效量或单位剂量时使用的之间是包含性的，例如″1mg和5000mg之间″包括1mg和5000mg。
本文提及有效量或单位剂量时使用的″从″是包含性的，例如″从1mg至5000mg″包括1mg和5000mg。
″FC″是游离胆固醇的缩写并在如本文使用的表示非酯化的胆固醇。
″一氧化氮功能″表示依赖于一氧化氮的RBC介导的过程，包括一氧化氮生成、一氧化氮递送至微血管、抑制血小板和白细胞粘连、血管舒张、RBC变形性和RBC存活。
″PC″是磷脂酰胆碱的缩写。
″SM″是鞘磷脂的缩写。
″RBC变形性″表示细胞改变其形状以适应动态变化的流动条件以最小化其流动阻力并使它们能够穿过小血管的能力。减少的变形性等同于增加的刚性。
″基因治疗载体″是用于在薄壁组织细胞染色体中加入和主动表达感兴趣基因的物质。例如，被改造为携带人LCAT基因的腺病毒。
″渗透脆性″表示细胞由于周围渗透压改变而破裂的敏感性。
″RBC聚集性″表示在血浆蛋白或其他大分子存在下形成正常为钱串形的多细胞聚集物的能力。
″LCAT′与″卵磷脂-胆固醇酰基转移酶″可互换使用。
″LCAT″或″LCAT多肽″在本文使用时包括天生序列LCAT、LCAT变体、修饰的LCAT和嵌合LCAT。在指定LCAT序列中氨基酸位置时，参考SEQIDNO1
人LCATSEQIDNO1(Genbank访问号AAB34898)
FWLLNVLFPPHTTPKAELSNHTRPVILVPGCLGNQLEAKL
DKPDVVNWMCYRKTEDFFTIWLDLNMFLCLGVDCWIDNTR
VVYNRSSGLVSNAPGVQIRVPGFGKTYSVEYLDSSKLAGY
LHTLVQNLVNNGYVRDETVRAAPYDWRLEPGQQEEYYRKL
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GRQPQPVHLLPLHGIQHLNMVFSNLTLEHINAILLGAYRQ
GPPASPTASPEFPPPE
天生人LCAT蛋白序列的具体氨基酸序列使用单字母氨基酸名称加上在蛋白序列中的位置来描述，例如W2指位置2是色氨酸。为了表示特定位置的取代，取代的氨基酸在所述位置之后，例如W2Y指在位置2的色氨酸被酪氨酸替代。
″天生序列LCAT″包括与天然产生的LCAT具有相同氨基酸序列的多肽。因此，叹声序列LCAT特别包括LCAT的天然存在的截短形式以及LCAT的天然存在的等位基因变体、天然存在的变体形式(例如，可选剪接形式)。优选的天生序列LCAT是成熟的天然序列LCAT。
″修饰的LCAT″表示其中天生LCAT多肽中一个或多个氨基酸被另一氨基酸取代、或者一个或多个氨基酸被添加至天生多肽的包括但不限于N末端或C末端氨基酸部分的多肽。例如而非限制，修饰的LCAT可以是美国专利申请号12/179,815中描述的修饰的LCAT蛋白。在其他实施方案中，一个或多个氨基酸被保守取代所取代。非限制性的示例性保守取代提供于表2。在其他实施方案中，一个或多个氨基酸被非天然存在的氨基酸所取代。此外，修饰的LCAT多肽包括LCAT或修饰的LCAT的衍生物。这些衍生物可以例如提高多肽的溶解度、吸收、生物半衰期。多肽衍生物是本领域公知的。本领域技术人员知道如何衍生多肽以改善其药理学性质。
表2
本公开内容涉及治疗患有特征为贫血或红细胞功能障碍的病症的患者的方法，该方法包括给有相应需要的患者施用治疗有效量的增加LCAT活性、或增加LCAT血浆水平、或增加LCAT活性并增加LCAT血浆水平的物质。LCAT水平和/或LCAT活性可以通过任何可用的方式增加。这包括但不限于直接施用LCAT、通过基因治疗表达LCAT和通过施用药物上调内源性LCAT。
在一个实施方案中，LCAT水平和/或活性的水平通过直接施用LCAT来增加。优选地，根据本公开方法施用的LCAT是重组产生的人LCAT(例如，施用动物、哺乳动物细胞、真菌、昆虫细胞或植物作为重组蛋白表达系统)。产生蛋白重组体的方法是本领域公知的。LCAT还可以通过任何适合的方法获得，例如从人血浆分离。LCAT可以稳定的批量或单位剂量形式制备。在一个实施方案中，LCAT活性水平通过使用基因治疗来增加。本文使用的″基因治疗″指新的遗传信息转移和优选稳定整合入受试者的细胞。通过基因治疗提高LCAT活性水平的方法包括用包括编码LCAT表达的核酸序列的核酸转染细胞。转染的细胞表达LCAT并将它分泌入受试者血浆。细胞以足够数目转染，或者这种LCAT的高表达使得它们增加LCAT的量至治疗有效的水平。编码LCAT的基因可以通过任何适合的方法引入受试者。在一个实施方案中，基因通过表达载体体内引入个体细胞。另一实施方案中，基因被引入离体细胞，并且表达和分泌LCAT的转染细胞被施用给受试者。在体内方法中，肝细胞是有用的转染靶。肝细胞产生LCAT，因此它们具有制备酶重组子的加工器。而且，被注射入血流的载体快速穿过肝，因此肝细胞快速暴露于载体。造血干细胞也是基因治疗有用的靶，因为它们迅速繁殖，从而产生能够产生LCAT的多个细胞。离体方法也是有吸引力的，因为它们允许对转染过程的更多控制。例如，转染细胞可以被测试，以最高量表达LCAT的细胞可以被选择。造血干细胞可以取自受试者，离体转染并再引入受试者。因此，在一个实施方案中，细胞来自受试者。将基因体内或离体转染入哺乳动物细胞并获得其表达的方法是本领域公知的。
本公开内容涉及通过增加LCAT水平和/或活性高于正常人LCAT水平来调节红细胞膜脂质含量的方法。本公开的一个实施方案是治疗患有特征为红细胞功能障碍的病症的患者的方法，该方法包括给受试者施用治疗有效量的LCAT。本公开另一实施方案是治疗患有特征为红细胞功能障碍的病症的患者的方法，包括给受试者施用治疗有效量的增加内源性LCAT生成或增加LCAT活性的药物。在特定实施方案中，药物是小分子治疗剂。
一些实施方案涉及通过在有相应需要的受试者中增加LCAT水平或增加LCAT活性来正常化RBC细胞膜的FC含量的方法。根据本公开的一个实施方案是通过给有相应需要的患者施用治疗有效剂量的LCAT来治疗患有特征为具有FC含量增加的RBC的病症的患者的方法。快速增加LCAT水平导致FC从RBC向HDL的净转移，由此改变RBC膜组成改变为更加流体状态。该作用增加RBC氧合作用，改善流变学(增加变形性，流动，减少磷脂酰丝氨酸外部化，减少粘连和聚集倾向)，减少贫血(减少与减少的变形性相关的机械应激和破坏，增加RBC寿命)，和增加RBC氧合组织、特别是外周组织的能力。在一些实施方案中，红细胞生成在施用治疗有效量的LCAT之后增加。在一些实施方案中，一氧化氮功能在施用治疗有效量的LCAT之后增加。存在许多其中RBC细胞膜具有相对于磷脂水平增加的FC水平的病症。血细胞膜中增加的FC含量存在于许多疾病状态，包括但不限于镰形细胞贫血病、糖尿病、地中海贫血、类风湿病、自身免疫病、关节炎、肝病、肝硬变、肝炎、刺状红细胞增多、败血症、痴呆、贫血、或微血管疾患、炎性疾患、寄生虫病、勃起功能障碍、癌症、子痫前期、病危或创伤。
尽管在这些疾病中不是主要病变，但是RBC组成和功能的变化导致潜在疾患发病率的增加。因此，本公开的一个实施方案是通过给有相应需要的患者施用治疗有效剂量的LCAT来治疗具有镰形细胞贫血病、糖尿病、地中海贫血、类风湿病、自身免疫病、关节炎、肝病、肝硬变、肝炎、刺状红细胞增多、败血症、痴呆、贫血、或微血管疾患、炎性疾患、寄生虫病、勃起功能障碍、癌症、子痫前期、病危或创伤的患者的方法。
例如镰形细胞贫血病(SCD)、地中海贫血和血红蛋白E(HbE)中的血红蛋白基因突变可以导致许多病变，该病变降低RBC变形性和携带/递送氧的能力。作为实例，SCD是遗传性疾患，由血红蛋白(HbS)的β球蛋白亚基中的单氨基酸替代引起。在低氧条件下，HbS聚合(聚集)，导致RBC形状从正常拱形变为″镰形″。刚性HbS聚合物的形成降低了RBC弹性或变形性，这对其功能是有害的，因为它们必须能够反复穿过比其自身大小更小的毛细血管四次以氧合组织。因此，镰形化导致归因于所有大小的毛细血管后小静脉的闭塞的血管闭塞疾病和增加的RBC脆性，导致溶解和溶血性贫血。尽管低氧条件下的镰形化引起急性病危和与疾病相关的主要问题，但是未镰形化的患者RBC在正常氧条件下具有更加刚性的膜，具有降低的变形性和增加的聚集性。来自SCD红细胞膜的化学分析也证明了增加的FC含量。此外，这些患者通常具有CE含量降低的低HDL，推论降低的LCAT活性或功能性LCAT缺陷。事实上，一个研究显示LCAT活性在SCD患者中降低30％。因此，本公开的一个实施方案是通过给具有相应需要的患者施用治疗有效量的LCAT而治疗具有镰形细胞贫血病的患者的方法。
注射高水平的LCAT，例如导致内源性活性倍增至1000倍的量时，SCD患者中LCAT的内源性活性将迫使FC从RBC移动并伴随增加的血浆HDL-C水平。RBC的FC含量的减少将导致RBC变性能力的增加并提高O2交换率。改善的RBC功能将减少闭塞事件，这是由于血液改善的流动性和降低的镰形化率(归因于RBC更好的再氧合)。另一实施方案中，给有相应需要的患者施用治疗有效量的LCAT增加了RBC变形性和RBC氧合作用。在一些实施方案中，RBC寿命在施用LCAT之后增加。
在肝病中，RBC胆固醇增加并经常发生贫血。LCAT治疗将正常化RBC胆固醇，恢复受累RBC的正常形状和功能，减少RBC破坏，增加寿命并由此降低贫血倾向。因此，另一实施方案是通过给患者施用治疗有效量的LCAT来治疗患有贫血的患者的方法。
靶细胞和刺突红细胞贫血(刺状红细胞增多)：靶细胞和刺突红细胞具有增加的FC含量，导致降低的功能和增加的溶血和贫血。
在例如败血症、风湿病和炎性疾患(包括炎症贫血)等病症中，存在许多病变，例如降低的RBC变形性和导致其他并发症的异常流变学。由于降低的氧合和增加的RBC聚集对组织和器官系统的损伤导致从最初炎性损伤增加的发病率和死亡率。因此，另一实施方案是通过给有相应需要的患者施用治疗有效量的LCAT来减少PRB聚集性的方法。LCAT可以对炎症期间产生的氧化磷脂起作用。氧化磷脂是非常具有反应性的，并且可以增加对细胞和器官系统的损伤。正常化RBC膜脂质将改善流动和组织氧合，并降低反应性氧化脂质的浓度。这是在手术后是有用的，手术中隐蔽的感染可以降低RBC功能，增加创伤愈合时间。
微血管疾患可以在RBCFC增加时发生，从而引起RBC的刚性、增加的粘连和聚集。这些变化表现为毛细血管和小静脉中存在的低流动(或低压)。当RBC不能适当变形时，其在这些小血管中的运输很大程度上被减缓。随着聚集和粘连倾向的降低，外周血管中存在较大的堵塞机会。在微血管对于正常功能是关键的器官(例如，眼、耳、脑、肾、阴茎、肺)中，这些血管中反复的局部缺血事件导致功能丧失(例如，盲、听力丧失、肾衰竭、局部缺血性微血管脑疾病(例如痴呆、阿尔茨海默氏)、勃起功能障碍)。LCAT治疗会降低RBCFC，改善RBC流变学，降低进一步堵塞和终末器官损伤的风险。
本公开实施例1证明，是正常LCAT活性水平的大约30倍的小鼠与正常小鼠相比具有降低的RBC积聚，说明LCAT活性是调节RBC积聚的主要因素，并且就这点而言可以是限速性的。
因此，给具有特征为异常流变学(贫血、降低的变形性、增加的聚集、降低的流动、减少的RBC寿命)的病症的患者施用例如LCAT内源性水平的1倍至1000倍、或LCAT内源性水平的1倍至500倍、或LCAT内源性水平的1倍至100倍的高剂量LCAT将导致病症改善。
因此，另一实施方案是通过施用治疗有效剂量的LCAT来治疗具有镰形细胞贫血病、糖尿病、地中海贫血、类风湿病、自身免疫病、关节炎、肝病、肝硬变、肝炎、刺状红细胞增多、败血症、痴呆、贫血、或微血管疾患、炎性疾患、寄生虫病、勃起功能障碍、癌症、子痫前期、病危或创伤的患者的方法。本公开另一实施方案是通过施用增加TCAT活性或LCAT水平的药物来治疗具有镰形细胞贫血病、糖尿病、地中海贫血、类风湿病、自身免疫病、关节炎、肝病、肝硬变、肝炎、刺状红细胞增多、败血症、痴呆、贫血、或微血管疾患、炎性疾患、寄生虫病、勃起功能障碍、癌症、子痫前期、病危或创伤的患者的方法。在优选实施方案中，所述药物是小分子治疗剂。在另一实施方案中，LCAT水平和/或LCAT活性使用基因治疗来增加。
另一实施方案是通过施用治疗有效剂量的LCAT来治疗阿尔茨海默氏相关痴呆的患者的方法。另一实施方案是通过施用治疗有效剂量的修饰LCAT来治疗具有镰形细胞贫血病、糖尿病、地中海贫血、类风湿病、自身免疫病、关节炎、肝病、肝硬变、肝炎、刺状红细胞增多、败血症、痴呆、贫血、或微血管疾患、炎性疾患、寄生虫病、勃起功能障碍、癌症、子痫前期、病危或创伤的患者的方法。在一些实施方案中，修饰的LCAT包括保守氨基酸取代。在一个实施方案中，修饰的LCAT包括在位置F1、L3、L4、N5、L7、C31、N384或E416的取代。在各种实施方案中，修饰的LCAT包括在位置31的氨基酸取代。在其他实施方案中，修饰的LCAT包括C31Y取代和在氨基酸残基F1、L4、L32或N34的一个或多个处的取代。在另一实施方案中，修饰的LCAT包括C31Y取代和在以下取代的一个或多个：F1S、F1W、L4M、L4K、N34S、L32F或L32H。在各种实施方案中，修饰的LCAT包括以下取代的一个或多个：F1A、F1G、F1I、F1L、F1M、F1P、F1V、F1Y、F1T、F1Q、F1N、F1H、F1D、L3I、L3F、L3C、L3W、L3Y、L4A、L4I、L4M、L4F、L4V、L4W、L4Y、L4T、L4Q、L4R、N5A、N5M、N5H、N5K、N5D、N5E、L7M、L7R、L7E、C31A、C31I、C31M、C31F、C31V、C31W、C31Y、C31T、C3IR、C31H、N384C、N384Q或E416C。在其他实施方案中，患者中LCAT的水平通过使用基因治疗技术来增加。在另一实施方案中，LCAT表达通过药物施用而上调。
在根据本公开的方法中，LCAT一般以药物组合物施用给受试者，所述药物组合物包括药学可接受的载体或稀释剂。药物组合物可以根据常规方法配制为适合选定的施用途径的药物组合物，所述施用途径即口服、胃肠外、通过静脉内、肌肉内或皮下途径。
适合本公开化合物递送的药物组合物及其制备方法对于本领域技术人员来说是明显的。这种组合物及其制备方法可以参见例如Remington′sPharmaceuticalSciences，第19版(MackPublishingCompany，1995)。
所述组合物可以采取诸如在油性或水性媒介物中的悬浮剂、溶液或乳液的形式，并且可以含有配制剂，例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。可选地，活性成分可以是粉末形式以在使用之前用适合的媒介物例如无菌无热原水构建。通常，这种组合物是无菌等渗含水缓冲液中的溶液。所述组合物可以是气密容器，例如安瓿、注射器或管形瓶，含有或不含有添加的防腐剂。
液体载体或媒介物可以是溶剂或液体分散介质，包括例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)、植物油、非毒性甘油酯及其适合的混合物。可以通过形成脂质体、在分散体情况下通过维持所需的粒度、或者使用表面活性剂来维持适当的流动性。可以通过各种抗细菌和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等来预防微生物作用。在许多情况下，优选的是包括等渗剂，例如糖、缓冲剂或氯化钠。可以通过在组合物中使用延迟吸收的物质例如单硬脂酸铝和明胶来实现可注射组合物的延长吸收。
根据本公开内容，LCAT可以单独使用或者以与用于治疗前述病症的其他药物的组合治疗来使用。此类治疗包括但不限于同时或顺序施用涉及的药物。例如，LCAT制剂可以与作为护理特定病症的标准普遍使用的药物一起施用。例如，LCAT可以与用于治疗贫血的红细胞生成刺激剂(ESA)例如促红细胞生成素、甲氧基聚乙二醇-重组人肾红细胞生成素β、darbepoetin-α、romiplostim和重组人肾红细胞生成素α组合施用。或者例如，LCAT可以与用于治疗镰形细胞贫血病的羟基脲、羟基尿素、丁西他滨或丁酸酯组合施用。
在一个实施方案中，治疗有效量的LCAT通过皮下注射施用。在另一实施方案中，治疗有效量的LCAT通过肌肉内注射施用。在另一实施方案中，治疗有效量的LCAT通过静脉内注射或输注施用。在一些实施方案中，LCAT的治疗有效量是1mg至5000mg、或1mg至2000mg、或10mg至5000mg、或10mg至1000mg、或10mg至500mg、或5mg至100mg。
在一些实施方案中，治疗有效量的LCAT是LCAT内源性水平的1倍至1000倍、25倍至1000倍、50倍至1000倍、1倍至100倍、50倍至500倍、或1倍至500倍。
使用的具体剂量可以变化。例如，剂量可以取决于许多因素，包括但不限于给药频率、重组LCAT酶的特定活性、患者体重、患者的特殊需要、患者的特殊病症(例如，异常的肾或肝功能)、待治疗的病症等等。给药频率和量可以在医师判断下超出本文给出的通常范围。这些剂量是基于具有约60kg至70kg体重的普通人受试者。对于特定患者的最佳剂量的确定是本领域技术人员公知的。医师将容易能够确定体重超出该范围的受试者例如婴儿和老年人的剂量。
根据待治疗的疾患和模式，本领域技术人员(即，医师)能够确定高于以下剂量的初始剂量是适合的。例如，表现出病危状态的镰形细胞贫血病的患者可以被施用″正常″水平30倍的初始剂量。一旦患者的RBC氧合作用水平达到期望水平，则剂量将被减少至例如″正常″水平的3倍。
特定剂量的效力可以参考生物标志或某些生理参数的改善来评估。适合的生物标志包括但不限于FC与PL比例、FC与膜蛋白比例、PC与SM比例或HDLC水平。适合的生理参数包括但不限于降低的贫血、通过RBC增加测量的改善的流变学、RBC变形性、血流和/或RBC聚集性、渗透脆性或RBC氧合作用水平；这些参数任何一个的增加指示改善。上述生物标志水平和参数的测量可以使用本领域公知的方法测量。例如，降低的贫血可以通过使用标准的完善的临床技术测量的增加的血细胞比容或血红蛋白或血红蛋白分解产物(例如，未轭合的胆红素)来度量。变形性可以通过过滤、粘度测定法、细胞变形计量法和通过使用微量移液管来测量。聚集可以通过多种仪器来测量，所述仪器包括细胞变形计量仪和聚集计量仪。RBC氧合作用可以通过标准的脉搏量氧法和血液气体分析来测量，组织氧合可以使用具有氧感应器的硅管压力测量器的直接探头来测量。本领域技术人员将理解结果的意义并且可以根据评估例如以上描述的那些来选择调整剂量。
如实施例4所述和图2所示，在LCAT施用给人载脂蛋白A-I转基因小鼠之后，血浆HDL-C水平增加。该增加是惊人快速的，血浆HDL-C水平在4小时增加对照的约70％，并且在24小时内增加约120％。因此，本公开另一实施方案是治疗具有特征为贫血或红细胞功能障碍的病症的患者的方法，包括给有相应需要的受试者施用治疗有效量的LCAT，其中受试者中血浆HDL-C水平在施用LCAT之后快速增加。在特定实施方案中，受试者中的血浆HDL-C水平在施用LCAT之后4小时与施用LCAT之前的血浆HDL-C水平相比增加了至少30％或至少40％或至少50％或至少70％或至少80％。在另一实施方案中，受试者中的血浆HDL-C水平在施用LCAT之后12小时与施用LCAT之前的血浆HDL-C水平相比增加了至少40％或至少50％或至少60％或至少70％或至少80％或至少90％或至少100％或至少110％或至少120％。在另一实施方案中，，受试者中的血浆HDL-C水平在施用LCAT之后24小时与施用LCAT之前的血浆HDL-C水平相比增加了至少40％或至少50％或至少60％或至少70％或至少80％或至少90％或至少100％或至少110％或至少120％或至少130％或至少140％或至少150％。
如实施例5所述和图3所示，给LCAT-敲除/载脂蛋白A-I转基因小鼠施用LCAT导致组织胆固醇(主动脉和肝)增加、血浆胆固醇水平增加。来自实施例4和5的组合数据说明，LCAT的注射使脂质从组织快速再分布至血浆HDL。考虑到LCAT注射对肝和主动脉的胆固醇含量的影响，预期在红细胞中将快速观察到类似变化。
FC从RBC转移至HDL会使RBC膜组成改变至更正常的状态。该作用将增加RBC的氧合，改善流变学(增加变形性，流动，减少粘连和聚集倾向)，减少贫血(减少与减少的变形性相关的机械应激和破坏，增加RBC寿命)，和增加RBC氧合组织、特别是外周组织的能力。
在一些实施方案中，LCAT由患者通过皮下或肌肉内注射来自我施用。自我施用对于包括但不限于罹患镰形细胞贫血病、糖尿病、类风湿病或肝炎的患者的慢性治疗而言是优选的实施方案。
实施例1
LCAT水平对小鼠血细胞比容的影响
从3组LCAT缺陷小鼠(LCAT-KO)、LCAT过表达转基因(-30x正常LCAT活性)和对照C57/b6小鼠取血液样品。RBC膜从血液样品分离，并测量含有磷脂的胆碱(WakoPhospholipidsB，Richmond)，作为RBC积聚或血细胞比容RBC积聚的替代物，在LCAT缺陷小鼠中显著低于正常小鼠(分别是402±220μg/ml全血与486±257μg/ml全血)。LCAT缺陷小鼠中的贫血在此证明与FLD患者中观察到的贫血程度类似。惊人的是，在LCAT过表达转基因小鼠中的RBC积聚与具有正常LCAT活性的小鼠相比显著升高(分别是556±201μg/ml全血与486+257μg/ml全血)。这些结果显示，LCAT水平和血细胞比容之间存在正相关。此外且最重要的是，超正常水平的LCAT可以增加动物的血细胞比容而不考虑贫血。这些研究显示，增加的水平对于各种原因的贫血患者、甚至是具有正常LCAT活性的患者的可行的治疗选择。
实施例2
从正常和SCD受试者(非病危)制备的RBC血影膜的磷脂组成
磷酸盐缓冲盐水中洗涤的RBC样品从正常受试者(n＝7)和SCD患者(n＝6)收集的新鲜血液制备。50微升小份的包装RBC悬浮于0.95ml磷酸盐缓冲盐水。通过在玻璃管中将0.4ml小份的各个RBC悬液与20μl1mg/ml的1-二十烷醇在乙酸乙酯∶丙酮中的溶液(内部标准)和2ml的乙酸乙酯∶丙酮∶甲醇(6∶3∶1)混合来提取脂质。加帽的管被振摇2分钟，然后在2000rpm离心5min。上层有机相被转移至12x32mmHPLC管形瓶。溶剂在氮气流下、随后高真空至少1小时从管形瓶蒸发。干燥的脂质在200μl三甲基戊烷∶甲醇∶四氢呋喃(95∶5∶2)中重构。膜脂质通过高效液相色谱在二氧化硅柱上层析。磷脂酰胆碱(PC)和神经鞘磷脂(SM)通过蒸发光散射检测器来检测并定量。结果显示，SCD患者中的RBC脂质与正常受试者相比富含PC并且SM含量减少(图1)，导致PC/SM比例从对照的0.67增加至SCD的0.98。本研究中分析的SCDRBC表现出不同于正常RBC的磷脂组成模式。SCDRBC脂质组成类似于针对低血浆LCAT活性的其他情况的RBC报道的脂质组成。
实施例3
重组人LCAT的制备
编码人LCAT蛋白的质粒pCMV6-XL4/LCAT购自OrigeneTechnologies(Kockville，MD)并连接入pcDNA3.1/Hygro(Invitrogen，Carlsbad，CA)。pcDNA3.1载体被转染入HEK293f细胞。稳定转染的细胞用200μg/ml潮霉素B选择并在Freestyle293无血清培养基(Invttrogen)中在10L烧瓶中生长4天。rhLCAT通过氯化锌沉淀随后批捕获和苯基琼脂糖洗脱从培养基分离。
实施例4
注射了LCAT的人载脂蛋白A-I转基因小鼠中HDL胆固醇增加
表达人载脂蛋白A-I基因(JacksonLaboratory)的雄性转基因小鼠以随意获取正常狗食来维持。小鼠通过后眶窦被单次静脉内注射盐水或重组人LCAT的盐水溶液(4mg/kg)。在注射后0、1、4、24、48和72小时在异氟烷麻醉动物中在眶丛处收集血液。使用商业化酶测定试剂盒测定血浆胆固醇浓度。HDL中胆固醇(HDL-C)的量通过琼脂糖凝胶电泳来测定，使用来自HelenaLabs的SPIFE系统。图2显示，被施用LCAT的小鼠显示血浆HDL-C水平显著增加了多达对照的120％。HDL-C水平在实验期间(72小时)维持增加的水平。血浆HDL的增加惊人迅速，显示在4小时增加对照的约70％并且在24小时内约120％。
实施例5
LCAT注射对LCAT-敲除/载脂蛋白A-I转基因小鼠组织中胆固醇含量 的影响
表达人载脂蛋白A-I的转基因小鼠(JacksonLaboratory)与LCAT-KO小鼠杂交获得LCAT-KO/apoA-I-Tg小鼠。LCAT-KO/apoA-I-Tg小鼠以随意获取正常狗食来维持。每天进行盐水或0.4mgLCAT的通过后眶窦的静脉内(IV)注射，持续4天。在第5天处死动物。使动物麻醉并通过肝素化盐水灌注来放血。肝叶和主动脉从每只动物取出并用氯仿和甲醇溶液提取。从提取的组织回收的脂质中的胆固醇用商业化酶测定试剂盒测量。
图3显示了用盐水(对照)或LCAT(实验)注射的小鼠的(A)肝、(B)主动脉和(C)血浆的胆固醇含量。LCAT处理显著减少了肝和主动脉中胆固醇的水平并显著增加了血浆胆固醇水平。来自实施例4和5的组合数据说明，LCAT的注射快速地将脂质从组织再分配至血浆HDL。考虑到LCAT注射对肝和主动脉胆固醇含量的影响，预期类似改变将在红细胞中观察到。
实施例6
处于镰形细胞病危中的儿童(30kg)被允许就医。根据护理治疗标准，他在1小时时段内被输注总共100ml盐水中的5mg/kg重组人LCAT(rhLCAT)。治疗后，血氧水平被测量并改善。危机消除时，测量红细胞形态和物理特征(RBC变形性、RBC聚集和渗透脆性)，结果与入院时取的血液样品结果相比较。RBC物理特征和氧合作用的改善通过每周以0.5mg/kg的剂量皮下注射rhLCAT来维持。
实施例7
35岁大的雌性(55kg)表现出类风湿性关节炎，具有贫血，血红蛋白水平为9g/dl(正常范围12-14g/dl)。取血液样品并证明她的红细胞与正常红细胞相比较不容易变形并且更容易聚集。患者被规定每周注射1mg/kg剂量的rhLCAT，皮下施用。6次每周注射之后测量血细胞比容和血红蛋白水平，并发现增加了20％。6个月治疗之后，血红蛋白是14g/dl。医师决定使患者维持在每两周一次注射1mg/kg剂量的rhLCAT。
实施例8
65岁大的雄性(80kg)被安排四重旁路手术。患者被建议在手术前5天停止服用氯吡格雷以减少术后流血的机会。为了减少血小板活化、血栓形成或RBC聚集的风险，患者在手术前5天去医生办公室输注1mg/kgrhLCAT。患者在手术后立即、术后7天和术后14天输注1mg/kgrhLCAT。恢复之后(术后21天)，患者恢复慢性氯吡格雷治疗。
实施例9
LCAT的肝特异性过表达的基因转移
患者表现出类风湿性关节炎，伴随慢性贫血。患者通过门内导管注射被施用4x1012腺病毒颗粒剂(AdrLCAT)/kg。治疗后每周监测LCAT水平。治疗后4周，患者具有10mg/L或比非关节炎受试者浓度大约2倍的LCAT水平。治疗后8周之后，每月监测患者。如果患者的LCAT水平降至5mg/L以下则重复该过程。
实施例10
处于镰形细胞病危中的儿童(30kg)被允许就医。根据护理治疗标准，他在1小时时段内被输注总共100ml盐水中的5mg/kg重组人LCAT(rhLCAT)。治疗后，血氧水平被测量并改善。危机消除时，测量红细胞形态和物理特征(RBC变形性、RBC聚集和渗透脆性)，结果与入院时取的血液样品结果相比较。然后患者进行其中医疗装置被放在皮肤下的程序。医疗装置包括被设计为分泌活性LCAT的哺乳动物细胞。该细胞释放足够的LCAT以使内源性LCAT活性升高正常LCAT水平的超过100％。
应该理解本发明范围由权利要求书限定并且不受本文具体描述的实施方案和实施例的限制。

Claims (8)

1.LCAT在制备治疗镰形细胞贫血病或类风湿性关节炎中的贫血的药物中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述贫血特征在于降低的血细胞比容、降低的血红蛋白水平、红细胞降低的变形能力、降低的氧合作用、增加的聚集和粘连、降低的一氧化氮功能、降低的寿命或其任意组合。
3.根据权利要求1所述的用途，其中所述贫血是类风湿性关节炎中的贫血。
4.根据权利要求1所述的用途，其中所述贫血是镰形细胞贫血病中的贫血。
5.根据权利要求2所述的用途，其中LCAT的量是提高LCAT浓度至高于正常LCAT水平或增加LCAT活性至高于正常LCAT活性的量。
6.根据权利要求2所述的用途，其中所用的LCAT的量是10mg至5000mg。
7.根据权利要求2所述的用途，其中所用的LCAT的量是LCAT正常水平的1倍至1000倍。
8.根据权利要求6所述的用途，其中所用的LCAT的量是10mg至1000mg。
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