CN102802638A - 葡糖胺聚糖混合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及造骨细胞来源的葡糖胺聚糖混合物和涉及在以下的一种或更多种中的应用：破骨细胞生成的抑制、造骨细胞增殖的增强、和/或骨折或骨退化的治疗或预防。

Description

葡糖胺聚糖混合物

技术领域

本发明涉及造骨细胞来源的葡糖胺聚糖混合物并涉及它们在以下一种或更多种中的应用：破骨细胞生成的抑制、造骨细胞增殖的增强、和/或骨折或骨退化的治疗或防止。

背景技术

骨重建（Bone remodeling）是涉及造骨细胞的骨基质合成和破骨细胞的骨再吸收之间的平衡的协调过程。对于维持骨骼完整性这种持续过程是必不可少的[Boyle等人.,2003;Karsenty and Wagner,2002;Roodman,1999;Theill等人.,2002]。多核的破骨细胞来源于造血系统的骨髓中的单核细胞/巨噬细胞[Suda等人.,1992]。在很多骨质减少的紊乱中，包含骨质疏松症、细胞溶解酶的骨转移或风湿性关节炎、和最终导致反常的骨再吸收和骨折中观察到增加的破骨细胞的活性[Roodman,1999]。在许多影响破骨细胞生成（骨诱裂发生，osteoclastogenesis）的因素中，NF-γB的受体活化剂（RANK）、它的配体RANKL和骨保护素（OPG），RANKL的诱饵受体（decoy receptor）是破骨细胞发展必不可少的[Anderson等人,1997;Wong等人,1997;Yasuda等人1998]。

RANKL是TNF（肿瘤坏死因子）配体超家族成员[Anderson等人,1997;Lacey等人,1998;Wong等人,1997;Yasuda等人,1998]。它是由造骨细胞和骨髓基质细胞产生的，然而它的受体RANK是在破骨前体细胞（preosteoclasts）的表面表达的[Fuller等人,1998]。RANKL和RANK之间的相互作用，通过调节破骨细胞生成的转录因子的活化刺激靶向的破骨细胞的成熟[Blair等人,2007;Burgess等人,1999;Hsu等人,1999;Jimi等人,1999;Lacey等人,1998;Matsuzaki等人,1998]。RANKL也是成熟的破骨细胞生存必需的[Katagiri和Takahashi,2002]。OPG是由造骨细胞产生的且担当RANKL的诱饵受体，因而通过RANK对RANKL结合的竞争抑制破骨细胞的分化和生存[Bolon等人,2001;Simonet等人,1997;Yasuda等人,1998]。

遗传研究的证据显示，RANKL和RANK是破骨细胞生成必不可少的。RANK或RANKL缺乏的老鼠表现出显著的骨骼石化症和由造骨细胞形成的减少引起的牙齿长成的缺陷[Dougall等人,1999;Kim等人,2000;Kong等人,1999;Li等人,2000]。然而缺少OPG的老鼠增加破骨细胞的数目和活性，并从而遭受严重的骨质疏松症[Bucay等人.,1998;Mizuno等人.,1998]。

积聚的临床证据在骨新陈代谢中具有进一步的RANKL/RANK/OPG的关键作用，且它们直接与人类疾病有关。在几种骨新陈代谢的疾病中，包含绝经后的骨质疏松症、糖皮质激素-诱导的骨质疏松症、多发性骨髓瘤关联的溶骨性病变（osteolytic lesions）和动脉粥样硬化的疾病关联的脉管石灰化，证明了RANKL的升高和/或OPG的下降。这种不平衡进一步暗示作为负责骨质疏松症的重要的机制[Eghbali-Fatourechi等人,2003;Pearse等人,2001;Sasaki等人,2002;Schoppet等人,2004]。此外，在几种稀有的无机物代谢的遗传紊乱中，识别了OPG基因的失活突变和RANK基因的活化突变[Hughes等人,2000；Nakatsuka等人,2003；Whyte和Hughes,2002；Whyte等人,2002]。所有这些遗传的异常性导致RANK/RANKL信号运输的无对立的活化，其增强破骨细胞生成，并从而增加骨损失。

近来的研究突出了葡糖胺聚糖（GAG）在RANK/RANKL的相互作用和活性中的重要作用。GAG是由具有羧基和一个或更多硫酸盐的重复的二糖单元组成的聚阴离子线性多聚糖[Lamoureux等人,2007]。大多数GAG共价地附连到核心蛋白上，以便形成蛋白多糖，其是骨细胞外基质的主要成分[lozzo,1998]。内生的GAG包含肝素、硫酸类肝素（heparansulfate）、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素和透明质酸。GAG调节广泛的多种生物学过程，例如，止血、炎症、血管形成、细胞因子表达/结合、细胞附连和迁移以及增殖和分化的控制[Gandhi和Mancera,2008；Perrimon和Bernfield,2000]。GAG通过与蛋白质肝素-结合域的相互作用结合到很多蛋白质配体上，因此修饰蛋白质的生物活性。近来的研究证明，硫酸皮肤素和肝素对RANKL具有高亲和力，和通过阻隔RANKL和RANK之间的相互作用遏制破骨细胞形成[Ariyoshi等人,2008;Shinmyouzu等人,2007]。

因为破骨细胞生成主要是由造骨细胞产生的因子控制的（例如，RANKL），重要的是应该理解，造骨细胞特定的GAG是如何通过与RANKL的相互作用调节破骨细胞形成的。由造骨细胞合成和分泌的GAG附连到细胞表面上，且包含在作为具有变化的结构和活性种类的混合物的细胞外基质内[Haupt等人.,2009;Jackson等人.,2007]。GAG的完整性对维持造骨细胞的增殖和分化是重要的[Kumarasuriyar等人.,2009]。此外，骨来源的硫酸类肝素促进造骨细胞的增殖和分化，且它们的活性是由骨生成期间在不同的发育阶段上的结构变化调整的[Haupt等人.,2009;Jackson等人.,2007;Nurcombe等人.,2007]。这种GAG的混合物可有助于调节其中造骨细胞/破骨细胞共存在的微环境中的破骨细胞生成。

Ariyoshi等人（Heparin Inhibits Osteoclastic Differentiation and Function.Journal of Cellular Biochemistry 103:1707-1717(2008)）着眼于硫酸软骨素种类（非混合物）和分离的肝素对鼠单核细胞RAW 264.7细胞的影响。他们报道肝素（肝磷脂，heparin）抑制破骨细胞的分化和报道肝素结合到RANKL上。他们推断这种结合能力涉及破骨细胞形成和功能的抑制。他们也报道肝素遏制TRAP-阳性的多核的细胞形成和RANKL诱导的TRAP的活性，然而，其他GAG试验显示对破骨细胞分化没有影响。肝素也抑制再吸收陷窝（resorption pits）的形成，而其他GAG试验没有这种作用。他们推论肝素对RANKL诱导的破骨细胞生成的抑制的影响是由于肝素对RANKL的结合。

Atsushi Irie等人（Heparin enhances osteoclastic bone resorption byinhibiting osteoprotegrin activity.Bone 41(2007)165-174）报道肝素不能结合到RANK或RANKL上，表明肝素不能直接地与这些蛋白质中的任何一个相互作用。相反，他们报道肝素特定的结合到骨保护素（OPG）上，且在共培养中防止OPG-介导的破骨细胞骨再吸收的抑制。他们推论肝素是破骨细胞活化的强诱导剂，通过抑制OPG活性，不是RANKL的机制增强破骨细胞的骨再吸收。他们也报道OPG结合肝素，但是不结合硫酸软骨素或硫酸角质素。

Ariyoshi等人（Mechanisms Involved in Enhancement of OstoeclastFormation and Function by Low Molecular Weight Hyaluronic Acid.TheJournal of Biological Chemistry.Vol.280,No.19,May 13pp 18967-18972,2005）指示低分子量的透明质酸增强陷窝形成（例如，骨再吸收），而高分子量的透明质酸不能。

发明内容

本发明的一方面中，提供从哺乳动物造骨细胞获得的葡糖胺聚糖混合物。葡糖胺聚糖混合物可以是分离的或完全纯化的形式，例如，其中，合成物的葡糖胺聚糖含量是大约80％、90％、95％或更多中之一。

从其中获得葡糖胺聚糖混合物的造骨细胞可以是初级的造骨细胞。造骨细胞可以，或已经，维持在体外细胞培养中。从其中获得GAG混合物的培养的造骨细胞可以在，或已经在，融合性的或非融合性的细胞培养（非融合性的细胞培养基，non-confluent cell culture）中。

某些实施例中，造骨细胞来源的GAG混合物可以是可溶解的造骨细胞来源的GAG混合物，例如，通过从其中培养，或已经培养了造骨细胞的培养基（优选的液体、流体或凝胶培养基）中分离GAG片段获得，以便形成可溶解的造骨细胞来源的GAG混合物。

在琼脂糖CL-6B尺寸-排阻柱色谱中，可溶解的造骨细胞来源的GAG混合物可具有两个峰。

可溶解的造骨细胞来源的GAG混合物对RANKL可表现剂量依赖的结合。

可溶解的造骨细胞来源的GAG混合物可抑制RANKL诱导的破骨细胞形成。

可溶解的造骨细胞来源的GAG混合物可起作用来对抗RANKL对ERK活性的抑制作用。

可溶解的造骨细胞来源的GAG混合物可剂量依赖地增加，例如，体外培养中的造骨细胞的增殖。例如，与缺乏GAG混合物时的增殖相比，可溶解的造骨细胞来源的GAG混合物，在体外可通过至少1.2倍，更优选地至少1.4、1.6、1.8或2.0倍中的一个增强造骨细胞增殖。

与在不添加GAG混合物的情况下通过利用10ng/ml RANKL处理体外培养的RAW264.7细胞5天的破骨细胞的诱导相比，可溶解的造骨细胞来源的GAG混合物可减少由RANKL诱导的破骨细胞至少10％、20％、30％、40％、50％或60％、和达到70％中之一。

某些实施例中，造骨细胞来源的GAG混合物可以是细胞表面造骨细胞来源的GAG混合物，例如，通过连接到培养的造骨细胞上的GAG片段的分离而获得的GAG混合物。

在琼脂糖CL-6B尺寸-排阻柱色谱中，细胞表面造骨细胞来源的GAG混合物可只具有单一的峰。

细胞表面造骨细胞来源的GAG混合物对RANKL可表现剂量依赖的结合。

其中造骨细胞来源的GAG混合物可抑制RANKL诱导的破骨细胞的形成。

其中造骨细胞来源的GAG混合物可起作用以对抗RANKL对ERK活性的抑制作用。

细胞表面造骨细胞来源的GAG混合物可剂量依赖地增加，例如，体外培养中的，造骨细胞的增殖。例如，与缺乏GAG混合物时的增殖相比，可溶解的造骨细胞来源的GAG混合物增强在体外的造骨细胞增殖至少1.2倍，更优选地至少1.4、1.6、1.8或2.0倍中的一种。

与不添加GAG混合物时，通过利用10ng/ml RANKL处理体外培养的RAW264.7细胞5天进行的破骨细胞的诱导相比，细胞表面的造骨细胞来源的GAG混合物可减少RANK L的破骨细胞的诱导至少10％、20％、30％、40％、和达到45％中的一种。

本发明的造骨细胞来源的GAG混合物优选地含有硫酸类肝素（硫酸乙酰肝素，heparan sulfate）、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素和透明质酸的混合物中的至少两种构成的一种混合物。GAG混合物可只含有这些糖种类的每一个中的一种（例如，只有一种硫酸类肝素和/或只有一种硫酸软骨素和/或只有一种硫酸皮肤素和/或只有一种硫酸角质素和/或只有一种透明质酸），但是可替换地可以含有超过一种类型的这些糖种类的一种（例如，超过一种类型的硫酸类肝素和/或超过一种类型的硫酸软骨素和/或超过一种类型的硫酸皮肤素和/或超过一种类型的硫酸角质素和/或超过一种类型的透明质酸），并也可含有其他糖或多聚糖种类。优选地，GAG混合物不含有肝素（除了痕量的之外）。

本发明的进一步的方面，提供用于抑制破骨细胞生成，和/或增强造骨细胞的增殖，和/或治疗或预防骨折或骨退化的葡糖胺聚糖混合物。

因此，一方面，提供从哺乳动物造骨细胞获得的葡糖胺聚糖混合物，用于抑制哺乳动物破骨细胞生成。

另一方面，提供从哺乳动物造骨细胞获得的葡糖胺聚糖混合物，用于治疗和/或预防哺乳动物骨折或骨退化。

另一方面，提供从哺乳动物造骨细胞获得的葡糖胺聚糖混合物，用于增强哺乳动物造骨细胞增殖。

另一方面，提供从哺乳动物造骨细胞获得的破骨细胞生成葡糖胺聚糖混合物在制备用于抑制哺乳动物破骨细胞生成的药物中的应用。

另一方面，提供从哺乳动物造骨细胞获得的葡糖胺聚糖混合物在制备用于治疗和/或预防哺乳动物的骨折或骨退化的药物中的应用。

另一方面，提供从哺乳动物造骨细胞获得的葡糖胺聚糖混合物在制备用于增强哺乳动物造骨细胞的增殖的药物中的应用。

另一方面，提供在需要这样的治疗的哺乳动物中抑制破骨细胞生成的方法，所述方法包括将从哺乳动物造骨细胞获得的葡糖胺聚糖混合物给予哺乳动物。

另一方面，提供在需要这样的治疗的哺乳动物中治疗和/或防止骨折或骨退化的方法，所述方法包括将从哺乳动物造骨细胞获得的葡糖胺聚糖混合物给予哺乳动物。

另一方面，提供在需要这样治疗的哺乳动物中增强造骨细胞增殖的方法，所述方法包括将从哺乳动物造骨细胞获得的葡糖胺聚糖混合物给予哺乳动物。

所述方法和应用可包括将葡糖胺聚糖混合物给予哺乳动物的骨组织或给予哺乳动物的骨组织周围的组织。

另一方面，提供抑制破骨细胞生成的方法，所述方法包括将从哺乳动物造骨细胞获得的葡糖胺聚糖混合物给予体内或体外的破骨细胞、造骨细胞、破骨细胞前体细胞、和/或造骨细胞前体细胞。可在体外培养的细胞上进行所述方法。

另一方面，提供增强造骨细胞增殖的方法，所述方法包括将从哺乳动物造骨细胞获得的葡糖胺聚糖混合物给予体外或体内的造骨细胞和/或造骨细胞前体细胞。可在体外培养的细胞上进行所述方法。

本发明的进一步的方面，提供药物组合物或药物，依照上述描述的本发明的方面的任何一个，所述药物组合物和药物包括葡糖胺聚糖混合物。

可提供用于抑制哺乳动物破骨细胞生成，和/或治疗和/或预防哺乳动物骨折或骨退化，和/或增强哺乳动物造骨细胞的增殖的药物组合物或药物。

药物组合物或药物可包括造骨细胞来源的GAG混合物连同一种或更多种药学可接受的载体、佐剂或稀释剂。

具体实施方式

受细胞外的葡糖胺聚糖（GAG）控制的造骨细胞和破骨细胞的活性，通过它们与内生的生长因子的相互作用，紧密地调节骨骼完整性。RANKL，破骨细胞形成关键的生长因子，是由造骨细胞产生的且进一步由某些类型的GAG调整。代替探查单一种类的GAG能如何改变破骨细胞的形成，我们分离出造骨细胞来源的GAG的集合，我们相信其更充分地代表其中破骨细胞居于其内的组织微环境，以及证明这些GAG阻碍RANKL的破骨细胞生成活性。此外，我们观察到RANKL显著地降低ERK活性，一种假定的破骨细胞生成的抑制物；然而造骨细胞来源的GAG消除RANKL对ERK活性的抑制作用。特别地，同时施加抗-破骨细胞影响，这些GAG也增强造骨细胞的增殖。因此，造骨细胞微环境看起来含有有利于骨合成代谢活性的GAG来源。此外，这些GAG的抗-破骨细胞生成活性可提供骨质减少/骨质疏松症的治疗有用的治疗手段。

我们从造骨细胞的细胞表面提取和那些分泌到介质中的可溶解形式的GAG。然后检测它们对RANKL的结合亲和力和对RANKL诱导破骨细胞分化的影响。为了减少内生的RANKL活性潜在污染的影响，我们使用缺乏RANKL或OPG表达但是仍然对外生的RANKL刺激做出响应的和拥有破骨细胞生成潜在性的破骨细胞前体细胞（RAW264.7）[Fuller等人,1998；Hsu等人,1999；Yasuda等人,1998]。我们的研究证明从造骨细胞分离的GAG对RANKL具有亲和力和通过调整ERK活性显著地抑制RANKL-诱导的破骨细胞生成。这些发现表明造骨细胞产生细胞外高分子，从而调整破骨细胞活性。此外，这些造骨细胞来源的GAG的抗-破骨细胞的活性支持作为治疗具有异常升高的RANKL/破骨细胞活性的骨紊乱的物质的它们的进一步发展。

本发明的葡糖胺聚糖混合物提供用于治疗骨损失的疾病的葡糖胺聚糖的来源。代表性地使用一类防止骨块（mass）损失的药物双膦酸酯，和用于治疗骨质疏松症和相似的疾病。

代表性地骨具有持续的更新（周转，turnover，且通过造骨细胞制造骨和破骨细胞消化骨来保持平衡（动态平衡）。双膦酸酯抑制破骨细胞的骨消化。破骨细胞也具有持续的周转更新（周转），且通常通过称作细胞自杀（凋亡）的程序破坏它们自己。双膦酸酯促进破骨细胞经历凋亡。我们发现，GAG的来源，如双膦酸酯，抑制破骨细胞发展，但是重要地，不抑制造骨细胞，因而结果是改善骨骼块。

双膦酸酯的应用包含预防和治疗骨质疏松症、畸形性骨炎（“骨佩吉特氏病”）、骨转移（具有或没有高钙血症）、多发性骨髓瘤、原发甲状旁腺功能亢进、成骨不全症（osteogenesis imperfecta）和其他呈现骨脆弱特征的情形。

造骨细胞来源的GAG混合物

本发明涉及从造骨细胞获得的或可从造骨细胞获得的葡糖胺聚糖混合物，并具体地涉及这种造骨细胞来源的GAG混合物对抑制破骨细胞生成、和/或增强造骨细胞的增殖、和/或治疗或预防骨折或骨退化的应用。可提供分离的或充分地纯化的形式的造骨细胞来源的GAG混合物。

依照本发明，造骨细胞来源的GAG混合物的充分纯化形式可包括其中由造骨细胞来源的葡糖胺聚糖混合物组成的至少80％的葡糖胺聚糖成分的合成物。更优选地，这将是至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％中的一种。

可提供充分地分离的形式的造骨细胞来源的GAG混合物，或可作为包括其他成分的合成物的部分，例如，药物学上可接受的载体佐剂或稀释剂。

优选地从哺乳动物造骨细胞获得造骨细胞来源的GAG混合物，更优选地从人类或非人类哺乳动物的造骨细胞获得（例如，兔、豚鼠、褐家鼠、鼠或其他啮齿动物（包含啮齿动物目的任何动物））、猫、狗、猪、羊、山羊、牛（包含母牛，例如，奶牛、或牛属目的任何动物）、马（包含马科动物目的任何动物）、驴子、和非人类的灵长类动物。

造骨细胞可以是初级（初代）造骨细胞和可维持在体外细胞培养中。造骨细胞可培养在融合性的或非融合性的细胞培养基中。

可以三种方式中的一种获得造骨细胞来源的GAG混合物：

1.从其中培养造骨细胞的培养基中分离GAG片段，以便形成“可溶解的造骨细胞来源的GAG混合物”。

2.从附连到培养的造骨细胞细胞培养物中分离GAG片段，以便形成“细胞表面造骨细胞来源的GAG混合物”。

3.从培养的造骨细胞分离细胞外基质GAG片段，以便形成“细胞外基质造骨细胞来源的GAG混合物”。

可通过从培养的造骨细胞中清除培养基，然后从培养基中清除细胞和其他碎片，和将剩余的含有GAG的片段经历阴离子交换层析（例如，在50mM PBS中利用250mM NaCl（低盐缓冲液）平衡的CaptoQ-琼脂糖柱上），获得可溶解的造骨细胞来源的GAG混合物。在洗脱液中通过酶处理可可选地从蛋白多糖中释放葡糖胺聚糖（例如，通过利用唾液酸苷酶（0.1U）处理4h，之后进一步利用10mg/ml链霉蛋白酶（500mM Tris-醋酸盐、50mM乙酸钙，pH8.0）和5体积100mMTris-醋酸盐（pH8.0）在37℃下消化24h），之后可选地进一步分离释放的葡糖胺聚糖（例如，如上述描述的，通过利用低盐缓冲液1：10的稀释，和层析分离，例如，通过CaptoQ-琼脂糖层析柱（50ml）和葡糖胺聚糖的洗脱）。

可通过形成培养的造骨细胞的溶液、裂解细胞、收集裂解产物和通过阴离子交换层析（例如，在50mM PBS中利用250mM NaCl（低盐缓冲液）平衡的CaptoQ-琼脂糖柱上）提取GAG片段获得细胞表面造骨细胞来源的GAG混合物。在洗脱液中通过酶处理可选地从蛋白多糖中释放葡糖胺聚糖（例如，通过利用唾液酸苷酶（0.1U）处理4h，之后进一步利用10mg/ml链霉蛋白酶（500mMTris-醋酸盐、50mM乙酸钙，pH8.0）和5体积100mMTris-醋酸盐（pH8.0）在37℃下消化24h），之后可选地进一步分离释放的葡糖胺聚糖（例如，如上述描述的，通过利用低盐缓冲液1：10稀释，和层析分离，例如，通过CaptoQ-琼脂糖层析柱（50ml）和葡糖胺聚糖的洗脱）。

能根据它们结构的性能表现本发明的造骨细胞来源的GAG混合物的特征。例如，在琼脂糖CL-6B尺寸-排阻柱色谱中，可溶解的造骨细胞来源的GAG混合物可具有两个峰，而细胞表面的造骨细胞来源的GAG混合物只具有单一的峰。

也能根据它们的功能的性能表现本发明的造骨细胞来源的GAG混合物的特征。

例如，当5μgGAG混合物预结合到结合板上时，可溶解的和/或细胞表面的造骨细胞来源的GAG混合物可（优选地分别和单独地）对RANKL表现剂量依赖的结合（10到150ng/ml）。

如通过体外RAW264.7细胞分化成TRAP-阳性的多核的破骨细胞的测量，可溶解的和/或细胞表面造骨细胞来源的GAG混合物也可（优选地分别和单独地）抑制RANKL诱导的破骨细胞形成（例如，在5μg/ml的浓度上）。

与缺乏附加的GAG混合物时，利用10ng/ml RANKL处理RAW264.7细胞5-天的破骨细胞的诱导相比，可溶解的造骨细胞来源的GAG混合物可通过达到70％，和优选地通过10％、20％、30％、40％、50％或60％的至少一个减少RANKL的破骨细胞的诱导。

与缺乏附加的GAG混合物时，利用10ng/ml RANKL处理RAW264.7细胞5-天的破骨细胞的诱导相比，细胞表面的造骨细胞来源的GAG混合物可通过达到45％，和优选地通过10％、20％、30％、40％、50％或60％的至少一种减少RANKL的破骨细胞的诱导。

可溶解的和/或细胞表面的造骨细胞来源的GAG混合物也可（优选地分别和单独地）对抗RANKL对ERK活性的抑制的影响。

可溶解的和/或细胞表面造骨细胞来源的GAG混合物也可（优选地分别和单独地）剂量-依赖地增加，例如，体外培养中的造骨细胞的增殖。例如，与缺乏GAG混合物时的增殖相比，可溶解的和/或细胞表面造骨细胞来源的GAG混合物每一个（和分别地）能优选地通过至少1.2倍，更优选地至少1.4、1.6、1.8或2.0倍中的一个增强体外造骨细胞的增殖。

蛋白多糖

蛋白多糖通常代表严重地使蛋白质糖基化的糖蛋白的特殊一类。它们由核心蛋白和一个或更多共价地附着的葡糖胺聚糖（GAG）链组成。这些葡糖胺聚糖链是长的、线性的碳水化合物聚合物，由于硫酸和糖醛酸基团的出现，聚合物在生理学的情形下带有阴性电荷。蛋白多糖是动物细胞外基质的主要成分。在那里，蛋白多糖与其他蛋白多糖和也与纤维状基质蛋白（如胶原质）形成大的联合体。它们也与结合阳离子（如钠、钾和钙）和水有关，以及也通过基质调节分子的运动。证据也显示它们能改变基质内蛋白质和信号分子的活性和稳定性。蛋白多糖的单独的功能能归因于蛋白质核心或附着的GAG链。

示出了结合到细胞外基质的蛋白多糖上的生长因子，以便调整体外和体内的人类干细胞的分化和增殖。这些生长因子通过与特殊的质膜受体激酶相互作用发送信号，相互作用可涉及蛋白多糖结合。然而，现有的利用生长因子的方法，如FGF，在刺激干细胞增殖时具有缺点，生长因子附加的导致干细胞多向分化潜能重要的损失。与此相反和令人惊奇的是，依照本发明的方法获得的观察到的增殖的增加伴随干细胞的多向分化潜能的保存。

依照本发明能使用的蛋白多糖，即使在某些优选的实施例中它们可不如相应的葡糖胺聚糖一样方便的使用，因为发现了更容易操作的糖链，例如更小的和更稳定的、更可溶的和较少的妨碍，例如与细胞外基质的相互作用。因此，与蛋白多糖相比，每微克葡糖胺聚糖可具有增加的生物活性。

葡糖胺聚糖

如此处应用的，术语“葡糖胺聚糖”和“GAG”可交替地使用和应该理解涉及包括低聚糖的分子的大集合，其中那些连接（cojoined）的糖类的一种或更多种具有氨基取代基，或它的衍生物。GAG的实例是硫酸软骨素、硫酸角质素、肝素、硫酸皮肤素、透明质酸盐和硫酸类肝素。

期望本发明的GAG混合物含有硫酸类肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素和透明质酸的至少两种的混合物。GAG混合物可含有超过一种的这些糖类的一种类型，也可含有其他糖或多聚糖类。优选地，GAG混合物不含有肝素（除了痕量的之外）。

如此处应用的，术语“GAG”也延伸到包括那些GAG结合物的分子。GAG结合物的实例是蛋白质葡糖胺聚糖（PGAG，蛋白多糖），其中肽成分共价地结合到低聚糖成分上。

本发明中，应该理解，存在很多包含天然的、合成的或半合成的GAG化合物的来源。优选的GAG来源是生物组织，具体的是造骨细胞，例如，哺乳动物造骨细胞，例如，人类或非人类（例如，兔、豚鼠、褐家鼠、鼠或其他啮齿动物（包含啮齿动物目的任何动物）、猫、狗、猪、羊、山羊、牛（包含母牛，例如，奶牛、或牛属目的任何动物）、马（包含马科动物目的任何动物）、驴子、和非人类的灵长类动物）哺乳动物造骨细胞。

也可从合成来源获得GAG。在这方面，通过本领域技术人员已知的、或可想像的技术，将商业上可用的原料合成的加工成更复杂的化学形式获得GAG。这种商业上可用的原料的实例是葡糖胺。另一个优选的GAG的来源是半合成的来源。在这方面，使用本领域技术人员已知的、或可想像的技术，合成地加工拥有很多复杂的期望的材料合成的加工的天然原料。这种天然原料的实例是几丁质和葡聚糖，和可将原料加工成适用于本发明的GAG混合物的合成步骤的类型的实例是酰胺键水解、氧化和硫酸化作用。期望的结构的GAG的半合成路线的另一个实例包括有关的GAG的合成的互换作用，以便获得适用于本发明的GAG。

硫酸类肝素是一种类型的葡糖胺聚糖。

硫酸类肝素蛋白多糖（HSPGs）代表蛋白多糖高度变化的亚组，且由共价附连到蛋白质骨架上的硫酸类肝素葡糖胺聚糖侧链组成。核心蛋白以三种主要的形式存在：被称为基底膜蛋白（perlecan）的分泌的形式、被称为磷脂酰肌醇蛋白聚糖（glypican）的锚定于质膜中的形式，和被称为多聚体蛋白聚糖（syndecan）的横跨膜的形式。它们是普遍存在的哺乳动物细胞表面和大多数细胞外基质的成分。存在其他蛋白质如人集聚蛋白（agrin）、或淀粉质前体蛋白，其中HS链可附连到通常较少发现的核心上。

“硫酸类肝素”（“硫酸类肝素”或“HS”）最初在高尔基体中作为由D-葡萄糖醛酸（GIcA）和N-乙酰-D-葡萄糖胺（GIcNAc）串联重复组成的多聚糖而合成。随后可以一连串的步骤修饰初期的多聚糖：GIcNAc的N-脱乙酰作用N-硫酸化、GIcA到艾杜糖醛酸（iduronic acid）（IdoA）的C5差向异构化（epimerisation）、IdoA和GIcA的C2上的O-硫酸化、N-葡萄糖磺酰胺（N-sulphoglucosamine）（GlcNS）的C6上的O-硫酸化和GlcNS的C3上的偶然的O-硫酸化。分别由HS N脱乙酰基转移酶N-硫酸化转移酶（HSNDST）、HS 2-O-硫酸化转移酶（HS2ST）、HS 6-O-硫酸化转移酶（HS6ST）和HS 3-O-硫酸化转移酶的特殊作用介导N-脱乙酰化N-硫酸化、HS的2-O-、6-O-和3-O硫酸化。每一个修饰步骤，只修饰潜在酶作用底物的片段，导致相当大的序列差异性。HS的这种结构复杂性使得很难测定它的序列和很难了解HS结构和功能之间的关系。

硫酸类肝素侧链由可替换排列的D-葡萄糖醛酸或L-艾杜糖醛酸和D-葡萄糖胺，通过（1->4）糖苷键连接组成。常常N-乙酰化或N-硫酸化葡萄糖胺，以及可附加地O-硫酸化糖醛酸和葡萄糖胺两者。由附连到葡萄糖胺和糖醛酸上的羧基、乙酰基和硫酸基团的特殊形式建立关于具体的结合伴侣具体的HSPG的特异性。和肝素形成对比，硫酸类肝素含有较少的N-和O-硫酸盐基团和更多的N-乙酰基团。硫酸类肝素侧链通过四糖连接（-10葡萄糖醛酸-p-(1→3)-半乳糖基-p-(1→3)-半乳糖基-p-(1→4)-木糖基（xylosyl）-P-1-0-(丝氨酸)）区域连接到核心蛋白的丝氨酸上。

硫酸类肝素和核心蛋白两者都可经历一系列可最终影响它们的生物活性的修饰。认为HS的复杂性超过核酸的复杂性（Lindahl等人,1998,J.Biol.Chem.273,24979;Sugahara and Kitagawa,2000,Curr.Opin.Struct.Biol.10,518）。由非随机的合成、高度地硫酸化的糖残基序列而产生HS种类的变化，糖残基被含有N-乙酰基化的葡萄糖胺的二糖的未硫酸化的区域隔开。N-乙酰氨基葡萄糖到N-硫酸葡萄糖的最初的变化创造对其他修饰的注视，包含葡萄糖醛酸到艾杜糖醛酸的差向异构作用和葡萄糖胺或艾杜糖醛酸上的O-硫酸化的复杂的形式。另外，非-修饰的、低硫酸化的、N-乙酰化的序列内，己糖醛残基（hexuronate residues）仍然是葡糖醛酸，然而高度地硫酸化的N-硫酸化的区域中，C-5差向异构体艾杜糖成为主流。这可能以任何特定的链但是每一个都不丰富的形式限制潜在的二糖变体的数目。在N-硫酸化的结构域中，或直接地邻近它们，发生大多数的修饰，所以成熟的链中存在由低硫酸化作用的结构域分离的高硫酸化作用的区域（Brickman等人.(1998),J.Biol.Chem.273(8),4350-4359,其全部内容包括在此以供参考）。

假设高度可变的硫酸类肝素链在很多细胞外配体动作的调节中扮演重要的角色，包含通过自分泌（autocrine）、邻分泌和旁分泌反馈回路的复杂的组合，细胞生长和粘连因子的调节和表达，因而控制细胞内的信号运输和因此控制干细胞的分化。例如，即使可遗传上的描述硫酸类肝素葡糖胺聚糖（Alberts等人.(1989)Garland Publishing,Inc,New York & London,pp.804and 805），从单一来源分离的硫酸类肝素葡糖胺聚糖种类可在生物活性方面具有差异。如Brickman等人,1998,Glycobiology 8,463中示出的，依靠促有丝分裂状态，从神经上皮细胞获得的硫酸类肝素葡糖胺聚糖的两个单独的集合能特定地刺激FGF-1或FGF-2。同样地，在WO96/23003中描述硫酸类肝素（HS）与FGF-1或FGF-2相互作用的能力。依照本专利申请，能够与FGF-1相互作用的相应的HS可从大约11到大约13天的胚胎上的鼠细胞获得，然而，能够与FGF-2相互作用的HS可从大约8到大约10天的胚胎上获得。

如上述说明的，HS结构高度地复杂的且HS之间是可变性。事实上，认为HS结构中的变化在促进细胞生长和指引细胞分化中在每一个HS的不同活性方面扮演重要的部分。认为结构复杂性超过核酸的结果的复杂性和虽然HS结构可表征为具有特殊的和独特的硫酸化形式的重复的二糖单元的序列，目前，相当于那些核酸排序可用的非标准的测序技术可用于测定HS序列结构。在缺乏测定权威性的HS序列结构的简单方法时，本领域的技术工人通过许多分析技术正面鉴定和在结构上表征HS分子。这些包含二糖分析、四糖分析、HPLC和分子量测定的一个或更多的组合。这些分析技术是本领域技术人员已知和使用的。

两种用于从HS生产二糖和四糖的技术包含亚硝酸消化和裂解酶消化。下面提供执行这些消化技术的一种方式的描述，完全地经过实例，这种描述不限制本发明的范畴。

亚硝酸消化

基于亚硝酸的硫酸类肝素的解聚作用导致当完成时碳水化合物最终降解成它的单独的二糖成分。

例如，可通过在冰上分别冷却250μl 0.5M H₂SO₄和0.5M Ba(NO₂)₂15min制备亚硝酸。冷却之后，Ba(NO₂)₂与H₂SO₄结合且在离心之前涡旋以便清除硫酸钡沉淀物。将125μl HNO₂加入到20μl H₂O悬浮的GAG样品中，并在25℃孵育15min之前涡旋用于临时混合。在孵育之后，将1MNa₂CO₃加入到样品中，使得pH达到pH 6。接下来，将0.15M NaOH中的100μl 0.25M NaBH₄加入到样品中且将混合物加热到50℃持续20min。然后将混合物冷却到25℃，加入使酸化的冰冷的醋酸，使得样品pH达到pH 3。然后利用10M NaOH中和混合物，且通过冷冻干燥减少体积。在Bio-Gel P-2柱上运行最终的样品，以便分离二糖和四糖，从而检验降解的程度。

裂解酶消化

肝素酶Ⅲ在葡萄醛酸连接键（glucuronidic linkages）上分解糖链。通过在具体的硫酸盐化作用识别位点上解聚某些硫酸类肝素序列，系列的肝素酶（Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ）每一个都显示相关地特殊活性。肝素酶Ⅰ利用沿着HS链的NS区域分解HS链。这导致硫酸盐化结构域的破坏。肝素酶Ⅲ利用NA结构域解聚HS，引起碳水化合物链分离成单个的硫酸盐化的结构域。肝素酶Ⅱ主要在HS链的NA/NS“突出部分”分解，其中发现多样化的硫酸盐化作用模式。注意：乙酰肝素聚合体的重复的二糖骨架是连接到氨基糖葡萄糖胺上的糖醛酸。“NS”意味着在能够使其他基团在C2、C6和C3上硫酸盐化作用的氨基上运输硫酸盐的氨基糖。“NA”指示不能硫酸化并且保留乙酰化的氨基。

例如，对于使用肝素酶Ⅲ两种酶在NA区域解聚化和在含有20mMTris-HCL、0.1mg/mlBSA和4mM CaCl₂pH7.5的缓冲液中制备冻干的HS样品。完全借助于实例，在每1μg HS中加入5mU的肝素酶Ⅲ且在37℃孵育16h，在终止反应之前将反应加热到70℃5min。

可以通过柱层析洗脱二糖和四糖。

医学的应用

各自（分别地，但是可选地结合）提供用于一个或更多抑制破骨细胞生成、增强造骨细胞增殖、和/或治疗或预防骨折或骨退化的本发明的造骨细胞来源的GAG混合物。如可提供这样的用于医学治疗的方法的本发明的造骨细胞来源的GAG混合物。治疗可涉及将造骨细胞来源的GAG混合物，或包括制品或合成物给予需要这样治疗的病人。

破骨细胞生成的预防

本发明的造骨细胞来源的GAG混合物（可溶解的和/或细胞表面的）可用于减少或抑制破骨细胞生成和/或骨再吸收的过程。

破骨细胞生成是通过其破骨细胞形成的过程，通常通过骨髓基质细胞和造血破骨细胞前体之间的相互作用形成破骨细胞。

发明人已经发现可溶解的和细胞表面的造骨细胞来源的GAG混合物各自（分别地）能够减少破骨细胞生成的过程，因此具有抗-骨质疏松效果。

骨形成的促进（造骨细胞生成作用）

发明人还发现可溶解的和细胞表面的造骨细胞来源的GAG混合物各自（分别地）能够促进造骨细胞的增殖，其是骨形成必不可少的。示出它们通过有利的造骨细胞新生作用而对抗破骨细胞生成，各自（分别地）改变骨重建向骨形成的平衡。

骨折和骨退化

因此，某些方面，本发明牵涉到本发明的造骨细胞来源的GAG混合物（可溶解的和/或细胞表面的造骨细胞来源的GAG混合物，各自分别地和单独地，尽管可选地结合）治疗的应用，以便治疗或预防骨折和/或骨退化。

造骨细胞来源的GAG混合物各自刺激造骨细胞增殖和抑制破骨细胞生成。

骨折是医学情形。本申请中“骨折”包含其中骨是破碎、断裂或碎裂的对骨的损害或伤害。断裂涉及骨的中断。骨折可由物理碰撞、或机械应力或由医学情形如骨质疏松症或骨关节炎引起。

骨折的整形外科分类包含封闭式或开放式和单纯的或多块骨折。封闭式骨折中，皮肤仍然是完整无缺的，同时开放式骨折中，可通过创伤部位暴露骨，其引起更高的感染的风险。单纯骨折沿着单一的线发生，倾向于将骨分为两部分。多块骨折将骨分成多个部分。

其他骨折类型包含，压缩性骨折（compression fracture）、嵌插骨折（compacted fracture）、螺旋骨折（spiral fracture）、完全和不完全骨折、横向的、线性的和倾斜的骨折和粉碎性骨折。

大多数受试者中，骨康复（骨折联合）自然地发生，且在伤害之后开始。出血通常导致白血细胞和纤维原细胞的凝结和吸引，跟随的是胶原纤维的产生。这之后是骨基质（钙羟磷灰石）沉积物（矿化作用）将胶原基质转变成骨。不成熟的再生的骨通常比成熟的骨脆弱，并随着时间的推移，不成熟的骨经历重建的过程，以便产生成熟的“层状的”骨。完全的骨康复过程需要相当长的时间，代表性地几个月。

其中发生骨折或退化，和其可受益于使用本发明的造骨细胞来源的GAG混合物治疗的骨包括所有的骨类型，具体的是所有哺乳动物的骨，包括但不限于，长骨（例如，大腿骨、肱骨、趾骨）、短骨（例如，腕骨、跗骨）、扁骨（例如，头盖骨、肋骨、肩胛骨、胸骨、盆带骨（pelvic girdle））、不规则骨（例如，椎骨）、籽骨（例如，膝盖骨）。

其中发生骨折或退化，和其可受益于使用本发明的造骨细胞来源的GAG混合物治疗的骨包括骸骨（例如，骨架的任何骨）、颅面区域的骨、中轴骨骼（axial skeleton）的骨（例如，椎骨、肋骨）、四肢骨（例如肢骨）、骨盘骨骼的骨（例如，骨盆）。

其中发生骨折或退化，和其可受益于使用本发明的造骨细胞来源的GAG混合物治疗的骨包括头（头骨）和脖子的那些，包括面部的那些如颚、鼻和颊。

骨折或骨退化也包含病理性孔隙度（pathological porosity），如患有骨质疏松症或其他形式的骨再吸收的受试者表现的那些。

也提供用于预防和/或治疗一种或更多：骨质疏松症、溶骨性转移骨痛（lytic bone metastases）、风湿性关节炎、绝经后的骨质疏松症、糖皮质激素-诱导的骨质疏松症、多发性骨髓瘤关联的溶骨性病变、动脉粥样硬化疾病关联的脉管石灰化、骨质减少、具有异常升高的RANKL/破骨细胞活性的骨紊乱，或联合这些情形的任何一种的骨退化的造血细胞来源的GAG混合物（可溶解的和/或细胞表面的造骨细胞来源的GAG混合物，各自分别地和单独地，尽管可选地结合）。

也提供用于预防和/或治疗骨质疏松症、畸形性骨炎（骨的佩吉特氏病）、骨转移（具有或没有血钙过多）、多发性骨髓瘤、原发性甲状旁腺功能亢进、成骨不全症和其他表现骨脆弱的情形的造骨细胞来源的GAG混合物（可溶解的和/或细胞表面的造骨细胞来源的GAG混合物，各自分别地和单独地，尽管可选地结合）。

尽管不限于本发明，本发明的造骨细胞来源的GAG混合物的初级作用可以是在伤口位置内、邻近、或引起移动到伤口位置的细胞上，并且可以是在骨干细胞、前造骨细胞、造骨细胞、破骨细胞上，和在发现的或引起移动到伤口层或伤口层内的任何辅助的或血管性的细胞上，以及在RANK、RANKL或OPG上。

提供用于哺乳动物受试者骨折或骨退化的治疗方法的本发明的每一种造骨细胞来源的GAG混合物和包括本发明的一种或更多造骨细胞来源的GAG混合物的药物组合物和药物。

治疗可包括骨中的伤口康复。治疗可涉及骨的修补、再生和生长。治疗可涉及骨再吸收的抑制。

治疗也可包括骨质疏松症或骨关节炎的治疗和/或预防。

造骨细胞来源的GAG混合物优选地给予骨折周围的组织。这可包括直接地给予其中发生骨折或退化的骨组织。可以给予骨或骨折周围的结缔组织或给予靠近骨和供给骨的脉管系统（例如，血管）。可以直接地给予创伤处并且可以给予由伤口的最初康复形成的骨痂。

依照本发明配制用于通过多种途径给药的药物和药物组合物。最优选的造骨细胞来源的GAG混合物配制成用于注射的流体或液体形式。

某些实施例中，造骨细胞来源的GAG混合物配制成可控释放形式，例如，用于在伤口位置植入的药物胶囊形式。造骨细胞来源的GAG混合物可附着到、浸渍在或渗入到载体材料（例如，生物材料）如纳米纤维或生物可降解的纸或纺织品中。

给药优选的是以“治疗有效量”，与相应的未治疗的骨折相比，这足以改善骨折的康复。给予的实际的量，和给药的速度和时间过程，将依赖骨折的种类和严重性。治疗的处方，例如，剂量确定等，是在全科医师和其他医学医生的职责内，并将代表性地考虑骨折的种类、个别病人的情形、运送的位置、给药的方法和医师已知的其他因素。依照执业医师的指导，可给予造骨细胞来源的GAG混合物的剂量的单次的或多次给药。完全借助于实例，可以至少1ng/ml的剂量的形式，更优选地至少5ng/ml和可选地10ng/ml或更多运送造骨细胞来源的GAG混合物。个别的剂量可以是少于1mg和大于1μg的等级，例如，大约5μg、大约10μg、大约25μg、大约30μg、大约50μg、大约100μg、大约0.5mg、或大约1mg中的一种。能在Remington's Pharmaceutical Sciences,20th Edition,2000,pub.Lippincott,Williams & Wilkins中找到上述提及的技术和治疗方案的实例。

造骨细胞来源的GAG混合物可用于与其他治疗一起，治疗骨折或骨退化，如减轻疼痛或抗炎症药物的给药、骨的固定和稳定，例如，在石膏绷带中固定受伤的肢，例如，以便使骨复位或移动骨以便正确地转移、形成角度或脱臼的外科干预。如果外科是必需的，在外科手术期间，造骨细胞来源的GAG混合物可直接地给予（例如，应用于）骨折。

生物材料

本发明的药物组合物和药物可采取利用造骨细胞来源的GAG混合物在生物材料上涂敷和/或浸渍的形式。植入物或假体可由生物材料组成。这种植入物或假体可通过外科手术植入，以便帮助骨生长、再生、重组和/或重建。

造骨细胞来源的GAG混合物可应用于植入物或假体，以便在期望的位置上加速新的骨形成和/或防止进一步的骨退化。应理解，葡糖胺聚糖，不同于蛋白质，是尤其结实的并具有更好的经受（抵抗，withstand）用于制造合成的生物支架和应用于植入物和假肢所需的溶剂的能力。

生物材料可涂覆或者浸渍造骨细胞来源的GAG混合物。浸渍可包括，通过例如在聚合期间将造骨细胞来源的GAG混合物与生物材料的构成成分一起混合，或将造骨细胞来源的GAG混合物吸附入生物材料，来形成生物材料。涂覆可包括将造骨细胞来源的GAG混合物吸附到生物材料表面上。

生物材料应该允许所涂覆或浸渍的造骨细胞来源的GAG混合物在给予或植入受试者中时从生物材料上释放。可通过改变生物材料的结构，例如多孔性，改变生物材料的释放动力学。

除了利用造骨细胞来源的GAG混合物涂在生物材料上或浸渍在生物材料上之外，一种或更多种生物活性分子可浸渍或涂在生物材料上，例如，至少一种选自由：BMP-2、BMP-4、OP-1、FGF-1、FGF-2、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、VEGF、胶原质、层粘连蛋白（laminin）、纤维蛋白、玻璃体结合蛋白组成的组。除了上述生物活性分子之外或可替换上述生物活性分子，一个或更多双膦酸酯连同造骨细胞来源的GAG混合物可浸渍或涂覆在生物材料上。有用的双膦酸酯的实例可包含至少一种选自由羟乙磷酸盐（etidronate）、氯膦酸盐（clodronate）、阿仑磷酸盐（阿屈膦酸盐，alendronate）、帕玛二磷酸（pamidronate）、利塞膦酸盐（risedronate）、唑来磷酸（zoledronate）组成的组。

涂覆或浸渍造骨细胞来源的GAG混合物的生物材料在医学和兽医目的中可以是有用的。应该理解，本发明可改善病人的生活质量或潜在地延长动物的生命，例如，饲养的有价值的赛马。

生物材料提供支架或基质支撑。生物材料可适于植入组织中，或可适于给药（例如，作为溶液中的微胶囊）。

植入物或假肢应该是生物适合的，例如，无毒的和低免疫原的（最优选的非-免疫原的）。生物材料可以是生物可降解的，以至于随着伤口康复发生生物材料的降解，最终在受试者原位置中只留下再生的骨。可替换地非生物可降解的生物材料可用于例如，在大的中断上引导骨的再生和/或在骨康复期间担当结构性支撑物，在伤口成功愈合之后，手术去除生物材料成为可选的需要。

生物材料可以是柔软的和/或柔性（弹性）的，例如，水凝胶、纤维网或网丝、或胶原海绵。“水凝胶”是当有机聚合体（其可以是天然的或合成的）固定或凝固时形成的物质，以产生诱捕水或其他溶液的分子的三维开放的栅格结构从而形成凝胶体。能通过聚合、凝结、疏水相互作用或交联发生凝固。

可替换地生物材料可以是例如，由固体材料如塑料或生物惰性金属如钛形成的相对刚性的结构。

生物材料可具有可由交联的聚合物提供的多孔基质结构。基质优选能渗透骨生长需要的营养素和生长因子。

可利用适当的交联剂，例如，钙盐、聚丙烯酸、肝素，通过交联纤维，例如，纤维蛋白或胶原质，或藻酸钠、壳聚糖的液体膜、或其他多聚糖，形成基质结构。可替换的支架可以形成作为利用本领域技术人员已知的方法交联的、由胶原质或藻酸盐制作的凝胶体。

用于基质形成的合适聚合体材料包含，但不限于，生物可降解的/生物再吸收的聚合体，其可选自：琼脂糖、胶原质、纤维蛋白、壳聚糖、聚己内酯、聚（DL-丙交酯-共-己内酯）、聚（L-丙交酯-共-己内酯-共-乙交酯）、聚乙醇酸交酯（polyglycolide）、聚交酯、聚羟基脂肪酸酯（polyhydroxyalcanoates）、它的共聚物，或非生物可降解的聚合体，其可选自：醋酸纤维素、丁酸纤维素、藻酸盐、聚砜树脂（polysulfone）、聚氨酯、聚丙烯腈、磺化聚砜（sulfonated polysulfone）、聚酰胺、聚丙烯腈、聚甲基丙烯酸甲酯、它的共聚物。

由于胶原质的生物兼容性和支撑细胞附件和功能的有利性能，胶原质是用于基质构造的有前途的材料（美国专利号5,019,087;Tanaka,S.;Takigawa,T.;Ichihara,S.& Nakamura,T.Mechanical properties of thebioabsorbable polyglycolic  acid-collagen nerve guide tube PolymerEngineering & Science 2006,46,1461-1467）。临床上可接受的胶原海绵是基质的一个实例并是本领域已知的（例如，来自Integra Life Sciences公司）。

纤维蛋白支架（例如，纤维蛋白胶）提供可替换的基质材料。作为伤口密封剂，运送生长因子的贮存剂和作为生物植入物的安置和固定的助剂的纤维蛋白胶（glue具有普遍的临床应用（Rajesh Vasita,Dhirendra S Katti.Growth factor delivery systems for tissue engineering:a materials perspective.Expert Reviews in Medical Devices.2006;3(1):29-47;Wong C,Inman E,Spaethe R,Helgerson S.Thromb.Haemost.200389(3):573-582;Pandit AS,Wilson DJ,Feldman DS.Fibrin scaffold as an effective vehicle for the deliveryof acidic growth factor(FGF-1).J.Biomaterials Applications.2000;14(3);229-242;DeBlois Cote MF.Doillon CJ.Heparin-fibroblast growth factorfibrin complex:in vitro and in vivo applications to collagen based materials.Biomaterials.1994;15(9):665-672.）。

Luong-Van et al (In vitro biocompatibility and bioactivity ofmicroencapsulated heparan sulphate Biomaterials 28(2007)2127-2136），包括在此以供参考，描述了来自聚己内酯微胶囊的HS的长时间的局部的运送。

生物材料的进一步的实例是结合羟磷灰石或透明质酸的聚合物。

适于与造骨细胞来源的GAG混合物结合的生物材料的一个实例是JAX^TM骨空隙填料（Smith & Nephew）。Jax颗粒由高纯度的硫酸钙组成，并保持它们的形状，以提供具有可控的、粒间的多孔性和颗粒移动稳定性的支架。Jax颗粒在体内安全地和完全地溶解。

其他适当的生物材料包含陶瓷或金属（例如，钛）、羟磷灰石、磷酸三钙、去除矿物质的骨基质（DBM）、自体移植物（例如，来源于病人的组织的移植物）、同种异体移植物（来源于不是病人的动物的组织的移植物）。生物材料可以是合成的（例如，金属、纤维蛋白、陶瓷制品）或生物的（例如，由动物组织，例如非人类哺乳动物（例如，母牛、猪），或人类的组织制造的载体材料）。

生物材料能补充附加的细胞。例如，人们能用未分化的骨前体细胞，例如，干细胞如间充质干细胞，更优选的人类间充质干细胞“接种”生物材料（或共合成它）。

治疗的受试者可以是任何动物或人类。优选的受试者是哺乳动物，更优选的是人类。受试者可以是非人类哺乳动物（例如，兔、豚鼠、褐家鼠、鼠或其他啮齿动物（包含啮齿动物目的任何动物的细胞）、猫、狗、猪、羊、山羊、牛（包含母牛，例如，奶牛、或牛属目的任何动物）、马（包含马科动物目的任何动物）、驴子、和非人类的灵长类动物）。非人类哺乳动物可以是驯服的宠物，或保持商业目的的动物，例如，赛马、或农业家畜如猪、羊或牛。受试者可以是雄性或雌性。受试者可以是病人。

其他应用

造骨细胞来源的GAG混合物各自（分别地，但是可选地结合地）提供用于以下的一个或更多种：体外培养中抑制破骨细胞生成、或增强造骨细胞增殖，或用于其他非医学的应用。培养基可提供用于这种目的，含有预先确定量的一种或更多的造骨细胞来源的GAG混合物。

可在体外或体内进行本发明的方法和应用。术语“体外”倾向于包含利用培养中的细胞的实验，然而术语“体内”倾向于包含利用完整的多细胞生物体的实验。

培养基

包括造骨细胞来源的GAG混合物的培养基可以是任何种类，但是优选的是液体或凝胶体，且可含有其他营养素和生长因子（例如，FGF-2）。造骨细胞来源的GAG混合物优选以非-痕量存在。例如，培养基中的造骨细胞来源的GAG混合物的浓度可在大约1.0ng/ml培养基到大约1000ng/ml培养基之间的范围。优选地，培养基中的造骨细胞来源的GAG混合物的浓度是在大约5ng/ml培养基和200ng/ml培养基之间，更优选地在大约20ng/ml培养基和170ng/ml培养基之间。

本发明包含所描述的方面和优选特征的结合，除了这样的结合是明显不允许的或明确要避免的。

本文使用的标题部分只用于组织的目的和不能解释为对描述的主题的限制。

现在将以实例方式，参考附图阐明本发明的方面和实施例。进一步的方面和实施例对于本领域技术人员是显然的。本文中提及的所有的文献结合在此以供参考。

附图说明

现在将参考附图讨论阐明本发明原理的实施例和实验，其中：

图1.初级造骨细胞的可溶解的和细胞表面的GAG的阴离子交换层析。从猪的初级造骨细胞培养基（可溶解的片段）或细胞提取物（细胞表面片段）纯化天然的GAG。A，样品在有1M NaCl的情况下，以4ml/min应用于50ml CaptoQ-琼脂糖（肝素琼脂糖凝胶，Heparin-Sepharose）柱。在洗涤期间，在232nm的吸光度上洗脱少量的GAG和在640到760片段数目（Fraction number）上产生峰。B.从可溶解的和细胞表面部分分离的GAG的琼脂糖CL-6B尺寸-排阻柱色谱。可溶解的GAG链的大小片段显示两个峰（1和2）。细胞表面的GAG链只显示一个峰（2）。基线下面的偏差代表监视的伪像。

图2.GAG对RANKL的结合能力。A.10ng、50ng和250ng的RANKL加入到涂上5μg的可溶解的或细胞表面的GAG的平板上。如“材料和方法”中描述的进行以酶为基础的试验，以便探测结合到固定的GAG上的RANKL的量。数据代表三次（triplicate）实验的平均值±S.E.。B和C.10ngRANKL加入到具有或没有5μg/ml自由的肝素或GAG的肝素-琼脂糖珠上。泳道（lane）1是作为阳性对照的RANKL蛋白。通过免疫印记试验显现结合到珠上的RANKL。数据代表三个独立的实验。RANKL结合的光密度分析法代表三个独立的实验的平均数。

图3.GAG对RANKL-诱导的破骨细胞形成的影响。在有10ng/mlRANKL的情况下，或10ng/ml RANKL连同5μg/ml可溶解的GAG或5μg/ml表面GAG的情况下，培养RAW264.7细胞5天。没有任何处理的细胞用作对照组。如“材料和方法”中描述的通过TRAP着色监视破骨细胞生成。RAW264.7单核细胞在TRAP着色中是阴性的（对照组）。利用10ng/ml RANKL处理5天之后，观察到许多TRAP阳性的多核细胞（在所有的具有RANKL的培养基中看到）。所有图像是来自利用10×物镜任意地选择的视野。数据代表三个独立的实验。B.造骨细胞的GAG抑制RAW264.7细胞的RANKL-诱导的破骨细胞的分化。数据代表三份实验的平均值±S.E.。

图4.可溶解的GAG对RANKL-诱导的ERK活性的影响。在有10ng/ml RANKL的情况下，或10ng/ml RANKL连同5μg/ml可溶解的GAG或5μg/ml表面GAG的情况下，培养RAW264.7细胞5天。免疫印记试验证明RANKL对抗ERK磷酸化，然而造骨细胞-来源的可溶解的GAG减少RANKL对ERK活性的抑制作用。数据代表三个独立的实验。

图5.GAG对造骨细胞增殖的影响。A.在有或没有5μg/ml可溶解的GAG或细胞表面GAG下将初级的人类造骨细胞生长2天。剩下的未处理的细胞作为对照组。分别地利用罗丹明鬼笔环肽（rhodamine phalloidin）或DAPI染色肌动蛋白细胞骨架和细胞核，和通过共聚焦显微镜获得图像。B.在利用0.5、5、50μg/ml可溶解的GAG或细胞表面GAG处理之前，初级的人类造骨细胞失去血清以便同步化和阻止细胞生长24小时。在24小时后，通过BrdU掺入法（BrdU incorporation assay）测定细胞增殖。没有任何处理的细胞作为对照组。数据代表三份实验的平均值±S.E.。

实施例

在下面的说明中以实例方式阐述本发明的一个或更多实施例的细节，该说明包含发明人设计的、用于实施本发明的最好方式的具体细节。本领域的技术人员显然可见，本发明可以在无需限制于这些具体细节的情况下实施。

材料和方法

猪造骨细胞的GAG的提取

为了从初代的（初级的）造骨细胞获得GAG，利用严格的坚持新加坡生物医学研究理事会和新加坡国立大学的伦理指导，如先前描述的[Manton等人,2006]建立猪的初代造骨细胞培养。从预融合的培养基收集造骨细胞并且碱性磷酸酶的表达用于确定造骨细胞的表型。然后将获得的造骨细胞传代并以5000细胞/cm²播种，且培养在10％FCS的α-MEM中8天（-80％融合性的），在GAG提取之前每3天更换培养基。轻柔地从培养皿中移开含有可溶解的GAG部分（片段，fraction）的介质，而不扰乱细胞。为了去除任何细胞碎片，在最大的速度上离心培养基并且上清液经过0.45μm的过滤器。然后利用PBS洗涤细胞单层，并通过胰蛋白酶-EDTA移除。将最后所得到的细胞溶液煮沸10min，以便使胰蛋白酶失去活性，通过在最大速度离心15min收集裂解液。然后含有细胞表面GAG片段的上清液经过0.45μm的过滤器，以便去除任何碎片。其后，从培养基（可溶解的部分）或细胞（细胞表面部分）获得的上清液经历在50mM PBS中利用250mM NaCl（低-盐缓冲液）平衡的CaptoQ-琼脂糖柱（50ml）上的阴离子-交换色谱。样品以4ml/min的流速装载，且利用相同的缓冲液洗涤柱直到建立基线。利用1M NaCl（高-盐缓冲液）洗脱结合的材料，集中、浓缩峰部分、并按照制造商的使用说明使用HiPrep脱盐16/10柱（GE生命科学）利用蒸馏的H₂O除去峰部分的盐分。冻干来自可溶解部分和细胞表面部分的蛋白多糖样品，以便浓缩。然后利用神经氨酸酶（0.1U）处理样品4h，之后进一步利用10mg/ml链酶蛋白酶（在500mM Tris-醋酸盐、50mM醋酸钙，pH 8.0）和5体积的100mM Tris-醋酸盐（pH 8.0）在37℃消化24h。然后利用低-盐缓冲液1：10稀释全部的混合物，经过CaptoQ-琼脂糖柱（50ml）和如先前描述的洗脱。将峰片段（部分）集中、浓缩、并利用水脱盐、冻干和存储在-20℃。进一步通过琼脂糖CL-6B柱（1×120cm）上的尺寸排阻色谱表征来自可溶解部分和细胞表面部分的纯化的GAG链的特征。

细胞培养

RAW264.7鼠单核细胞系（ATCC TIB-71，USA）常规培养在利用10％胎牛血清（FBS）和100单位/ml青霉素/链霉素补充的达尔伯克氏改良伊格尔培养基（DMEM）中，且培养在37℃潮湿的5％CO₂培养箱中。对于实验，以2×10³/cm²接种RAW 264.7细胞。

人类初代的造骨细胞慷慨地由Dr Kerry Manton提供[Manton等人,2006]。在知情同意之后依照新加坡生物医学研究理事会和新加坡国立大学医院的伦理指导，从19岁年龄的男性供体获得来源于丟弃的头盖骨的外植体的细胞。在用10％FCS、2mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素/链霉素和100mg/ml两性霉素B补充的DMEM葡萄糖中维持培养。

酒石酸盐-抗性的酸性磷酸酶染色

RAW264.7是能够分化成酒石酸盐-抗性的酸性磷酸酶（TRAP）阳性的多核的破骨细胞的单核细胞的[Cool等人,2007]细胞系[Collin-Osdoby等人,2003;Hsu等人,1999]。同样地，它们广泛地用于体外破骨细胞生成的研究。在含有10％FCS、2mM谷氨酰胺、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素α-最少必要成分的基本培养基（α-MEM）37℃的潮湿培养箱（空气中5％CO₂）中维持RAW264.7细胞。对于实验，细胞以2000细胞/cm²的密度接种在8-孔室载玻片中，且在有或缺乏5μg/mlGAG（可溶解的或细胞表面的）的情况下，利用10ng/ml RANKL（PeproTech,UK）培养5天。在第3天更新培养基和试验试剂。在第5天，在室温下利用PBS中的0.2％TritonX-100渗透化5min之前，在利用PBS中的4％多聚甲醛在4℃固定粘附的细胞60min。在利用PBS漂洗之后，然后在有50mM酒石酸钠和90mM醋酸钠的情况下，利用0.01％萘酚AS-MX磷酸盐和0.05％固红紫色LB盐（fast red violet LB salt）（Sigma,USA）孵育细胞，以便TRAP着色。含有十个或更多细胞核的TRAP-阳性的细胞认为是破骨细胞和在10×放大倍率下（Olympus1×81）经过10个任意的视野计数。所有的试验重复三次和计算每10个任意的视野的破骨细胞的平均数。利用装备有SpotCCD照相机和图像pro-plus v2.0（Olympus,Japan）的Olympus 1×81显微镜拍摄TRAP着色的克隆的显微照片。

免疫印记试验

对于免疫印记试验，在RIPA缓冲液（150mM NaCl、10mM Tris pH7.4、2mM EDTA、0.5%诺乃洗涤剂（Nonidet）P-40、0.1%十二烷基硫酸钠[SDS]、1%Triton X-100、蛋白酶抑制剂混合物）中在4℃裂解10min之前，在PBS中洗涤RAW 264.7细胞两次。利用BCA蛋白试验试剂盒（PierceBiotechnology,USA）根据厂商的指示测定蛋白质浓度。然后将蛋白质（20μg）变性，且通过SDS-PAGE分离。其后，蛋白质转移到硝酸纤维素膜上。利用在具有0.1％Tween-20的PBS中（PBST）的5％脱脂奶粉在室温下将膜封闭1h。然后利用一抗和相应的过氧化物-缀合的山羊抗-鼠/兔的二抗在室温下孵育印记（blot）1h，在中间通过PBST洗涤三次。使用的一抗是兔多克隆二氧磷基-p44/42MAPK（Erk1/2）（Thr202/Tyr204）（细胞信号运输技术）和鼠单克隆肌动蛋白（Chemicon,USA）。对于再次印记，在再生液（反萃取缓冲液，stripping buffer）（62.5mM Tris-HCI,pH 6.7、2%SDS、和0.7%B-巯基乙醇）中在50℃30min将膜再生（汽提，stripped）。然后洗涤印记30min，其中三次更换PBST。通过ECL的膜的再曝光测定再生（汽提，stripping）的效率。其后，封闭膜，针对肌动蛋白进行免疫印记，以便检验样品的等量载荷。通过增强的化学荧光（ECL）试剂盒依照厂商的指示（Pierce,USA）显现免疫反应性的带。

激光共聚焦扫描显微镜

人类初代的造骨细胞在具有或没有GAG的室载玻片上生长2天。其后，漂洗细胞和在4％的多聚甲醛中固定10min，之后利用0.1％的TrionX-100渗透5min。在洗涤之后，在利用罗丹明标记鬼笔环肽（Invitrogen,USA）孵育20min之前，利用1％BSA封闭细胞30min。其后，洗涤细胞且安装在具有DAPI（Vector Laboratories,USA）的抗淬灭封片剂（

）中。利用正立荧光显微镜（Zeiss Axio Imager Z1）系统（Carl Zeiss Microimaging,USA）显现标记的细胞。以标记的信息的文件（tagged-information-file）格式输出图像。

BrdU（5-溴-2-脱氧尿苷）掺入法（或BrdU免疫组织化学染色分析）

骨骼平衡涉及造骨细胞和破骨细胞以及在造骨细胞和破骨细胞之间的相互作用。两种细胞类型彼此接触且通过存在于成骨质微环境（niche）中的因子彼此影响。因为GAG是从造骨细胞分离的，我们接下来试图确定它们是否影响造骨细胞的增殖。简单而言，在96-孔微孔板中以5000细胞/cm2接种的初代人类造骨细胞通过血清缺乏（starvation）24小时同步化，之后利用GAG处理另外的24h。其后，依照关于BrdU免疫组织化学染色分析试剂盒的（Roche,Switzerland）厂商的推荐，利用BrdU在37℃将细胞脉冲2h。利用过氧化物酶-结合的抗-BrdU抗体检测结合的BrdU，且利用可溶解的发色体基质TMB显现结合的结合物（共轭物conjugate），并使用ELISA读取器测量（BioRad,USA）。还在各种情形中生长4天后通过相差显微镜（Olympus1×81，10×物镜）检查造骨细胞的形态。

RANKL/GAG结合试验

为了调查对本研究中提取的GAG的RANKL-结合性能，从Iduron（UK）公司获得专门制备的肝素/GAG结合板，和依照制造商的使用说明进行以酶为基础的试验。首先利用5μg可溶解的GAG或细胞表面GAG涂在板上，且在标准的试验缓冲液中过夜（100mM NaCl、50mM醋酸钠、0.2%Tween 20、pH7.2）。在0.2％凝胶中封闭之后，10ng RANKL施加于板的表面。不遭受RANKL的涂覆GAG的孔作为空白对照。未预涂覆GAG但是经受RANKL的孔用于显示RANKL不能结合到板的表面上。然后结合到可溶解的和细胞表面上的RANKL通过与生物素（Abeam,UK）缀合的它的特定的抗体来检测。利用附加的抗生物素蛋白-AP（ExtrAvidin-AP）之后通过p-硝基苯基磷酸盐（其是AP的发色体基质）进一步结合生物素，且给出黄色产物，利用Victor³多标记微孔板检测仪（Victor³ multilabel platereader）（PerkinElmer,USA）在405nm下可检测出。在室温且避光下执行整个试验，每一个步骤之后全面地（广泛地，extensive）洗涤以便去除非-特定的相互作用。读数减去空白对照的读数并进行分析。

肝素琼脂糖珠沉淀试验

利用30μl 100μl PBS中的50％的肝素-琼脂糖CL 6B珠淤浆（Amersham Pharmacia Biotech,UK），在有或缺乏竞争性的肝素（5μg）或GAG（5μg）的情况下在4℃下孵育RANKL（10ng）20min。然后利用PBS洗涤珠两次，和通过在蛋白分离的缓冲液（Laemmli buffer）（Sigma,USA）中煮沸来洗脱结合的RANKL，并利用抗-RANKL的抗体（Santa Cruz,USA）通过免疫印记试验检测结合的RANKL。

统计分析

每一个试验重复三次，数据表示成平均值±SEM。通过Students’t试验或变量分析（ANOVA）分析处理之间的差异。有效的差异设定在p<0.05。

结果

合成物中可溶解的GAG不同于细胞表面GAG

GAG呈现在细胞表面上、分泌到细胞外微环境中或捕集到细胞外基质中（ECM）。因此，我们以它们定位为基础选择从初级猪造骨细胞上分离和纯化GAG。不幸地ECM GAG的量显著地低于其他两个部分（数据没有示出）和不足以进一步的试验，因而只有可溶解的GAG和细胞表面的GAG应用于本研究。执行阴离子交换层析以便纯化GAG。如图1中示出的，从片段数640到760洗脱GAG并收集。因为在相同的片段数目上洗脱可溶解的GAG和细胞表面GAG，所以只示出一个有代表性的色层分析。NaCl的传导性也产生如图1A示出的信号，其突出（强调）在GAG洗脱之后是1M NaCl的生理梯度（step-gradient）。我们接下来测定GAG的大小分布状态，以便察看可溶解的GAG和细胞表面的GAG之间的相关成分中是否可存在差异。我们观察到可溶解的GAG中的两个主要的GAG种类（峰1和2）和细胞表面GAG中（图1B）只有一个主要的GAG种类（峰2）。硫酸软骨素（CS）和硫酸肝素（HS）是骨中两个最丰富的GAG种类（Dynamics of bone and cartilage metabolism,M.J.Seibel,Simon P.Robins,John P.Bilezikian,pp85），与HS比较，CS具有更高的分子量。有可能的是，可溶解的GAG中的峰1由CS组成而峰2由HS组成，然而，为了证实这一点，利用软骨素裂解酶和肝素裂解酶的消化是必要的。因为我们关注维持GAG的混合物，如同反射（反映）集中的异体破骨细胞可能在骨微环境中遇到，因此我们选择不进一步检查这个。

GAG对RANKL的亲和力

为了测定可溶解的GAG和细胞表面GAG是否结合到RANKL上，我们在肝素/GAG结合板的表面上固定5μgGAG。接下来，RANKL（10-250ng）经受预结合到板表面的GAG。因而能通过ELISA利用生物素化的RANKL抗体来测定和定量关于GAG的RANKL亲和力。如图2A示出的，不考虑GAG定位，我们观察到RANKL结合。此外，当5μgGAG预结合到板表面上时，RANKL结合从10到250ng/ml剂量依赖地增加，进一步表明5μg/ml的任一GAG足够用于RANKL结合。因此，为了检查GAG对RANKL-诱导的破骨细胞生成的影响，5μg/ml的任意GAG外源性地应用于RAW264.7细胞，因为认为这足够结合10ng/ml RANKL和足够与10ng/ml RANKL相互作用。特别地，与可溶解的GAG比较，细胞表面GAG示出更低的对RANKL的亲和力（图2A）。

最近报道肝素结合到RANKL上且抑制它的活性[Ariyoshi等人，2008]，因此我们使用琼脂糖珠与肝素耦合，以便沉淀RANKL。这些珠子常规地用于实验室分离肝素-结合蛋白。通过添加过量的自由的GAG作为竞争性试剂，通过观察GAG是否竞争RANKL对于肝素-琼脂糖珠的结合，我们进一步证实任一GAG对RANKL的相关亲和力。如图2B示出的，自由的/未结合的肝素的存在减少沉淀的RANKL，证明通过特定的蛋白质/肝素相互作用发生RANKL结合到肝素-琼脂糖珠上。特别地，未结合的可溶解的GAG和细胞表面的GAG防止RANKL对肝素-琼脂糖的结合，表明这两个GAG直接地结合RANKL。此外，当与可溶解的GAG比较时，细胞表面GAG对RANKL显示较少的竞争性的结合，表面它具有对RANKL的降低的亲和力，其是与由肝素-结合板ELISA试验产生的结果一致的（图2A）。通过密度测定法进一步定量结合到肝素-琼脂糖珠上的RANKL的量（图2C）。

GAG抑制RANKL诱导的破骨细胞形成

我们接下来检查可溶解的GAG和细胞表面GAG对RAW264.7细胞的RANKL-诱导的破骨细胞分化的影响。如图3A示出的，缺乏RANKL时培养的细胞未能分化成TRAP-阳性的、多核的破骨细胞；然而，利用10ng/mlRANKL处理5天，显著地改变RAW264.7培养物的形态和导致多核的TRAP-阳性的破骨细胞-类细胞的出现。尽管RANKL产生大的多核的TRAP-阳性的破骨细胞，当结合造骨细胞-特定的GAG时，大大地减少多核的、TRAP-阳性的细胞的大小和数目，抑制作用等级是RANKL+可溶解的GAG>RANKL+细胞表面GAG>单独的RANKL。此外，当通过单独的RANKL处理细胞时，每10个任意的视野的破骨细胞的平均数是73±11（图3B）。在有5μg/ml任一GAG时，由RANKL诱导的破骨细胞的数目分别地减少69％（可溶解的GAG）和41％（细胞表面GAG）（图3B）。因此，造骨细胞产生的GAG，特别是可溶解的部分（fraction）对RANKL-诱导的破骨细胞生成具有抑制作用。

GAG对抗RANKL对ERK活性的抑制作用

细胞外信号-调节蛋白激酶（ERK），也称作p44/42MAPK，是信号通路中负责细胞增殖和生存的重要的激酶，ERK在RANKL刺激后激活和在RANKL刺激后4h其返回到基础的水平[Hotokezaka等人,2002]。这升高的ERK活性显然地与破骨细胞的生存有关，但是与它们的分化无关，因为由PD98059或U0126的ERK通路的抑制不遏制破骨细胞的形成[Matsumoto等人,2000]，但是反而增加破骨细胞生成[Hotokezaka等人,2002]。与ERK负向地调节破骨细胞分化的观点一致，我们观察到长时间的利用RANKL的处理减少ERK的活性（图4）。我们进一步检查在有RANKL的情况下，可溶解的GAG对ERK活性的影响，与细胞表面GAG相比，在抑制RANKL-诱导的破骨细胞生成上这种GAG部分（即可溶解的GAG）更有效。令人关注地，在有可溶解的GAG的情况下，ERK活性（由RANKL遏制的）保持在非-RANKL刺激的水平（图4），表明，可溶解的GAG能够妨碍RANKL-诱导的减少ERK信号传递，导致破骨细胞生成的减少。

GAG增加造骨细胞的增殖

因为造骨细胞因子产生自分泌和外分泌的两种作用，密切地与调节骨平衡有关，我们也探寻测定造骨细胞-特定的GAG是否担当调节它们自身的生长的作用。我们发现可溶解的GAG和细胞表面的GAG两者均剂量依赖地增加造骨细胞增殖（图5B）。事实上，在显著地抑制破骨细胞生成的剂量上给予GAG（5μg/ml），能够几乎2倍地增强造骨细胞增殖。特别地，两种GAG都对造骨细胞形态没有影响（图5A）。此外，与处理无关（irrespective treatment），细胞表现特征性的纺锤状形态，具有许多从细胞伸出来的丝状伪足。

讨论

骨生长和重建是由细胞因子、生长因子和细胞外成分，如与细胞表面关联的或位于细胞外基质中的GAG调节的[Cool and Nurcombe,2006;Sims and Gooi,2008]。为了配合骨重建的过程，GAG与其中造骨细胞和破骨细胞共存的微环境中的生长因子/细胞因子相互作用[Ariyoshi等人,2008;Jackson等人,2006;Shinmyouzu等人,2007;Theoleyre等人,2006]。RANKL/OPG是由造骨细胞分泌的以便控制破骨细胞和其他生长因子的活性重要的生长因子，呈现在微环境中的GAG主要地调整它们的活性。为了更充分地说明造骨细胞来源的GAG和RANKL之间的相互作用，我们使用在破骨细胞的研究中广泛地研究的单核细胞（RAW264.7）的同源种群（homogenous population）。这个细胞系不含有造骨细胞或骨髓基质细胞，其也是RANKL的靶分子。因而，细胞背景是单一化的但仍然对RANKL发出的信号做出响应。在几个种类的GAG上的研究显示了这些复杂的糖的有争议的功能[Ariyoshi等人,2008;Ariyoshi等人,2005;Irie等人,2007;Lamoureux等人,2007;Shinmyouzu等人,2007;Theoleyre等人,2006]，其并不引人惊讶，因为GAG是具有不同的结构和生物学活性的多聚糖的混合物。骨组织中，破骨细胞被由造骨细胞合成的GAG的整个群体包围，造骨细胞是调节破骨细胞的主要的细胞。为了理解GAG对破骨细胞的整体的影响，我们不从聚集池（pool）中分离单一种类的GAG；我们的数据第一次证明了，破骨细胞前体周围的GAG的实际影响是对RANKL活性的抑制。此外，这些作为破骨细胞抑制剂（通过可溶解的GAG69％的减少）的GAG的效能相当于体外双膦酸酯的影响（通过10^-5M奈立膦酸的75％的减少），双膦酸酯是广泛地用于骨再吸收的预防和绝经后的骨质疏松症的治疗的高度地有效的药物[Nicolin等人,2007;Watts等人,1990]。

我们的数据证明，造骨细胞-来源的GAG能够结合RANKL和能够抑制RANKL-诱导的破骨细胞生成。期望这些GAG含有硫酸类肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素和透明质酸的混合物[Ecarot-Charrier andBroekhuyse,1987;Hunter等人,1983;Ling等人,2006;Nakamura等人,2001]，但是不含有在嗜碱细胞和肥大细胞中生产的肝素[Braunsteiner andThumb,1963]。最近示出硫酸软骨素（CS）减少由RANKL诱导的TRAP阳性的多核细胞的数目，指示它对抗RANKL活性[Ariyoshi等人,2008]。同样地，硫酸皮肤素也对RANKL显示高的结合活性，且能防止RANKL和RANK之间的相互作用[Shinmyouzu等人2007]。同时透明质酸（HA）对破骨细胞分化没有影响，尽管示出了低分子量HA通过RANK蛋白水平的上调来增强破骨细胞生成[Ariyoshi等人,2005]。与我们的研究相似，这些先前的报道也使用培养的RAW264.7细胞。

在本研究中，我们显示在对抗RANKL上，可溶解的GAG比细胞表面GAG更有效。既然这两个GAG的大小分布的检查显示分子量的差异（大概由于CS，其在细胞表面GAG中缺少），可能的是，可溶解的GAG变体中的CS能有助于对RANKL的抑制作用，因为已经表明CS抑制破骨细胞形成[Ariyoshi等人,2008]。然而，需要相关的GAG样品的更详细的酶的检查。

为了更完全地确定造骨细胞来源的GAG影响破骨细胞生成的机制，我们选择检查在介导RANKL减少ERK信号运输中它们扮演的角色[Hotokezaka等人,2002]。ERK是已知的细胞增殖重要的促有丝分裂的激酶和它的活性调节RANKL诱导的破骨细胞形成[Hotokezaka等人,2002;Lee等人,2002;Matsumoto等人,2000]。同样地，在破骨细胞生成期间ERK似乎扮演“双重角色”，其中激活的ERK驱使破骨细胞的增殖和增强破骨细胞的生存，同时也抑制破骨细胞分化[Hotokezaka等人,2002]。因而，维持的ERK活化作用妨碍破骨细胞分化。不令人惊讶地，我们显示，用RANKL（已知的促-破骨细胞分化的因子）刺激RAW264.7细胞导致ERK活性的负向调节。然而（用单独的RANKL处理的细胞不同），当利用RANKL和GAG两者处理RAW264.7细胞时，ERK活性仍然在与非-RANKL处理的细胞相同的水平上，表明GAG对RANKL诱导的破骨细胞生成的抑制作用可能是由活性的ERK信号运输的维持来介导。

骨细胞之间的局部的通信对骨重建和形成的控制是非常重要的[Henriksen等人,2009]。造骨细胞通过制造自分泌或旁分泌因子扮演重要的角色，从而调节破骨细胞生成（即，通过RANKL/OPG）且也调节它们自身的活性（即，FGF2和BMP2）。FGF2和BMP2，造骨细胞生长和分化的重要的生长因子，连同其他生长和粘连因子是由硫酸肝素（HS），一种在局部的细胞外微环境中呈现的丰富的GAG，控制的[Jackson等人,2006;Takada等人,2003]。本研究中我们发现造骨细胞来源的总的GAG促进人类造骨细胞的增殖（图5B）。根据它们的化学成分，GAG对骨生成表现刺激或抑制的影响[Haupt等人,2009;Ling等人,2006;Manton等人,2006]。可溶解的GAG或细胞表面的GAG是几种彼此在它们的结构和功能上不同的GAG种类的混合物。然而，GAG对人类造骨细胞的总的影响是刺激作用。加上这些GAG对抑制破骨细胞生成的能力，表明，骨-特定的GAG将骨重建的平衡向骨形成移动，从而有利于造骨细胞生成，而对抗破骨细胞生成。

概括而言，我们的结果证明，缺乏OPG时，RANKL引诱和抑制受体，GAG减少RAW264.7细胞中的RANKL的破骨细胞生成的能力和抗骨质疏松的影响的效力显然依赖于GAG的组合物（合成物，composition）。RANKL对ERK的长期影响是抑制性的，这证实ERK对破骨细胞分化的负作用。也因为GAG恢复活性ERK的水平，在RANKL的骨质疏松的影响中ERK通路显然是重要的通路。GAG对破骨细胞生成的抑制作用表明，骨新陈代谢中GAG的重要作用和在治疗骨质疏松症中它的治疗潜能。

参考文献

Anderson DM，Maraskovsky E，Billingsley WL，Dougall WC，Tometsko ME，Roux ER，Teepe MC，DuBose RF，Cosman D，Galibert L.1997.A homologue of the TNF receptorand its ligand enhance T-cell growth and dendritic-cell function.Nature 390：175-9.Ariyoshi W，Takahashi T，Kanno T，lchimiya H，Shinmyouzu K，Takano H，Koseki T，Nishihara T.2008.Heparin inhibits osteoclastic differentiation and function.J CellBiochem 103：1707-17.

Ariyoshi W，Takahashi T，Kanno T，lchimiya H，Takano H，Koseki T，Nishihara T.2005.Mechanisms involved in enhancement of osteoclast formation and function  by lowmolecular weight hyaluronic acid.J Biol Chem 280：18967-72.

Blair JM，Zheng Y，Dunstan CR.2007.RANK ligand.lnt J Biochem Cell Biol 39：1077-81.

Bolon B，Carter C，Daris M，Morony S，Capparelli C，Hsieh A，Mao M，Kostenuik P，Dunstan CR，Lacey DL，Sheng JZ.2001.Adenoviral delivery of osteoprotegerinameliorates bone resorption in a mouse ovariectomy model of osteoporosis.Mol Ther3：197-205.

Boyle WJ，Simonet WS，Lacey DL.2003.Osteoclast differentiation and activation.Nature423：337-42.

Braunsteiner H，Thumb N.1963.[Mast cells，basophils and heparin liberation.].BiblHaematol 15：9-15.

Bucay N，Sarosi l，Dunstan CR，Morony S，Tarpley J，Capparelli C，Scully S，Tan HL，XuW，Lacey DL，Boyle WJ，Simonet WS.1998.osteoprotegerin-deficient mice develop earlyonset osteoporosis and arterial calcification.Genes Dev 12：1260-8.

Burgess TL，Qian Y，Kaufman S，Ring BD，Van G，Capparelli C，Kelley M，Hsu H，BoyleWJ，Dunstan CR，Hu S，Lacey DL.1999.The ligand for osteoprotegerin(OPGL)directlyactivates mature osteoclasts.J Cell Biol 145：527-38.

Collin-Osdoby P，Yu X，Zheng H，Osdoby P.2003.RANKL-mediated osteoclast formationfrom murine RAW 264.7 cells.Methods Mol Med 80：153-66.

Cool SM，Kenny B，Wu A，Nurcombe V，Trau M，Cassady Al，Grondahl L.2007.Poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate)composite biomaterials for bone tissueregeneration：in vitro performance assessed by osteoblast proliferation，osteoclastadhesion and resorption，and macrophage proinflammatory response.J Biomed MaterRes A 82：599-610.

Cool SM，Nurcombe V.2006.Heparan sulfate regulation of progenitor cell fate.J CellBiochem 99：1040-51.

Dougall WC，Glaccum M，CharrierK，Rohrbach K，Brasel K，De Smedt T，Daro E，Smith J，Tometsko ME，Maliszewski CR，Armstrong A，Shen V，Bain S，Cosman D，Anderson D，Morrissey PJ，Peschon JJ，Schuh J.1999.RANK is essential for osteoclast and lymphnode development.Genes Dev 13：2412-24.

Ecarot-Charrier B，Broekhuyse H.1987.Proteoglycans synthesized by cultured mouseosteoblasts.J Biol Chem 262：5345-51.

Eghbali-Fatourechi G，Khosla S，Sanyal A，Boyle WJ，Lacey DL，Riggs BL.2003.Role oRANK ligand in mediating increased bone resorption in early postmenopausal women.JClin lnvest 111：1221-30.

Fuller K，Wong B，Fox S，Choi Y，Chambers TJ.1998.TRANCE is necessary andsufficient for osteoblast-mediated activation of bone resorption in osteoclasts.J Exp Mec188：997-1001.

Gandhi NS，Mancera RL.2008.The structure of glycosaminoglycans and theirinteractions with proteins.Chem Biol Drug Des 72：455-82.Haupt LM，Murali S，Mun FK，Teplyuk N，Mei LF，Stein GS，van Wijnen AJ，Nurcombe VCool SM.2009.The heparan sulfate proteoglycan(HSPG)glypican-3 mediatescommitment of MC3T3-E1 cells toward osteogenesis.J Cell Physiol 220：780-91.Henriksen K，Neutzsky-Wulff AV，Bonewald LF，Karsdal MA.2009.Local communicatioron and within bone controls bone remodeling.Bone 44：1026-33.

Hotokezaka H，Sakai E，Kanaoka K，Saito K，Matsuo K，Kitaura H，Yoshida N，NakayamK.2002.U0126 and PD98059，specifiic inhibitors of MEK，accelerate differentiation ofRAW264.7cells into osteoclast-like cells.J Biol Chem 277：47366-72.

Hsu H，Lacey DL，Dunstan CR，Solovyev l，Colombero A，Timms E，Tan HL，Elliott G，Kelley MJ，Sarosi l，Wang L，Xia XZ，Elliott R，Chiu L，Black T，Scully S，Capparelli C，Morony S，Shimamoto G，Bass MB，Boyle WJ.1999.Tumor necrosis factor receptorfamily member RANK mediates osteoclast differentiation and activation induced byosteoprotegerin ligand.Proc Natl Acad Sci U S A 96：3540-5.

Hughes AE，Ralston SH，Marken J，Bell C，MacPherson H，Wallace RG，van Hul W，Whyte MP，Nakatsuka K，Hovy L，Anderson DM.2000.Mutations in TNFRSF11A，affecting the signal peptide of RANK，cause familial expansile osteolysis.Nat Genet24：45-8.

Hunter GK，Heersche JN，Aubin JE.1983.lsolation of three species of proteoglycansynthesized by cloned bone cells.Biochemistry 22：831-7.

lozzo RV.1998.Matrix proteoglycans：from molecular design to cellular function.AnnuRev Biochem 67：609-52.

lrie A，Takami M，Kubo H，Sekino-Suzuki N，KasaharaK，Sanai Y.2007.Heparinenhances osteoclastic bone resorption by inhibiting osteoprotegerin activity.Bone41：165-74.

Jackson RA，Murali S，van Wijnen  AJ，Stein GS，Nurcombe V，Cool SM.2007.Heparansulfate regulates the anabolic activity of MC3T3-E1 preosteoblast cells by induction ofRunx2.J Cell Physiol 210：38-50.

Jackson RA，Nurcombe V，Cool SM.2006.Coordinated fibroblast growth factor andheparan sulfate regulation of osteogenesis.Gene 379：79-91.

Jimi E，Akiyama S，Tsurukai T，Okahashi N，Kobayashi K，Udagawa N，Nishihara T，Takahashi N，Suda T.1999.Osteoclast differentiation facto racts as a multifunctionalregulator in murine osteoclast differentiation and function.J lmmunol 163：434-42.Karsenty G，Wagner EF.2002.Reaching a genetic and molecular understanding ofskeletal development.Dev Cell 2：389-406.

Katagiri T，Takahashi N.2002.Regulatory mechanisms of osteoblast and osteoclastdifferentiation.Oral Dis 8：147-59.

Kim N，Odgren PR，Kim DK，Marks SC，Jr.，Choi Y.2000.Diverse roles of the tumornecrosis factor family member TRANCE in skeletal physiology revealed by TRANCEdeficiency and partial rescue by a lymphocyte-expressed TRANCE transgene.Proc NatlAcad Sci U S A 97：10905-10.

Kong YY，Feige U，Sarosi l，Bolon B，Tafuri A，Morony S，Capparelli C，Li J，Elliott R，McCabe S，Wong T，Campagnuolo G，Moran E，Bogoch ER，Van G，Nguyen LT，OhashiPS，Lacey DL，Fish E，Boyle WJ，Penninger JM.1999.Activated T cells regulate boneloss and joint destruction in adjuvant arthritis through osteoprotegerin ligand.Nature402：304-9.

Kumarasuriyar A，Lee l，Nurcombe V，Cool SM.2009.De-sulfation of MG-63 cellglycosaminoglycans delays in vitro osteogenesis，up-regulates cholesterol synthesis anddisrupts cell cycle and the actin cytoskeleton.J Cell Physiol 219：572-83.

Lacey DL，Timms E，Tan HL，Kelley MJ，Dunstan CR，Bu rgess T，Elliott R，Colombero A，Elliott G，Scully S，Hsu H，Sullivan J，Hawkins N，Davy E，Capparelli C，Eli A，Qian YX，Kaufma n S，Sarosi l，Shalhoub V，Senaldi G，Guo J，Delaney J，Boyle WJ.1998.Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation andactivation.Cell 93：165-76.

Lamoureux F，Baud’huin M，Duplomb L，Heymsnn D，Redini F.2007.Proteoglycans ：keypartners in bone cell biology.Bioessays 29：758-71.

Lee SE，Woo KM，Kim SY，Kim HM，Kwack K，Lee ZH，Kim HH.2002.Thephosphatidylinositol 3-kinase，p38，and extracellular signal-regulated kinase pathways areinvolved in osteoc last differentiation.Bone 30：71-7.

Li J，Sarosi l，Yan XQ，Morony S，Capparelli C，Tan HL，McCabe S，Elliott R，Scully S，Van G，Kaufman S，Juan SC，Sun Y，Tarpley J，Martin L，Christensen K，McCabe J，Kostenuik P，Hsu H，Fletcher F，Dunstan CR，Lacey DL，Boyle WJ.2000.RANK is theintrinsic hematopoietic cell surface receptor that controls osteoclastogenesis andregulation of bone mass and calcium metabolism.Proc Natl Acad Sci U S A 97：1566-71.Ling L，Murali S，Dombrowski C，Haupt LM，Stein GS，van Wijnen AJ，Nurcombe V，CoolSM.2006.Sulfated glycosaminoglycans mediate the effects of FGF2 on the osteogenicpotential of rat calvarial osteoprogenitor cells.J Cell Physiol 209：811-25.

Manton KJ，Sadasivam M，Cool SM，Nurcombe V.2006.Bone-specific heparan sulfatesinduce osteoblast growth arrest and downregulation of retinoblastoma protein.J CellPhysiol 209：219-29.

Matsumoto M，Sudo T，Saito T，Osada H，Tsujimoto M.2000.lnvolvement of p38mitogen-activated protein kinase signaling pathway in osteoclastogenesis mediated byrecepto ractivator of NF-kappa B ligand(RANKL).J Biol Chem 275：31155-61.

Matsuzaki K，Udagawa N，Takahashi N，Yamaguchi K，Yasuda H，Shima N，Morinaga T，Toyama Y，Yabe Y，Higashio K，Suda T.1998.Osteoclast differentiation factor(ODF)induces osteoclast-like cell formation in human peripheral blood mononuclear cellcultures.Biochem Biophys Res Commun 246：199-204.

Mizuno A，Amizuka N，lrie K，Murakami A，Fujise N，Kanno T，Sato Y，Nakagawa N，Yasuda H，Mochizuki S，Gomibuchi T，Yano K，Shima N，Washida N，Tsuda E，MorinagaT，Higashio K，Ozawa H.1998.Severe osteoporosis in mice lacking osteoclastogenesisinhibitory factor/osteoprotegerin.Biochem Biophys Res Commun 247：610-5.

Nakamura H，Hirata A，Tsuji T，Yamamoto T.2001.lmmunolocalization of keratan sulfateproteoglycan in rat calvaria.Arch Histol Cytol 64：109-18.

Nakatsuka K，Nishizawa Y，Ralston SH.2003.Phenotypic characterization of early onsetPaget’s disease of bone caused by a 27-bp duplication in the TNFRSF11A gene.JBoneMiner Res 18：1381-5.

Nicolin V，Bareggi R，Baldini G，Bortul R，Martinelli B，Narducci P.2007.Effects ofneridronic acid on osteoclasts derived by physiological dual-cell cultures.Acta Histochem109：397-402.

Nurcombe V，Goh FJ，Haupt LM，Murali S，Cool SM.2007.Temporal and functionalchanges in glycosaminoglycan expression during osteogenesis.J Mol Histol 38：469-81.

Pearse RN，Sordillo EM，Yaccoby S，Wong BR，Liau DF，Colman N，Michaeli J，Epstein J，Choi Y.2001.Multiple myeloma disrupts the TRANCE/osteoprotegerin cytokine axis totrigger bone destruction and promote tumor progression.Proc Natl Acad Sci U S A98：11581-6.

Perrimon N，Bernfield M.2000.Specificities of heparan sulphate proteoglycans indevelopmental processes.Nature 404：725-8.

Roodman GD.1999.Cell biology of the osteoclast.Exp Hematol 27：1229-41.

Sasaki N，Kusano E，Ando Y，Nemoto J，limura O，lto C，Takeda S，Yano K，Tsuda E，Asano Y.2002.Changes in osteoprotegerin and markers of bone metabolism duringglucocorticoid treatment in patients with chronic glomerulonephritis.Bone 30：853-8.

Schoppet M，Al-Fakhri N，Franke FE，Katz N，Barth PJ，Maisch B，Preissner KT，Hofbauer LC.2004.Localization of osteoprotegerin，tumor necrosis factor-relatedapoptosis-inducing ligand，and receptor activator of nuclear factor-kappaB ligand inMonckeberg’s sclerosis and atherosclerosis.J Clin Endocrinol Metab 89：4104-12.

Shinmyouzu K，Takahashi T，Ariyoshi W，lchimiya H，Kanzaki S，Nishihara T.2007.Dermatan sulfate inhibits osteoclast formation by binding to receptor activator of NF-kappa B ligand.Biochem Biophys Res Commun 354：447-52.

Simonet WS，Lacey DL，Dunstan CR，Kelley M，Chang MS，Luthy R，Nguyen HQ，Wooden S，Be nnett L，Boone T，Shimamoto G，DeRose M，Elliott R，Colombero A，TanHL，Trail G，Sullivan J，Davy E，Bucay N，Renshaw-Gegg L，Hughes TM，Hill D，PattisonW，Campbell P，Sander S，Van G，Tarpley J，Derby P，Lee R，Boyle WJ.1997.Osteoprotegerin：a novel secreted protein involved in the regulation of bone density.Cell89：309-19.

Sims NA，Gooi JH.2008.Bone remodeling：Multiple cellular interactions required forcoupling of bone formation and resorption.Semin Cell Dev Biol 19：444-51.Suda T，Takahashi N，Martin TJ.1992.Modulation of osteoclast differentiation.EndocrRev 13：66-80.

Takada T，Katagiri T，lfuku M，Morimura N，Kobayashi M，Hasegawa K，Ogamo A，KamijoR.2003.Sulfated polysaccharides enhance the biological activities of bonemorphogenetic proteins.J Biol Chem 278：43229-35.

Theill LE，Boyle WJ，Penninger JM.2002.RANK-L and RANK：T cells，bone loss，andmammalian evolution.Annu Rev lmmunol 20：795-823.

Theoleyre S，Kwan Tat S，Vusio P，Blanchard F，Gallagher J，Ricard-Blum S，Fortun Y，Padrines M，Redini F，Heymann D.2006.Characterization of osteoprotegerin binding toglycosaminoglycans by surface p lasmon resonance：role in the interactions with receptoractivator of nuclear factor kappaB ligand(RANKL)and RANK.Biochem Biophys ResCommun 347：460-7.

Watts NB，Harris ST，Genant HK，Washich RD，Miller PD，Jackson RD，Licata AA，RossP，Woodson GC，3rd，Yanover MJ，et al.1990.lntermittent cyclical etidronate treatmentof postmenopausal osteoporosis.N Engl J Med 323：73-9.

Whyte MP，Hughes AE.2002.Expansile skeletal hyperphosphatasia is caused by a 15-base pair tandem duplication in TNFRSF11A encoding RANK and is allelic to familialexpansile osteolysis.J Bone Miner Res17：26-9.

Whyte MP，Obrecht SE，Finnegan PM，Jones JL，Podgornik MN，McAlister WH，Mumm S.2002.Osteoprotegerin deficiency and juvenile Paget’s disease.N Engl J Med 347：175-84.

Wong BR，Rho J，Arron J，Robinson E，Orlinick J，Chao M，Kalachikov S，Cayani E，Bartlett FS，3rd，Frankel WN，Lee SY，Choi Y.1997.TRANCE is a novel ligand of thetumor necrosis factor receptor family that activates c-Jun N-terminal kinase in T cells.JBiol Chem 272：25190-4.

Yasuda H，Shima N，Nakagawa N，Yamaguchi K，Kinosaki M，Mochizuki S，Tomoyasu A，Yano K，Goto M，Murakami A，Tsuda E，Morinaga T，Higashio K，Udagawa N，Takahashi N，Suda T.1998.Osteoclast differentiation factor is a ligand forosteoprotegerin/osteoclastogenesis-inhibitory factor and is identical to TRANCE/RANKL.Proc Natl Acad Sci U S A 95：3597-602。

Claims (17)

1.一种从哺乳动物造骨细胞获得的葡糖胺聚糖混合物，用于抑制哺乳动物的破骨细胞生成。

2.一种从哺乳动物造骨细胞获得的葡糖胺聚糖混合物，用于治疗/预防哺乳动物的骨折和/或骨退化。

3.一种从哺乳动物造骨细胞获得的葡糖胺聚糖混合物，用于增强哺乳动物的造骨细胞的增殖。

4.从哺乳动物造骨细胞获得的葡糖胺聚糖混合物在制备用于抑制哺乳动物的破骨细胞生成的药物中的应用。

5.从哺乳动物造骨细胞获得的葡糖胺聚糖混合物在制备用于治疗和/或预防哺乳动物的骨折或骨退化的药物中的应用。

6.从哺乳动物造骨细胞获得的葡糖胺聚糖混合物在制备用于增强哺乳动物造骨细胞增殖的药物中的应用。

7.一种在需要治疗的哺乳动物中抑制破骨细胞生成的方法，所述方法包括将从哺乳动物造骨细胞获得的葡糖胺聚糖混合物给予哺乳动物。

8.一种在需要治疗的哺乳动物中治疗和/或预防骨折或骨退化的方法，所述方法包括将从哺乳动物造骨细胞获得的葡糖胺聚糖混合物给予哺乳动物。

9.一种在需要治疗的哺乳动物中增强造骨细胞增殖的方法，所述方法包括将从哺乳动物造骨细胞获得的葡糖胺聚糖混合物给予哺乳动物。

10.根据权利要求7至9中任一项所述的方法，包括将所述葡糖胺聚糖混合物给予所述哺乳动物的骨组织或所述哺乳动物的骨组织周围的组织。

11.一种抑制破骨细胞生成的方法，所述方法包括将从哺乳动物造骨细胞获得的葡糖胺聚糖混合物给予体外或体内的破骨细胞或造骨细胞。

12.一种增强造骨细胞增殖的方法，所述方法包括将从哺乳动物造骨细胞获得的葡糖胺聚糖混合物给予体外或体内的造骨细胞。

13.一种药物组合物或药物，所述药物组合物或药物包括从哺乳动物造骨细胞获得的葡糖胺聚糖混合物。

14.根据权利要求13所述的药物组合物或药物，用于抑制哺乳动物的破骨细胞生成。

15.根据权利要求13所述的药物组合物或药物，用于治疗和/或预防哺乳动物的骨折或骨退化。

16.根据权利要求13所述的药物组合物或药物，用于增强哺乳动物造骨细胞的增殖。

17.一种分离的从哺乳动物造骨细胞获得的葡糖胺聚糖混合物。

Images