CN102791878A - 黑色素瘤特异性生物标志物 - Google Patents

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Abstract

描述了黑色素瘤特异性生物标志物，所述的生物标志物包含Engrailed-2(EN2)基因的核酸序列或经编码的EN2蛋白的氨基酸序列。还描述了该生物标志物在黑色素瘤的治疗、诊断、监测和成像中的用途。

Description

黑色素瘤特异性生物标志物
本申请涉及生物标志物，尤其涉及用于黑色素瘤的生物标志物。
黑色素瘤是在黑色素细胞中开始的一类皮肤癌症。其可以在痣（mole）中开始，也可以在其他有色组织中开始，例如在眼睛中或者在肠中开始。恶性黑色素瘤相对罕见，占所有皮肤癌症病例的10%。然而，恶性黑色素瘤还造成最多的死亡。在英格兰和威尔士，每年约有1500人死于恶性黑色素瘤。
尽管技术有进步，但黑色素瘤仍然难以治疗，尤其是当其未在早期发现时。
发明概述
根据本发明的一个方面，提供了黑色素瘤特异性生物标志物，所述的生物标志物包含：
（i）包含SEQ ID NO:1的核酸序列，或其片段或变体，或者包含所述核酸序列的核酸分子；或者
（ii）包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，或其片段或变体，或者包含所述氨基酸序列的氨基酸分子。
在这方面，SEQ ID NO:1对应于Engrailed-2(EN2)基因(GenBank参考号NM 001427)的核酸序列，而SEQ ID NO:2对应于由其编码的EN2蛋白(NCBI登录号P19622,gi21903415)。
出人意料地，已经发现在黑色素瘤中EN2基因显著地被上调。
EN2基因编码包含同源域的转录因子，该转录因子在包括轴突导向和边界形成的早期发育中具有许多重要功能（综述于Morgan R,(2006).Engrailed:Complexity and economy of a multi-functional transcription factor.FEBS letters 580,2531-2533,其全部引入本文作为参考）。该转录因子的NCBI/GenBank参考号是NM 001427。尽管没有归因于它的诊断显著性，先前已报道其在乳腺癌中作为癌基因起作用(Martin,N.L.,Saba-El-Leil,M.K.,Sadekova,S.,Meloche,S.and Sauvageau,G.(2005)EN-2is a candidateoncogene in human breast cancer.Oncogene 24,6890-6901,其全部引入本文作为参考)。EN2的基因产物是33kDa的蛋白质（EN2）。
优选地，所述其片段或变体包含：
(i)与SEQ ID NO:1具有至少约50%，或至少约60%，或至少约70%，或至少约75%，或至少约80%，或至少约85%，或至少约90%，或至少约95%，或至少约96%，或至少约97%，或至少约98%，或至少约99%的核酸序列同源性的核酸序列；在严谨条件下与其可杂交的核酸序列；和/或与其互补的核酸序列；
(ii)与SEQ ID NO:2具有至少约50%，或至少约60%，或至少约70%，或至少约75%，或至少约80%，或至少约85%，或至少约90%，或至少约95%，或至少约96%，或至少约97%，或至少约98%，或至少约99%的氨基酸序列同源性的氨基酸序列；或者
(iii)由(i)的核酸序列编码的氨基酸序列。
换句话说，按照上述(iii)部分，优选的是所述的其片段或变体包含：
(A)由核酸序列编码的氨基酸序列，其中所述核酸序列与SEQ IDNO:1具有至少约50%，或至少约60%，或至少约70%，或至少约75%，或至少约80%，或至少约85%，或至少约90%，或至少约95%，或至少约96%，或至少约97%，或至少约98%或至少约99%的核酸序列同源性；
(B)由核酸序列编码的氨基酸序列，其中所述核酸序列在严谨条件下与以下的核酸序列可杂交：与SEQ ID NO:1具有至少约50%，或至少约60%，或至少约70%，或至少约75%，或至少约80%，或至少约85%，或至少约90%，或至少约95%，或至少约96%，或至少约97%，或至少约98%，或至少约99%的核酸序列同源性的核酸序列；或者
(C)由核酸序列编码的氨基酸序列，其中所述核酸序列与以下的核酸序列互补：与SEQ ID NO:1具有至少约50%，或至少约60%，或至少约70%，或至少约75%，或至少约80%，或至少约85%，或至少约90%，或至少约95%，或至少约96%，或至少约97%，或至少约98%或至少约99%的核酸序列同源性的核酸序列。
优选地，所述其片段包含(i)来自SEQ ID NO:2的至少4个，优选地至少5个，优选地至少6个，优选地至少7个，优选地至少8个连续的氨基酸或(ii)SEQ ID NO:1的核酸序列的片段，该片段编码来自SEQ ID NO:2的至少4个，优选地至少5个，优选地至少6个，优选地至少7个，优选地至少8个连续的氨基酸。较长的片段也是优选的，例如，SEQ ID NO:2的至少约10、15、20、25、30、50、75、100、150、200、225以及最多至少约250个氨基酸或SEQ ID NO:1的相应的编码片段。该片段也可以包括具有从N末端和/或C末端缺失x个氨基酸的截短肽。在这些截短中，x可以是SEQ ID NO:2的1个或多个(即1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100个或更多)，但是优选SEQ IDNO:2的少于150个氨基酸或SEQ ID NO:1的相应的编码片段。
优选地，所述其片段或变体为其功能性片段或变体。
根据本发明的另一个方面，提供了用于诊断患者中的黑色素瘤或用于鉴定处于患黑色素瘤的风险中的患者的方法，所述方法包括：
(a)在得自患者的样本中，测定黑色素瘤特异性生物标志物的量；
(b)比较得自患者的样本中测定的黑色素瘤特异性生物标志物的量和正常对照中黑色素瘤特异性生物标志物的量；
其中与正常对照中黑色素瘤特异性生物标志物的量相比较，得自患者的样本中黑色素瘤特异性生物标志物的量的差异与黑色素瘤的存在相关联或与患黑色素瘤的风险相关联。
根据本发明的再一个方面，提供了用于监测患者中黑色素瘤的进展的方法，所述方法包括：
(a)测定得自患者的样本中黑色素瘤特异性生物标志物的量；
(b)比较得自患者的样本中测定的黑色素瘤特异性生物标志物的量和正常对照中黑色素瘤特异性生物标志物的量；和
(c)在两个或多个时间间隔内重复步骤(a)和(b)，
其中来自患者的黑色素瘤特异性生物标志物的量随时间的增加与黑色素瘤进展的提高相关联，并且来自患者的黑色素瘤特异性生物标志物的量随时间的减少与黑色素瘤进展的降低相关联。
因此，本发明的方法可以用于检测黑色素瘤的发病、进展、稳定、改善和/或缓解。
优选地，所述对照可以来自相同患者的先前样本，从而监测发病或进展。然而，还优选的是，所述的对照可以是针对群体正常化的，所述的群体尤其是其中没有黑色素瘤的健康或正常群体。换句话说，所述对照可以由在来自正常受试者的正常对照样本中发现的生物标志物的水平组成。
因此，在本发明的一个实例中，提供了诊断或监测黑色素瘤进展的方法，该方法包括检测和/或定量得自患者的生物流体中的黑色素瘤特异性生物标志物。
如以上所讨论的，优选的是提供至少两个短暂地间隔开（spaced aparttemporally）的检测和/或定量步骤。
优选地，为了确定黑色素瘤特异性生物标志物的水平是否发生变化，使所述步骤的间隔时间为几天、几周、几年或几个月，从而指示癌症的进展是否发生了变化，从而使进行两次或多次样本中的生物标志物水平之间的对比成为可能，因为生物标志物的水平随时间的提高指示癌症的发生或进展，而生物标志物的水平的下降可以指示癌症的改善和/或缓解。
优选地，通过应用“t-检验”确定的生物标志物水平的差异具有统计学上的显著性，所述“t-检验”提供的置信区间为优选地至少约80%，优选地，至少约85%，优选地，至少约90%，优选地，至少约95%，优选地，至少约99%，优选地，至少约99.5%，优选地，至少约99.95%，优选地，至少约99.99%。
本发明的生物标志物和方法特别地用于诊断早期癌症，并且在检测早期黑色素瘤方面比已知的方法更加灵敏。因而当已经使用常规方法检测患者为癌症阴性时，本发明的生物标志物和方法对于确认癌症是特别有用的。
治疗的预后和选择依赖于癌症的阶段和患者的一般健康状况。
黑色素瘤的第1阶段是微弱的并且表皮通常显示有刮伤。皮肤癌症的这一阶段被细分成两个其他的类别。这些其他的类别描述了肿瘤的厚度。第1a阶段为小于1.0mm并且没有溃疡。第1b阶段为小于1.0mm但是有溃疡。如果其为1.01-2.0mm，即使不包含溃疡，也认为其在第1b阶段。在这一阶段和第2阶段，黑色素瘤尚未蔓延到淋巴结。
第2阶段也被细分成三个更多的类别，所述的类别表明了厚度以及溃疡的存在或不存在。在第2a阶段的肿瘤为1.01-2.0mm并具有溃疡，或者为2.01-4.0mm无溃疡。在第3b阶段具有厚度为2.01mm的肿瘤厚度并具有溃疡，或者大于4.0mm的厚度无溃疡。
当此类型的皮肤癌症发展到第3阶段时出现显著的变化。在此阶段，黑色素瘤肿瘤已经蔓延到淋巴结。这是此疾病中远远地更严重的阶段，这是由于当健康时，淋巴结与疾病、癌症和一些其他的感染进行斗争。
具有此癌症的第3阶段的患者的黑色素瘤已经蔓延到原发肿瘤邻近的淋巴结。此阶段还涉及中途转移灶，所述中途转移灶具有距离原始肿瘤多于2cm的皮肤或结缔组织。然而在此时其尚未蔓延通过区域淋巴结。
在第4阶段，黑色素瘤已经蔓延到远离原始肿瘤的淋巴结或者蔓延到体内的器官。这些器官最通常为肺、肝、脑、骨以及随后胃肠道。
应认识到如本文所使用的术语“早期”可以说成指如上所讨论的黑色素瘤的第1阶段和/或第2阶段。
如本文所使用的关于术语“晚期”，应认识到该术语可以说成指黑色素瘤的第3和/或第4阶段。
应认识到癌症疾病状态的“早期”和“晚期”的性质可以由医师确定。还设想，可以将它们分别与非转移性和转移性的状态相关联。
在一个方面，提供了用于检测早期癌症的根据本发明的方法，其中对照和得自患者的样本之间的增长指示早期癌症。优选地，所述的增长为至少约50%，至少约60%，至少约70%，至少约80%，至少约90%，至少约100%，优选地至少约200%，优选地至少约300%，优选地至少约400%，优选地至少约500%，优选地至少约1000%。
还提供了用于检测晚期癌症的根据本发明的方法，其中对照和得自患者的样本之间的增长指示晚期癌症。优选地，所述的增长为至少约75%，优选地至少约85%，优选地至少约100%，优选地至少约110%，优选地至少约125%，优选地至少约150%，优选地至少约200%，优选地至少约300%，优选地至少约400%，优选地至少约500%，优选地至少约1000%。
又提供了用于监测癌症的阶段变化的根据本发明的方法，其中相对于较早期的样本或对照的增长指示癌症从疾病的较早期进展至较晚期，例如，从第1阶段至第2阶段、从第2阶段至第3阶段、从第3阶段至第4阶段，或者从早期至晚期。该增长还可以指示癌症在各个阶段的亚类别之间的进展，例如从第1a阶段到第1b阶段，或者从第2a阶段到第2b阶段。优选地，所述增长为至少约50%，优选地至少约60%，优选地至少约70%，优选地至少约80%，优选地至少约90%，优选地至少约100%。
优选的是当黑色素瘤特异性生物标志物以正常对照的至少约1.5倍，优选地至少约2倍，优选地至少约5倍，优选地至少约10倍，优选地至少约20倍，优选地至少约30倍，优选地至少约40倍，优选地至少约50倍，优选地至少约100倍时，优选地至少约150倍时，优选地至少约200倍时的水平存在时，指示存在黑色素瘤或者存在患黑色素瘤的风险。
本发明还提供了用于监测治疗黑色素瘤的疗效的方法，所述方法包括检测和/或定量得自患者的生物样本中黑色素瘤特异性生物标志物的存在。
优选地，本发明的方法中黑色素瘤特异性生物标志物的检测和/或定量是通过以下方式中的一种或多种进行的：MALDI-TOF、SELDI、通过与一种配体或多种配体相互作用、基于1-D或2–D的凝胶的分析系统、液相色谱、包括ICAT（R）或iTRAQ（R）的液相色谱和质谱联用技术、薄层色谱法、NMR光谱法、夹心免疫分析、酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定（RAI）、酶免疫测定（EIA）、侧向流/免疫层析试纸条检测法、免疫印迹、免疫沉淀、基于颗粒的免疫分析以及在组织切片上进行的免疫组织化学，所述基于颗粒的免疫分析包括使用金、银或乳胶颗粒，磁性颗粒或量子点（Q-dots）。
优选地，所述黑色素瘤特异性生物标志物的检测和/或定量是在微滴定板、条格式（strip format）、阵列或芯片上进行的。
优选地，所述黑色素瘤特异性生物标志物的检测和/或定量通过ELISA进行，所述ELISA包含对黑色素瘤特异性生物标志物有特异性的抗体，优选地所述的抗体与报道分子连接。
优选地，所述黑色素瘤特异性生物标志物的检测和/或定量通过生物传感器进行。
优选地，所述样本包括得自患者的生物流体或组织。优选地，所述生物流体包括血液、血清、血浆或淋巴液。优选地，所述组织包括得自肿瘤自身的细胞或周围的细胞。例如，所述组织可以包括来自创伤或痣的细胞。优选地，所述组织包括已经从创伤或痣的表面刮掉的细胞。
在本文所描述的方法的一个实例中，所述黑色素瘤特异性生物标志物的检测和/或定量包括从创伤或痣刮掉细胞，并且将该细胞与连接了可检测的标志物的抗-EN2抗体孵育。优选地，随后将该细胞在清洗溶液中清洗从而除去非结合的抗体。可以将使用从创伤或痣刮掉的细胞得到的结果与正常的对照进行比较。
还优选的是所述的生物流体大体上或完全地不含完整的/未受损伤的细胞。优选地，所述的生物流体不含血小板和细胞碎片（例如细胞溶解所产生的细胞碎片）。优选地，所述的生物流体不含原核细胞和真核细胞两者。
此类样本可以通过本领域中已知的许多方式获得，如对于本领域技术人员来说显而易见的方式。例如血液或血清样本可以通过使用例如针和注射器经胃肠外获得。不含细胞或基本上不含细胞的样本可以通过将样本经过本领域技术人员已知的各种技术，包括但不限于离心和过滤来获得。
虽然一般优选的是不使用损伤性技术来获取样本，但仍可以优选通过例如组织匀浆物、组织切片和活检标本来获得样本。
本发明的另一个方面涉及用于治疗黑色素瘤患者的方法，所述方法包括向患者给予治疗有效量的（i）本发明的生物标志物或者（ii）抗体或其片段，所述抗体或其片段特异性地结合于本发明的生物标志物。
本发明的另一个方面涉及对患者中的黑色素瘤成像的方法，所述方法包括向患者给予抗体或其片段，所述抗体或其片段特异性地结合于本发明的生物标志物。
优选地，所述抗体与可检测标志物如荧光标志物或标签结合。优选地，所述抗体是单克隆抗体。优选地，所述抗体与生长抑制剂结合。优选地，所述抗体与细胞毒性剂结合，所述细胞毒性剂例如毒素（例如免疫毒素）、抗生素、水解酶或放射性同位素。
本发明的再一个方面涉及组合物，所述组合物包含本发明的生物标志物或抗体或其片段，所述抗体或其片段结合于本发明的生物标志物。
优选地，所述组合物是药物组合物。
本发明还提供了疫苗，所述疫苗包含本发明的生物标志物或抗体或其片段，所述抗体或其片段结合于本发明的生物标志物。
本发明的又一个方面涉及黑色素瘤特异性标志物作为黑色素瘤的生物标志物的用途，所述黑色素瘤特异性标志物在体液或组织中可检测到。
优选地，所述用途为选自以下的方法中的用途：临床筛选、预后评估的方法、监测治疗结果、鉴定对于特定的治疗处理最有可能做出反应的患者的方法以及药物的筛选和开发。
本发明的又一个方面涉及（i）本发明的生物标志物，或（ii）抗体或其片段在制备用于治疗黑色素瘤的药物中的用途，所述抗体或其片段特异性结合于本发明的生物标志物。
还提供了组合物，所述组合物包含（i）本发明的生物标志物或（ii）抗体或其片段，所述抗体或其片段特异性结合于本发明的生物标志物，其中该组合物用于治疗黑色素瘤。
本发明的又一个方面涉及特异性结合于本发明的生物标志物的抗体或其片段，所述的抗体或其片段用于对患者中的黑色素瘤成像的方法。
在优选的实施方案中，本发明的方法和组合物用于早期，例如在疾病的症状出现之前的疾病的治疗或诊断。
在一些实施方案中，本发明的方法和组合物用于临床阶段的疾病的治疗或诊断。
根据本发明的另一个方面，提供了试剂盒，所述试剂盒用于以上所述的方法或用途，其中所述试剂盒包括能够结合或特异性识别黑色素瘤特异性生物标志物的配体，所述配体在体液或组织和报告装置中可检测到。
优选地，所述试剂盒是阵列或芯片。
优选地，所述试剂盒包括微滴定板、测试条、阵列或芯片。
发明详述
现参考附图来描述本发明的示例性实施方案。
图1显示了通过黑色素瘤、正常组织和接近黑色素瘤核心的正常组织（NAT）的切面图；肿瘤细胞使用抗-EN2抗体染色；
图2显示了在原发黑色素瘤细胞群“ML”和“MK”的表面上EN2蛋白的FACS分析。线图A是仅使用PE-标签的二抗的阴性对照。线图B是使用了一抗（抗-EN2）和二抗两者；向右的强位移表明抗-EN2抗体与细胞表面的结合；
图3显示了EN2的核酸序列（SEQ ID NO:1）；
图4显示了EN2的氨基酸序列（SEQ ID NO:2）；
图5显示了黑色素瘤中的EN2表达。与正常皮肤相比，黑色素瘤中EN2表达的代表性实例：A：淋巴结，右颈部的转移性恶性黑色素瘤；B：皮肤，右胸壁的恶性黑色素瘤；C：淋巴结，腋窝的转移性恶性黑色素瘤；D：正常的皮肤：没有EN2表达；
图6显示了从黑色素瘤患者中EN2-特异性CTL的产生。将来自两例黑色素瘤患者的T细胞（MEL02和MEL04）使用收集的EN2肽刺激五次，随后在51Cr-释放细胞毒性检测中测试其特异性；并且
图7显示了接种EN2延迟肿瘤的生长。将C3H小鼠中的K1735黑色素瘤肿瘤的生长使用在明矾中的EN2（佐剂：“adj”），单独的佐剂或PBS进行免疫。
本发明涉及黑色素瘤特异性生物标志物。
在世界范围内黑色素瘤发生率在近年来稳定增长。尽管当原发性肿瘤微弱时外科切除是有效的，但在该疾病的较晚阶段，由于无法控制转移患者经常死亡。现在一些研究显示，在患有晚期转移性黑色素瘤的患者中存在细胞介导的免疫力。因此，识别和靶向在临床上相关的抗原用于免疫疗法为治疗转移性黑色素瘤患者提供了有希望的替代策略。如本文所讨论的，我们识别了一种该有希望的靶抗原，同源框转录因子ENGRAILED2（EN2）。EN2特异性地涉及到产生小脑的区域的成型中，但是最近显示出在乳腺癌和前列腺癌中是候选的癌基因。在对高密度的恶性黑色素瘤组织阵列进行了免疫组织化学研究后，我们发现分别有60%和57%的恶性黑色素瘤和转移性黑色素瘤表达EN2（图5）。与此相比在正常皮肤或其他正常组织中没有EN2的表达。
在本说明书中，将术语“包含（comprises）”和“包含（comprising）”解释为指“除了其他的以外，包括”。无意于将这些术语解释为“仅由…组成”。
在本说明书中，术语“约”意思是加或减20%，更优选地加或减10%，甚至更优选地加或减5%，最优选地加或减2%。
如本文所使用的，术语“治疗有效量”表示为了降低由所讨论的疾病（disease in question）引起的至少一种病症或症状的严重程度和/或改善由所讨论疾病引起的至少一种状况或症状，所需要的组合物的量。
在本说明书中，实施方案以使所撰写的说明书能够清楚和简要的方式来进行描述，但期待并且应认识到的是，在不脱离本发明的前提下，可以将实施方案进行多种组合或分离。
对于临床应用，将根据本发明的化合物或其前药形式配制为与预期的给药途径相容的药物制剂，所述给药途径例如经口服给药、直肠给药、胃肠外给药或其他给药方式给药。通常通过将活性物质与常规的药学上可接受的稀释剂或载体混合来制备药物制剂。如本文所用使用的，术语“药学上可接受的载体”意欲包括任意和所有与药物给药相容的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。药学上可接受的稀释剂或载体的实例为水、明胶、阿拉伯胶、乳糖、微晶纤维素、淀粉、羧甲淀粉钠、磷酸氢钙、硬脂酸镁、滑石粉、胶态二氧化硅等。用于药学上有活性的物质的该介质和试剂的应用在本领域中是熟知的。除非任何常规介质或试剂与活性化合物不相容，其在组合物中的应用是预期的。
该制剂也可以包含其他药理活性剂和常规添加剂，所述常规添加剂例如稳定剂、润湿剂、乳化剂、调味剂、缓冲剂等。
所述的制剂还可以通过已知的方法制备，例如造粒、压缩、微胶囊化、喷涂等。可以通过常规方法，以片剂、胶囊剂、颗粒剂、粉末、糖浆剂、混悬剂、栓剂或注射剂的剂型，制备所述制剂。液态制剂可以通过将活性物质溶解或悬浮于水或其他适宜的溶媒中来制备。片剂和颗粒剂可以采用常规方式涂覆。
用于经胃肠外、皮内或者皮下应用的溶液或悬液可以包含以下的组分：无菌稀释剂如注射用水、盐溶液、非挥发性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或者其他的合成溶剂；抗细菌剂如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂如抗坏血酸或重亚硫酸钠；螯合剂如乙二胺四乙酸；缓冲剂如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐以及渗涨度调节剂如氯化钠或葡萄糖。可以使用酸或者碱例如盐酸或者氢氧化钠调节pH。胃肠外制剂可以装入安瓿瓶、一次性注射器或者玻璃或塑料制成的多次给药小瓶中。
适用于可注射使用的药物组合物包含无菌的水溶液（在水溶性的情况下）或者用于临时制备无菌的可注射溶液或分散剂的分散剂和无菌粉末。对于静脉给药，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor ELTM（BASF，Parsippany，NJ）或者磷酸盐缓冲液（PBS）。在所有的情况下，组合物必须是无菌的，并且应流体化到可容易地注射的程度。其必须在制备和储存的条件下稳定，并且必须对例如细菌和真菌等微生物的污染作用具有保护。所述的载体可以是溶剂或者分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇（例如甘油、丙二醇和液态的聚乙二醇等等）以及其适合的混合物。可以通过使用如卵磷脂的包衣，在分散剂的情况下通过保持所需要的颗粒大小，以及通过表面活性剂的使用来保持合适的流动性。微生物作用的预防可以通过多种抗细菌和抗真菌剂来实现，抗细菌和抗真菌剂例如对羟基本甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞（thimerosal）等等。在多种情况下，优选的是在组合物中包含等渗剂，如糖，多元醇如甘露醇、山梨醇、氯化钠。可注射的组合物的延长吸收可以通过在组合物中包含延迟吸收的试剂例如单硬脂酸铝和明胶来实现。
无菌的可注射溶液可以通过将需要量的活性化合物（例如根据本发明的实施方案的化合物），根据需要与以上列举的一种成分或这些成分的组合一起合并到适合的溶剂中，随后进行无菌过滤来制备。一般地，分散剂是通过将活性化合物合并到无菌溶媒中来制备的，所述的无菌溶媒含有基础分散介质以及需要的来自前文所列举的其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冻干，其产生来自其此前经无菌过滤的溶液的活性成分与任意其他需要的成分的粉末。
口服组合物通常地包括惰性的稀释剂或者可食用的载体。其可以装入明胶胶囊中或者压制成片剂。为了口服治疗给药的目的，可以将活性化合物与赋形剂合并，并且以片剂、锭剂或者胶囊剂的形式使用。口服组合物也可以使用用作漱口剂的流体载体制备，其中在流体载体中的化合物经口应用，漱后吐出或者吞下。药学上相容的粘合剂，和/或佐剂物质可以作为组合物的部分包括在内。所述的片剂、丸剂、胶囊剂、锭剂等等可以含有任意的下列组分，或者具有类似性质的化合物：粘合剂如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂如淀粉或乳糖；崩解剂如褐藻酸、Primogel或者玉米淀粉；润滑剂如硬脂酸镁或者Sterotes；助流剂如胶态二氧化硅；甜味剂如蔗糖或糖精；或者调味剂如薄荷油、水杨酸甲酯或橙香精。
对于通过吸入给药，化合物以气雾喷雾的形式进行递送，所述的气雾喷雾来自加压容器或分配器或喷雾器，所述的加压容器或分配器含有合适的推进剂如气体，例如二氧化碳。
全身性给药也可以通过透过粘膜或者透过真皮的方式进行。对于经粘膜给药或者经皮给药，在制剂中使用适于渗透屏障的渗透剂。该渗透剂在本领域中一般是已知的，并且包括，例如对于经粘膜给药，包括去垢剂、胆汁盐和夫西地酸衍生物。可以通过使用经鼻喷雾或者栓剂来实现经粘膜给药。对于经皮给药，将活性化合物配制成本领域中一般而言已知的软膏、药膏、凝胶或乳霜。
化合物还可以制备成栓剂的形式（例如与常规的栓剂基质如可可脂和其他的甘油酯一起）或者用于直肠递送的保留灌肠剂（retention enemas）。
在一个实施方案中，将活性化合物与将保护该化合物不从体内快速消除的载体一起进行制备，如控释制剂，包括植入物和微胶囊化的递送系统。可以使用生物可降解的、生物相容的聚合物，所述的聚合物如乙烯醋酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备该制剂的方法对于本领域的技术人员而言是显而易见的。该材料也可以商购得自Alza Corporation和Nova Pharmaceuticals Inc。脂质体悬液（包括靶向受感染的细胞的脂质体，具有针对病毒抗原的单克隆抗体）也可以用作药学上可接受的载体。这些可以根据本领域技术人员已知的方法进行制备。
为了便于给药和便于保持剂量的均匀，尤其有利的是将经口服或经胃肠外的组合物按照剂量单位形式进行配制。在本文中使用的剂量单位形式指对所治疗的受试者而言，适于用作单一剂量的物理上分离的单元；每个单元含有与所需要的药物载体结合的、经计算产生想要的治疗效果的预先确定量的活性化合物。活性化合物的独特性质和将要达到的具体治疗效果，以及将该活性化合物混配用于治疗个体的领域中的固有限制规定并直接决定了本发明的剂量单位形式的规格。
该化合物的毒性和疗效可以通过标准药物规程在细胞培养物中或试验动物中进行确定，例如，测定LD50（对于50%的群体致死的剂量）和ED50（对于50%的群体在治疗上有效的剂量）。毒性作用和治疗效果之间的剂量比是治疗指数，并且其可以表示为LD50/ED50的比率。显示出大的治疗指数的化合物是优选的。尽管可以使用显示出毒副作用的化合物，但应仔细设计递送系统，该系统将该化合物靶向到所影响的组织的部位，从而使对未感染的细胞的潜在损伤最小化，从而减少副作用。
从细胞培养物检测和动物研究中所得到的数据可以用于配制多个用于人的剂量。该化合物的剂量优选地在循环浓度范围内，该循环浓度范围包括具有很小的或没有毒性的ED50。所述的剂量可以依据所采用的剂型和所使用的给药途径在此范围内变化。对于本发明的方法中使用的任意化合物，治疗上有效的剂量可以最初从细胞培养物检测中进行估计。可以在动物模型中配制剂量从而达到循环血浆浓度范围，所述的循环血浆浓度范围包括在细胞培养物中所测定的IC50（即达到症状的半数最大抑制的测试化合物的浓度）。该信息可以用于更准确地确定用于人的剂量。可以例如通过高效液相色谱法来测定血浆中的水平。
药物组合物可以与使用说明书一起包括于容器、包装或分配器中。
在本说明书中，如本领域中已知的，“同源性”是两个或多个多肽序列或者两个或多个多核苷酸序列之间的关系，该关系是通过比较其序列进行确定的。在本领域中，“同源性”还表示在多肽或多核苷酸序列之间序列相关的程度，在这一情况下其可以是该序列的链之间的匹配所确定的。百分比同源性可以通过已知的方法容易地计算，所述的方法包括，但不限于以下所描述的那些：Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.,ed.,Oxford University Press,New York,1988;Biocomputing:Informatics andGenome Projects,Smith,D.W.,ed.,Academic Press,New York,1993;ComputerAnalysis of Sequence Data,Part I,Griffin,A.M.,和Griffin,H.G.,eds.,Humana Press,New Jersey,1994;Sequence Analysis in Molecular Biology,vonHeinje,G.,Academic Press,1987;以及Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.和Devereux,J.,eds.,M Stockton Press,New York,1991;以及Carillo,H.,和Lipman,D.,SIAM J.Applied Math.,48:1073(1988)，其全部引入本文作为参考。用于测定同源性的优选的方法设计为在测试的序列之间提供最大的匹配。用于测定同源性的方法在公开可获得的计算机程序中被代码化。用于测定两个序列之间的百分比同源性的优选的计算机程序方法包括，但不限于：GCG程序包（Devereux,J.,等人,Nucleic Acids Research 12(1):387(1984)，其全部引入本文作为参考）、BLASTP、BLASTN和FASTA（Atschul,S.F.等人,J.Molec.Biol.215:403-410(1990)，其全部引入本文作为参考）。BLASTX程序可从NCBI和其他来源公开得到（BLAST Manual,Altschul,S.,等人,NCBI NLM NIH Bethesda,Md.20894;Altschul,S.,等人,J.Mol.Biol.215:403-410(1990)，其全部引入本文作为参考）。作为举例说明，与“SEQ IDNO:A”的参考核苷酸序列具有至少例如95%的“同源性”的核苷酸序列的多核苷酸意图表示该多核苷酸的核苷酸序列与参考序列相同，除了在“SEQID NO:A”的参考核苷酸序列的每100个核苷酸中，多核苷酸序列可以包括至多5个点突变以外。换言之，为了得到与参考核苷酸序列具有至少95%同源性的核苷酸序列的多核苷酸，可以将参考序列中至多5%的核苷酸缺失或使用另一核苷酸取代，或者可以将参考序列中的总核苷酸的至多5%的多个核苷酸插入到参考序列中。参考序列的这些突变可以发生在参考核苷酸序列的5’或者3’末端位置，或者在那些末端位置之间的任意位置，单个地散布于参考序列的核苷酸之间，或者位于参考序列内的一个或多个连续组中。类似地，与“SEQ ID NO:B”的参考氨基酸序列具有至少例如95%的同源性的氨基酸序列的多肽意图表示该多肽的氨基酸序列与参考序列相同，除了在“SEQ ID NO:B”的参考氨基酸序列的每100个氨基酸中，多肽序列可以包括至多5个氨基酸的改变以外。换言之，为了得到与参考氨基酸序列具有至少95%同源性的氨基酸序列的多肽，可以将参考序列中至多5%的氨基酸残基缺失或使用另一氨基酸取代，或者可以将参考序列的总氨基酸残基的至多5%的多个氨基酸插入到参考序列中。参考序列的这些改变可以发生在参考氨基酸序列的氨基或者羧基末端的位置，或者在那些末端位置之间的任意位置，单个地散布于参考序列的氨基酸之间，或者位于参考序列内的一个或多个连续的组中。
如本文所使用的，术语“在严谨条件下杂交”意图描述用于杂交和洗涤的条件，在该条件下编码受体的、彼此具有至少50%同源性的核苷酸序列通常保持与彼此杂交。该条件可以使得至少约65%，至少约70%，或者至少约75%或者更高的彼此同源性的序列通常保持与彼此杂交。该严谨的条件对于本领域的技术人员而言是已知的，并且可以在Current Protocols inMolecular Biology,John Wiley&Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6中找到，其全部引入本文作为参考。严谨的杂交条件的一个实例是用6X的氯化钠/柠檬酸钠（SSC）在约45℃下进行杂交，随后用0.2X SSC，0.1%SDS于50-65℃下清洗一次或多次。在一个实施方案中，在严谨的条件下与SEQ ID NO:1的序列杂交的经分离的受体核酸分子对应于天然存在的核酸分子。如本文中所使用的，“天然存在的”核酸分子是指具有在自然界中存在（例如，编码天然蛋白质）的核苷酸序列的RNA或者DNA分子。
在本说明书中，“抗体或抗体片段”是指无论是否来源于自然地产生抗体的任何物种或者由重组DNA技术生成的；无论是否分离自血清、B-细胞、杂交瘤、转染瘤、酵母或细菌的抗体（例如IgG、IgM、IgA、IgD或IgE）或片段（例如Fab、F(ab')2、Fv、二硫化物连接的Fv、scFv、闭合式构象的多特异性抗体、二硫化物连接的scFv、双抗体(diabody)）。
在本说明书中，术语“治疗”表示存在的疾病的治疗和/或为了预防疾病的发生而进行的预防性治疗。从而本发明的方法可以用于疾病的治疗、预防，进展的抑制或者延迟疾病的发生。
术语“生物标志物”在本领域中广泛使用并且表示过程、事件或条件的明显的生物的或者生物上得到的指示剂。换句话说，生物标志物指示某些生物状态例如癌组织的存在。在一些情况下，不同形式的生物标志物可以指示某些疾病状态，但不受理论的束缚，认为在体液或组织中，仅在本发明生物标志物存在升高的水平时指示黑色素瘤。尽管当前未设想，例如分泌EN2肽的不同的糖型（glycoform），但这些也由本发明所涵盖。例如，EN2的不同的糖型，如改变的糖型结构或糖含量仍旧可以确定，但这些涵盖并且甚至也可以指示黑色素瘤的进展。还设想了EN2肽或其片段的截短、突变或缺失或者与EN2肽或其片段的连接。
如以上所讨论的，出人意料地发现，EN2基因在黑色素瘤中的表达与在正常组织中的表达相比具有显著性增加。此外，在黑色素瘤患者的生物流体，如血液或血清中发现了EN2。认为，由于损伤的细胞或死亡细胞的渗漏，EN-2可以分泌到体液中或者可以在体液中检测到。这种增加的水平指示早期和晚期黑色素瘤。在对照或正常水平与早期黑色素瘤之间具有显著性上升的同时，在早期和晚期黑色素瘤之间仍具有非常显著性的上升。总地来说，本发明的优点是可以检测癌症的物质以及也可以检测癌症的状态。这有助于对适当的疗法进行预后和规定。
本发明的又一个优点是可以在不借助于令人不愉快和潜在有害的侵入性程序的情况下提供准确的诊断，其中所述令人不愉快的和潜在地有害的侵袭性程序也可以是不准确的。此外，本发明尤其灵敏。优选地，本发明的方法可以在任何其他检测方法之前和癌症的明显症状出现之前检测到癌症的发病。因此，可以在其更容易受该治疗的影响并且不太可能进入转移阶段的早期治疗癌症。
本发明的生物标志物可以用于诊断的方法例如临床筛查和预后评估的方法中，从而监测治疗的结果、鉴定最可能对特定治疗处理有反应的患者、进行药物筛选和开发。此外，本发明的生物标志物和其用途对于新的药物治疗的鉴定和对于药物治疗的新靶点的发现有价值。
术语“诊断”涵盖对于黑色素瘤的存在或不存在以及其发展阶段，例如早期或晚期或者良性癌症或转移性癌症的鉴定、确认和表征。
实施例
黑色素瘤中EN2蛋白的免疫组织化学（ICH）检测
我们的研究显示了EN2蛋白存在于黑色素瘤中但在周围正常组织中不存在。这可以使用高密度组织阵列（Biomax Melanoma阵列，cat#ME2082）来实现，所述的高密度组织阵列包含不同的黑色素瘤样本以及接近黑色素瘤的正常组织（NAT），以及来自其他位点的正常皮肤组织（“正常”）。结果总结在图1中。
Figure BDA00001723623000151
EN2存在于原发性黑色素瘤细胞的表面上
对于EN2蛋白在细胞表面上的存在，使用抗-EN2抗体和使用荧光标签PE的荧光活化细胞分选（FACS）评价了两种得自黑色素瘤的原位细胞群。这显示了两组的细胞在细胞表面上具有非常高水平的EN2蛋白（图2）。
方法
EN2的酶染色
1.使用三个变化的100%二甲苯对载玻片进行脱蜡5分钟
2.用100%乙醇清洗两次
3.0.3%甲醇/H2O2(300ml甲醇+900μl H2O2)中20分钟
4.用70%和50%的系列的乙醇再水化
5.用蒸馏水冲洗载波片5分钟
6.在pH 6.0的沸腾柠檬酸缓冲液中孵育载波片12分钟*
7.使切片静置冷却2个小时
8.用蒸馏水清洗3分钟
9.用PBS清洗两次，每次3分钟
10.在潮湿室内，用在1%PBS/BSA中2.4%的马血清溶液孵育切片15分钟。（封闭血清需采自与2°Ab相同的物种）。
11.在潮湿室内，在室温下用1°抗体（Abcam山羊-抗EN2）孵育过夜
12.用PBS清洗3次，每次3分钟。
13.用稀释的生物素化“通用的”二抗将切片孵育30分钟。
14.用PBS清洗3次，每次3分钟。
15.用VECTASTAIN R.T.U.ABC试剂孵育切片30分钟。
16.用PBS清洗3次，每次3分钟。
17.在过氧化物酶底物溶液中孵育切片直至显示需要的染色强度
18.（使用冲击DAB溶液，每个切片10分钟）
19.用蒸馏水冲洗切片。
20.复染，（苏木精QS:100μl/载玻片，最多45秒）并将载玻片放回流动的自来水中
21.将载玻片在系列的乙醇（50%、70%、100%）和二甲苯1、2、3中脱水，将各个载玻片快速浸入。
22.使用VectaMount封固培养基封固载玻片并在室温下储存载玻片
*用0.01M柠檬酸缓冲液pH6.0回收经微波的抗原
1.由储备液制备0.01M柠檬酸缓冲液：用蒸馏水1:10稀释
2.测量pH并用0.1M柠檬酸缓冲液调节至pH 6.0
3.将1L柠檬酸缓冲液注入到塑料容器中并微波20分钟
4.将置于架上的切片加至沸腾的柠檬酸缓冲液中并微波进一步处理12分钟
制备0.3%H2O2：
300ml甲醇
900μl H2O2（30%）过氧化氢酶
由imPACT DAB制备过氧化氢酶底物血清：
1ml稀释液和1滴发色团（Chromogen）
从黑色素瘤患者中产生EN2-特异性的CTL以及EN2接种
我们使用反向免疫策略来识别几种免疫原性的HLA-A2限制性的EN2表位，使用该表位我们能够从HLA-A2阳性的健康对照供体以及黑色素瘤患者产生EN-2特异性的CTL应答。结果显示在图6中。
由于最大免疫疗法潜力是通过可以同时引发细胞介导的应答和体液应答的抗原来实现的，为了得到针对EN2的IgG自身抗体，我们从大的黑色素瘤患者的队列中筛选血清，并且将其与来自无癌症病史的健康适龄供体的对照血清进行比较。
我们的初步数据显示在小鼠的黑色素瘤模型中EN2接种带来有益的效果，其中经接种的动物产生的肿瘤比对照远远更小（图7）。
这些动物对疫苗也具有阳性召回抗原反应的事实表明肿瘤的出现可能是免疫介导的。从这些数据中我们总结得出，EN2对于黑色素瘤免疫疗法是有希望的靶。
应当理解，本文所描述的对于本发明优选的实施方案的多种改变和修改对于本领域的技术人员而言是显而易见的。可以在不脱离本发明的精神和范围的情况下以及在不减少其伴随的优点的情况下进行此种改变和修改。因此期待该改变和修改由所附的权利要求所覆盖。

Claims (24)

1.一种黑色素瘤特异性生物标志物，其包含：
（i）包含SEQ ID NO:1的核酸序列，或其片段或变体，或包含所述核酸序列的核酸分子；或者
（ii）包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，或其片段或变体，或包含所述氨基酸序列的氨基酸分子。
2.根据权利要求1所述的生物标志物，其中所述的其片段或变体包含：
(i)与SEQ ID NO:1具有至少约50%，或至少约60%，或至少约70%，或至少约75%，或至少约80%，或至少约85%，或至少约90%，或至少约95%，或至少约96%，或至少约97%，或至少约98%，或至少约99%的核酸序列同源性的核酸序列；在严谨条件下与其可杂交的核酸序列；和/或与其互补的核酸序列；
(ii)与SEQ ID NO:2具有至少约50%，或至少约60%，或至少约70%，或至少约75%，或至少约80%，或至少约85%，或至少约90%，或至少约95%，或至少约96%，或至少约97%，或至少约98%，或至少约99%的氨基酸序列同源性的氨基酸序列；或者
(iii)由(i)的核酸序列编码的氨基酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的生物标志物，其中所述的其片段包含：(i)来自SEQ ID NO:2的至少4个，优选地至少5个，优选地至少6个，优选地至少7个，优选地至少8个连续的氨基酸或者(ii)SEQ ID NO:1的核酸序列的片段，所述SEQ ID NO:1的核酸序列的片段编码来自SEQ IDNO:2的至少4个，优选地至少5个，优选地至少6个，优选地至少7个，优选地至少8个连续的氨基酸。
4.根据前述任一项权利要求所述的生物标志物，其中所述的其片段或变体是其功能性片段或变体。
5.一种用于诊断患者中的黑色素瘤或者用于鉴定处于患黑色素瘤的风险中的患者的方法，所述方法包括：
(a)在得自患者的样本中，测定根据前述任一项权利要求所述的黑色素瘤特异性生物标志物的量；
(b)比较来自患者的样本中测定的该黑色素瘤特异性生物标志物的量与正常对照中该黑色素瘤特异性生物标志物的量；
其中来自患者的样本中黑色素瘤特异性生物标志物的量与正常对照中黑色素瘤特异性生物标志物的量相比较的差异与黑色素瘤的存在相关联或者与患黑色素瘤的风险相关联。
6.根据权利要求5所述的方法，所述方法用于检测早期黑色素瘤，其中在对照和得自患者的样本之间的增加指示早期黑色素瘤。
7.根据权利要求5所述的方法，所述方法用于检测晚期黑色素瘤，其中在对照和得自患者的样本之间的增加指示晚期黑色素瘤。
8.一种用于监测患者中黑色素瘤的进展的方法，所述方法包括：
(a)在得自患者的样本中，测定根据权利要求1至4中任一项所述的黑色素瘤特异性生物标志物的量；
(b)比较来自患者的样本中测定的该黑色素瘤特异性生物标志物的量和正常对照中该黑色素瘤特异性生物标志物的量；和
(c)在两个或多个时间间隔内重复步骤(a)和(b)，
其中来自患者的黑色素瘤特异性生物标志物的量随时间的增加与黑色素瘤进展的增加相关，并且来自患者的黑色素瘤特异性生物标志物的量随时间的减少与黑色素瘤进展的降低有关。
9.根据权利要求8所述的方法，所述方法用于监测黑色素瘤的阶段的变化，其中相对于早期样本或对照的增加指示黑色素瘤从疾病的早期进展至晚期。
10.一种用于监测黑色素瘤治疗的疗效的方法，其包括在得自患者的样本中，检测和/或定量根据权利要求1至4中任一项所述的黑色素瘤特异性生物标志物的存在。
11.根据权利要求5至10中任一项所述的方法，其中所述样本包括得自患者的生物流体或组织。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述生物流体或组织包括血液、血清、血浆和/或淋巴液。
13.一种用于治疗黑色素瘤患者的方法，所述方法包括向患者给予治疗有效量的（i）根据权利要求1至4中任一项所述的生物标志物或者（ii）抗体或其片段，所述抗体或其片段特异性地结合于根据权利要求1至4中任一项所述的生物标志物。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述抗体与细胞毒性剂结合。
15.一种用于对患者中的黑色素瘤成像的方法，所述方法包括向患者给予抗体或其片段，所述抗体或其片段特异性地结合于根据权利要求1至4中任一项所述的生物标志物。
16.根据权利要求13至15中任一项所述的方法，其中所述抗体与可检测标志物结合。
17.一种组合物，其包含根据权利要求1至4中任一项所述的生物标志物或者抗体或其片段，所述抗体或其片段结合于根据权利要求1至4中任一项所述的生物标志物。
18.一种药物组合物，其包含根据权利要求17所述的组合物。
19.一种黑色素瘤疫苗，其包含根据权利要求1至4中任一项所述的生物标志物。
20.根据权利要求1至4中任一项所述的黑色素瘤特异性生物标志物作为黑色素瘤的生物标志物的用途，所述黑色素瘤特异性生物标志物在体液或组织中可检测到。
21.（i）根据权利要求1至4中任一项所述的生物标志物或者（ii）特异性地结合于根据权利要求1至4中任一项所述的生物标志物的抗体或其片段在制备用于治疗黑色素瘤的药物中的用途。
22.一种组合物，其包含（i）根据权利要求1至4中任一项所述的生物标志物或者（ii）特异性地结合于根据权利要求1至4中任一项所述的生物标志物的抗体或其片段，其中所述组合物用于黑色素瘤的治疗。
23.一种抗体或其片段，其用于对患者中的黑色素瘤成像的方法中，所述抗体或其片段特异性地结合于根据权利要求1至4中任一项所述的生物标志物。
24.一种试剂盒，其用于根据权利要求5至16中任一项所述的方法中或根据权利要求20所述的用途中，其中所述试剂盒包括能够结合或特异性地识别根据权利要求1至4中任一项所述的黑色素瘤特异性生物标志物的配体，所述配体在体液或组织和报告装置中可检测到。
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