CN102791307B - 通过体外疗法除去毒力因子 - Google Patents

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Abstract

通过使血经过具有被固定的碳水化合物(例如肝素)的表面滤芯从受感染的血中除去毒力因子的方法，其中毒力因子是病原体(例如炭疽芽胞杆菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌)释放的毒素。

Description

通过体外疗法除去毒力因子
发明领域
本发明涉及从血或血清(血)除去病原体和/或从病原体释放的毒素的方法，所述方法通过将血与固体的(solid)、基本上无孔的基底相接触来实现，所述基底已经用肝素、硫酸肝素和/或针对待除去的病原体和/或毒素(吸附物(adsorbents))具有结合亲和性的其它分子或化学基团(吸附介质或介质(theadsorbentmediaormedia))表面处理过。本发明可用于除去释放自病原体(例如炭疽芽胞杆菌(Bacillusanthracis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaureginosa)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus))的毒力因子，例如毒素。在一个方面，所述介质内的空隙通道的尺寸与介质表面积(surfacearea)的量和介质上结合位点的表面浓度平衡过，以提供足够的吸附能力，同时还允许血经过介质的相对高的流速。
本发明还提供了通过从血中除去病原体和/或来自病原体的毒素来治疗疾病的方法，这通过将血与基本上无孔的、涂布有肝素和/或其他吸附剂材料的基底接触来实现，本发明还提供了用于进行所述方法和治疗的设备。
背景
多种疾病的特征在于血流中存在升高浓度的病原体和/或毒素。通过设计来杀死病原体的疗法来治疗一些此类疾病，例如通过施用抗感染的药物来进行。通过试图降低患者血液中携带的病原体或毒素的浓度的疗法，来治疗一些其它疾病。通过试图直接从患者血中除去仅一些特定组分的疗法，来治疗其它疾病。
例如，格林巴利综合征目前被理解为病毒感染诱发的自身免疫性病症，所述病毒感染刺激机体免疫系统过度产生能攻击患者神经系统的抗体或其它蛋白质，导致麻痹(paralysis)水平增加。大多数患者随着时间而恢复，但此类患者看起来对之后病毒感染的病况复发易感。用于治疗格林巴利综合征的一种方法涉及血浆去除术(plasmapheresis)，以通过除去被认为攻击患者神经系统的抗体来“清洁”患者的血。
肝素是可分离自哺乳动物组织的多糖。其在哺乳动物组织中具有非常特异性的分布；其仅存在于肥大细胞的嗜碱性颗粒中。从美国科学家MeLean于1916年发现其以来，已经认识到了肝素预防血凝结的能力以及其在机体内的相对较短的半寿期。通过注射游离药物(freedrug)施用的全身性肝素已作为安全有效的血液抗凝剂以及抗血栓形成剂临床使用了超过50年。肝素对于血液凝结/凝血的作用在施用停止后相当迅速地减少，这使得可在手术和其它操作期间有效且安全地使用肝素。即，肝素的抗凝剂和抗血栓形成剂性质可在很多医药操作期间使用，例如用于使得血和体外循环的人造表面之间不期望的相互作用最小化。一旦操作结束，即可终止肝素的施用。患者血中的肝素浓度在数小时内减少至安全水平。当愈合依赖于在手术位点的凝血能力以避免出血并发症时，这点在手术后特别重要。除了其已良好建立的并持续用于对血栓样病症的治疗和对表面诱导的血栓形成的预防的用途之外，更近来已发现肝素具有与其作为抗凝剂的功能看似无关的广泛的其它功能。例如，现已知，血中的大量蛋白质能以高亲和性与肝素和/或密切相关的多糖硫酸肝素(也被发现于动物组织中，包括健康血管腔(luminal)表面)结合。例子是抗凝血酶(AT)、纤连蛋白、玻连蛋白、生长因子(例如成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子等等)。人血清白蛋白(HSA)也能结合，但亲和性较低，虽然其在血液中浓度较高。
之前已考虑利用全身性/游离肝素的选择性吸附性质以阻止感染，这通过将肝素片段和/或所谓的含涎酸片段(sialic-containingfragments)引入血管系统而完成。提出的这种疗法基于下述假设：这些片段将结合微生物上的凝集素，并封闭它们，使得它们无法与哺乳动物细胞表面上的受体结合。虽然该手段已被很多科学家研究过，但迄今为止仅报道了有限的成功。最常见的问题是与被引入血液系统以实现对病原性微生物的临床有效降低的大量游离肝素相关的出血并发症。本发明不需要使用游离的全身性肝素，并且由此避免了出血并发症。这通过将肝素或硫酸肝素与具有高的表面积的固体基底永久结合，并将血暴露给含有该吸附介质的滤芯(cartridge)或滤器(filter)来实现。
待治疗的一种特殊的重要疾病是炭疽。炭疽芽孢杆菌这种细菌是天然存在的细菌，其产生能保持休眠数年的芽孢，例如休眠于土壤中或动物上。该疾病对动物来说可以是致命的。对于人的感染而言，芽孢必须进入机体内，这通常是通过皮肤切口或通过消费了受污染的肉类导致的。但是近来，对生物恐怖主义的关注已集中于吸入芽孢导致的感染。当吸入时，机体免疫系统可被迅速击败，进入休克状态。
炭疽毒素(也被称为“炭疽致死性毒素”或“LT”)由三种非毒性蛋白质构成，所述蛋白质以二元或三元的组合，在哺乳动物细胞表面形成毒性复合体。这些蛋白质之一是保护性抗原(PA)，其运送两种其他两种蛋白质——水肿因子(EF)和致死因子(LF)至胞质溶胶。LF是Zn2+-蛋白酶，其切割某些MAP激酶激酶，这经由未被很好定义的事件串导致宿主死亡。EF是钙调蛋白和Ca2+依赖性的腺苷酸盐/酯环化酶，其导致疾病中可见的水肿。两种酶均被认为是通过抑制了宿主的天生免疫系统的细胞而有利于细菌。毒性复合体的装配在PA与细胞受体结合并被弗林(furin)蛋白酶切割为两条片段之后开始。较小的片段解离，这允许与受体结合的片段PA63(63kDa)自身联结并形成环形七聚的孔的前体(前孔(prepore))。前孔结合至多三个分子的EF和/或LF，得到的复合体被内吞，并被运输至酸性区室。前孔在此转化为跨膜孔，介导EF和LF转运至胞质溶胶。近来的研究已经揭示了(a)受体的身份；(b)三种毒素蛋白质和七聚PA63前孔的晶体结构；以及(c)关于毒素装配、进入和在胞质溶胶内的作用的信息。关于毒素的结构和作用模式的知识已展示了在医药领域的可能应用，包括用于治疗炭疽感染的手段Collier，R.J.，Rev.Microbiol.，2001；27(3)：167-200(通过引用并如本文)。
已经鉴定了针对PA的两种人细胞受体。一种称为炭疽毒素受体(ATR)，其是肿瘤内皮标志物8(TEM8)基因编码的。其在巨噬细胞系的表面上出现超过一万倍。ATR的截短、可溶形式(缺少膜锚定序列)能保护细胞培养物以抵挡炭疽毒素的致死作用。ATR在多种组织(包括中枢神经系统、心脏、肺和淋巴细胞)中表达。ATRcDNA编码368个氨基酸的蛋白质。预测其具有27个氨基酸的前导序列、293个氨基酸的细胞外结构域、23个残基的跨膜结构域和羧基末端的短胞质尾。
具有针对PA的受体功能的另一细胞蛋白质是毛细血管形态发生蛋白2(CMG2)。ATR和CMG2均含有与参与结合的A型vonWilldebrand因子(VWA)结构上相关的结构域。CMG2-VWA的结构是已知的。
类似其它杆菌，炭疽芽孢杆菌能分化为休眠芽孢，其可在不利的环境条件下持续数年。只要可获得养分，芽孢将萌发为营养性细胞。这可在人或动物的皮肤上或肺中发生。一旦在机体内，芽孢杆菌生长至高滴度，这在攻克宿主防御的毒素辅助下进行。除了毒素之外，还有其它组分(聚-D-谷氨酸荚膜)贡献于毒力。荚膜和毒素两者均在细菌所携带的质粒上编码。
针对感染的保护可通过免疫接种来获得。经许可的疫苗是来自产毒但无荚膜的炭疽芽孢杆菌的孢子，或氢氧化铝吸附的不含细胞的PA。使用减毒的活疫苗可具有局部副反应，并且并不非常有效。通过将PA基因工程化进原本无质粒的细菌菌株，构建了仍在实验中的疫苗。通常不进行人免疫接种，因为天然的炭疽感染相当稀少。
早期阶段，感染可被抗生素治愈，选用环丙沙星作为药物。未被识别的感染通常是致命的。抗毒素治疗(例如用针对PA的免疫球蛋白或与毒素因子的结合竞争的合成肽)可有助于战胜严重的感染。
附图简述
图1A和B)7702和9131的指数培养物应用至对照或肝素珠粒，接着进行ELISA型检验，以测定PA量(报道为吸光度的值)的变化。B)在添加上清液之前，FBS经过对照和肝素珠粒二者五次。
图2通过肝素化的介质保护巨噬细胞抵挡PA。
图3经过肝素化的珠粒之后USA300MRSAα-毒素的降低。
发明内容
本发明的一个目的是提供从哺乳动物的血中除去病原体或来自病原体的毒素的方法，所述方法通过将血与固体的、基本上无孔的基底接触来实现，所述基底上涂布有肝素、硫酸肝素和/或任选地其它选择性吸附分子、生物分子或化学基团。
本发明的另一目的是提供治疗由炭疽芽孢杆菌、铜绿假单胞菌或金黄色葡萄球菌导致的疾病的疗法，所述疗法通过从哺乳动物的血中除去病原体或来自病原体的毒素来进行，这通过将血与固体的、基本上无孔的、涂布有肝素(以及任选地，其它选择性吸附分子)的基底接触，并将血返回到遭受疾病的患者中来实现。
上述目的并不意欲以任何方式限制本发明的范围。
发明详述
1.从血中除去病原体或毒素
本发明的第一个方面提供了从血(例如哺乳动物的血)中除去病原体和/或毒素的方法，所述方法通过将血与固体基底(例如，涂布有肝素的)接触来实现。
在该方法中，肝素被固定到基底表面上。本发明的发明人发现，与表面结合的被固定的肝素能有效从血中除去显著量的病原体、毒素和/或毒力因子。毒力因子是从病原体(例如炭疽芽孢杆菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌)释放的毒素，所述毒素允许病原体移殖(colonize)宿主细胞、避开宿主免疫应答、允许进入和离开宿主细胞，以及从细胞获得养分。很多毒力因子靶向蛋白聚糖，例如细胞表面多配体聚糖(syndecan)上的硫酸类肝素(heparansulfate)。肝素在结构上与硫酸类肝素非常相似，其也将结合毒性因子。因此，使得受感染的血经过高表面积的、具有表面结合的碳水化合物(例如肝素)的滤芯，可除去正常情况下将危害内皮细胞表面导致移殖(colonization)的毒力因子。通过除去这些毒力因子，内皮细胞表面将得到更多保护，并且允许传统的抗生素杀死导致感染的有害细菌。
多配体聚糖是含有硫酸类肝素蛋白聚糖片断(HSPG)的跨膜蛋白，其存在多种细胞类型上。一段时间以来已知HSPG能调控多种生物过程，所述生物过程范围从凝血级联、生长因子信号过程、脂肪酶结合和活性、细胞粘附至ECM和随后的细胞骨架组织到微生物对细胞的感染。它们是复合体分子，具有特异性的核心蛋白，其上连结有可变数量的糖胺聚糖(GAG)链。不仅链的数量可变：虽然多配体聚糖主要携带硫酸类肝素GAG，一些还具有额外的几丁质/皮肤素硫酸盐链。此外，硫酸类肝素链在长度、葡糖醛酸至艾杜糖醛酸的差向异构、链的整体硫酸盐化以及单糖磺化的位置方面可变。AnneWoods，J.Clin，Invest.2001；107(8)：935-941(通过引用并入本文)。
内皮细胞上最常见的多配体聚糖是Synd1，其负责结合和调控多种不同的分子。它们包括生长因子和细胞因子。多配体聚糖-1是被鉴定和克隆的该家族的第一个HSPG。其主要限于内皮细胞，但也在发育期间于压缩的间质(condensingmesenchyme)中被发现，以及在前-B淋巴细胞和浆细胞中被发现。与在粘着中的作用一致，多配体聚糖-1在上皮细胞中以基底外侧分布存在，其看起来能调节上皮细胞形态，因为用针对多配体聚糖-1的反义mRNA转染上皮细胞导致上皮-间质转换，并且活化细胞以侵入胶原凝胶。这些细胞中E-钙调蛋白的伴随损失指示了多配体聚糖-1和E-钙调蛋白的合作调控，并且事实上，降低E-钙调蛋白的表达也导致减少的多配体聚糖-1生产。
早前研究表明，多配体聚糖可能参与细胞与ECM的粘着。将多配体聚糖-1转染进正常情况下缺乏该多配体蛋白的Schwann细胞增加了伸展(spreading)以及促进了粘着斑(focaladhesions)和应力纤维(stressfibers)的形成。虽然多配体聚糖-1在伸展期间在膜上与微丝系统共同分布并且成为去垢剂不可溶的，但其并不定位于粘着斑处。事实上，仅一份报道指出多配体聚糖-1存在于粘着斑处。令人感兴趣地，通常被认为指示了与细胞骨架的联接的去垢剂不可溶性无需细胞质结构域的存在；非常近来的一项研究指出，多配体聚糖-1跨膜结构域与去垢剂不可溶的脂筏(作为内吞作用的特化类型的一部分)相关。AnneWoods，J.Clin，Invest.2001；107(8)：935-941(通过引用并入本文)。
多配体聚糖还协助形态发生、宿主防御和组织修复。认为多配体聚糖能帮助预防细菌和病毒移殖以及进入细胞，并且认为，当病原体释放出与多配体聚糖上的硫酸肝素片断结合的毒力因子时发生病原体的可能的毒力机制，并且因此加速多配体聚糖从细胞表面脱落。这因此允许细菌细胞和病毒移殖细胞表面并且自身进入细胞内部。该机制已针对被鉴定为在发病期间破坏Synd1的若干病原体(包括炭疽芽胞杆菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌)提出。这些病原体已显示能加速Synd1胞外结构域从上皮细胞脱落，由此破坏上皮屏障完整性。Popva，T.etal.，BMCMicrobiology，2006，6：8，7February2006，“Accelerationofepithelialcellsyndecan-1sheddingbyanthraxhemolyticvirulencefactor，”(通过引用并入本文)。所有三种病原体看起来均靶向synd1。ChenmY.etal.，Mol.Cells，26，415-426，Nov.30，2008，“MicrobialSubversionofHeparanSulfateProteoglycans，”(通过引用并入本文)。
在本发明中，使用了具有高表面积的、具有与表面结合的肝素的血过滤/吸附滤芯，其中使用体外循环令受感染的血经过表面。血中经排出的毒力因子将与和表面结合的肝素结合，并且因此可从血中被除去。通过从血中除去高浓度的毒力因子，对内皮细胞表面将发生较少的移殖和损害，并且允许传统抗微生物疗法进行更长的时间。此外，当血中的细菌与高表面积的肝素滤芯接触时，细菌将释放出毒力因子，它们将与和表面结合的肝素直接结合。
该治疗性工具因此可用于治疗严重的感染性疾病，例如，炭疽芽胞杆菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的感染。通过本发明对这三种病原体中任何所导致的感染的治疗可部分或完全从血中除去下述毒素：
a)针对炭疽芽孢杆菌
三种蛋白毒素(炭疽毒素)，包含：
保护性抗原(PA)
水肿因子(EF)
致死因子(LF)
聚谷氨酸荚膜
AnthralysinO(AnlO)
AnthralysinB(AnlB)
致死毒素(LT)
b)针对金黄色葡萄球菌
α-毒素
β-毒素
c)针对铜绿假单胞菌
LasA
对于体外血循环来说典型的流速需要吸附“床”被设计为允许相对高的流速，以能安全操作。
在本发明的一个方面，基底被设计为具有足够大的空隙尺寸，以允许高流速的血经过基底，而没有大的压力降低。这即是说，当从哺乳动物患者采血时，其以下述流速经过基底，所述流速下，被吸附物向吸附床表面的递送特征在于主要通过强迫对流(forcedconvection)来进行。这与高孔性介质(例如，多孔硅、交联葡聚糖、交联的聚苯乙烯尺寸排除介质、致密或微孔的中空纤维或平板膜等等)的慢得多的分子扩散过程的特征相反，所述高孔性介质例如用于尺寸排除色谱或其它形式的亲和疗法中。
本发明的该方面在典型用于临床体外血循环(例如，用于透析、心肺分流术和体外(膜)血氧合)的安全流速范围内提供了足够的吸附能力。这与很多有孔吸附介质所典型的被吸附物的慢得多的扩散性运送相反，其要求被吸附物经微孔膜扩散，和/或在结合至介质上或介质中的吸附位点之前进入吸附物介质的细微孔，并且由此需要非常慢的流速以在每一次血液经过期间实现显著的分离。
在对流运送期间肝素对病原体和毒素的结合在典型用于(安全)操作体外血循选的相对高的流速条件下特别有效，所述流速例如大约＞50mL/分钟，以及优选＞150mL/分钟，但是低于大约2000mL/分钟。相反，在微孔介质的孔内的吸附可能需要低得多的流速来通过特殊尺寸的吸附床，以实现足够的分离或纯化，即，＜50mL/分钟至低至＜1mL/分钟。
认识到，严格来说，较之将被吸附物通过强迫对流运输到结合位点(在基本上无孔的介质上)所需的较低的驻留时间而言，对于需要将被吸附物扩散性运送到介质内的吸附物位点和/或通过微孔膜的介质而言，吸附柱上的“驻留时间”要长得多。但是，对于安全有效的吸附物滤芯、柱、滤器等等的尺寸有若干实践上的限制，尤其是在考虑到其容纳的血液的最大滞留量以及经过吸附介质的血或血清的流速的方面。因此，经过吸附设备的平均流速被考虑为重要的设计变量。
可在从流动的血中除去细胞因子或病原体的方面比较对流动力学和扩散动力学：依赖于扩散运送的吸附介质通常使用非常多孔的材料，由于存在细微孔，其具有极其高的内表面积。另一方面，适于对流运送的介质通常依赖于固体的、基本上无孔的材料(例如颗粒、珠粒、纤维、网状泡沫或缠绕滤芯)之间的宏观“通道”或可见的空隙。
依赖于强迫对流运送的介质通常更适于高流速，而依赖于慢得多的扩散性运送的介质在使用高流速和更短的驻留时间时效果要差得多。因此，在体外血纯化设备中，不需要被吸附物缓慢扩散进吸附介质中的孔的吸附介质是非常优选的。当血被泵经用人造材料制造的循环时，实践中通常使用相对高的血流速度，以防止淤塞和降低凝血风险。另一方面，极其高的流速应当避免，因为它们可能使得血细胞暴露给高剪切速率和冲击损害，这会使得血细胞破裂。因此，本发明提供了使用对流运送的优选特征及其被期望的、更快速的动力学来从血中除去细胞因子或病原体的方法和设备。这可通过使得血经过/流经基本上无孔的基底来实现，所述基底已用吸附物分子(例如肝素)表面处理过，并且因此能结合期望的细胞因子或病原体以将它们从血中除去。
本发明的方法意欲主要用于体外疗法或过程，虽然可植入的设备也是可能的。“体外疗法”表示在体外进行的过程，例如其中可向体液中加入想要的产品(例如氧、血液抗凝剂、麻醉剂等等)的疗法。相反，也可采用特定类型的体外循环，从体液中除去不想要的产品，例如天然存在的毒素或毒物。例子是血液透析和血液过滤，它们代表了从血中去除废物产品的技术。在活性炭上的吸附已被用于除去血液携带的毒物等等。
来自哺乳动物的全血和血清可用于本发明。不意欲对可用于所要求保护的方法中的血或血清的量加以限制。其可从少于1mL至超过1L，可多至并且包括患者的所有血的体积(当采用持续再循环回患者时)。如果需要的话，可一次或多次“经过”吸附床。血可以是人或动物的血。
可按照本发明，对用于从血中除去病原体或毒素的表面肝素化的吸附介质加以优化，以用于传统的体外血循环，并且流速＞50mL/分钟，优选在大约150至2000mL/分钟之间。此类高流速在吸附柱中产生短驻留时间，对流运送超越布朗扩散运送占据优势。这对于结合高分子量的蛋白质或细胞因子(例如TNF-α)和较大的颗粒(例如病毒、细菌和寄生虫)来说特别重要，因为它们扩散得非常非常慢。在本发明中，可用于除去病原体和毒素的占据优势的吸附位点位于血液流经或通过强迫对流被递送经过的介质床空隙中的表面。为处理血，空隙通道需要足够大到允许运送血红细胞，其直径平均6微米。为允许将填料(packed)吸附滤芯放进高血流速的体外循环，空隙通道必须比血红细胞的直径大数倍。这些防止导致溶血的高剪切速率，并且同时使得流经填料床或滤芯的血中压力降低最小化。此外，介质优选是刚性的，以最小化可能通过压实导致的阻塞滤器滤芯的变形。基于这些优先性，优化的刚性介质平衡了空隙通道尺寸和总表面积，例如，以在高流速体外血循环中高效除去细胞因子。
2.用于本发明的基底
形状和组成多种多样的材料可在本发明中用作为基底。所有合适的基底提供了高表面积，同时促进被吸附物(主要)通过强迫对流被运输到结合它们的吸附物位点。介质典型地被提供为填充于容器(例如柱)中，所述容器被设计为容纳介质使得其不会在流动的血中被带走(也称为介质移动)并且允许血流基本上经过介质全部表面。可用于制造吸附介质的基底包括无孔刚性珠粒或颗粒、微颗粒、网状泡沫、刚性整体床(rigidmonolithicbed)(例如从熔结的珠粒或颗粒形成的)、装有织造的或非织造的织物的柱、装有纱或实心或中空(但非微孔的)单丝纤维的柱、从薄膜或致密膜形成的缠绕(spiralwound)滤芯或者介质的组合，例如混合的珠粒/织物滤芯。用于本发明的合适基底最初可以是微孔的，例如如果在表面修饰工艺期间被制为基本上无孔的话。
在本发明的某些实施方式中，所述固体基底的材料可以是玻璃、纤维素、乙酸纤维素、几丁质、脱乙酰壳多糖、交联葡聚糖、交联琼脂糖、聚丙烯、聚乙烯、聚砜、聚丙烯腈、硅酮、特氟龙或聚氨酯。
固体基底上肝素的表面浓度可以在1-10μg/cm2的范围内。
本发明的柱类型的吸附/过滤床具有大孔结构，其对血或血清呈现高表面积，同时又防止了大的压力降低和高剪切速率。除通过溶血损害血液的可能性之外，高的压力降低也应当避免，因为它们可能使得装备有应答于压力降低的自动切断开关的体外循环切断。
2.1作为基底的珠粒
一种有用的基底是固体珠粒或颗粒形式的。“珠粒”可由足够刚性以在面临的流速下抵抗变形/压实的材料制成。对变形的抗性是填料床“接触物(contactor)”保持游离体积和之后低的压力降低所必需的。在基底大部分中基本上缺少孔减少了被吸附物在吸附之前扩散进孔的需求。本发明的吸附位点主要在介质表面，并且由此定位于可被血中被吸附物接触到，所述血主要通过强迫对流运送被递送至该表面。合适的基底无需其表面完全平滑，因为粗糙产生令人期待的用于连结结合位点的表面积增加，例如通过肝素的共价或离子键合。另一方面，具有分子尺寸的内部孔应当被大力避免，以减少被吸附物在连结至结合位点之前扩散进孔中的需求。
多种珠粒可用于本发明。有用的珠粒应当具有足够的刚性，以避免在用于所述方法期间变形/压实，以及具有足够的表面积，以能被肝素涂布以用于本发明。
足够的基底刚性的证据是水或盐水以临床所使用典型的速度流动大约一小时期间吸附床的压力降低不存在显著增加：例如，当在相似流速的例如盐水下测量时，相对于最初的压力降低(在流动的第一分钟内测量的)＜10-50％的增加。
珠粒或其它高表面积基底可以由生物相容性材料制成，例如聚合物或非聚合材料(基本上不含可滤取的杂质)，包括玻璃、纤维素、乙酸纤维素、几丁质、脱乙酰壳多糖、交联葡聚糖、交联alanese、聚氨酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚乙烯或乙烯和其它单体的共聚物、聚乙烯亚胺、聚丙烯、聚砜、聚丙烯腈、硅酮和聚异丁烯。有用的基底的例子包括无孔的超高分子量聚乙烯(UHMWPE)。其它合适的珠粒是聚苯乙烯、高密度和低密度聚乙烯、硅石、聚氨酯和脱乙酰壳多糖。
用于制造此类珠粒的方法是本领域内本身已知的。聚乙烯珠粒和其它聚烯烃珠粒是在合成工艺期间直接生产的，并且可通常不经进一步改变即使用。
如上文所述，为用于本发明的方法，用于体外血过滤的各珠粒之间的空隙空间或通道的尺寸应当被优化，以防止在滤芯的进口和出口之间的高压力降低，以允许在高流速环境中的各珠粒之间的血细胞安全通过，以及以提供合适的空隙表面积，用于肝素与血中的细胞因子或病原体结合。在300微米珠粒的紧密填充的床中，合适的空隙孔尺寸为直径大约68微米。有用的珠粒具有直径100至500微米范围的尺寸。珠粒的平均尺寸可以是150至450微米。例如，来自DSMPTG，Berkeley，CA(以前的ThePolymerTechnologyGroup)的具有0.3mm的平均直径的聚乙烯珠粒是合适的。空隙孔是珠粒尺寸的函数。
就使用而言，合适的珠粒被放置于容器(例如柱)中。
2.2其它合适的基底形式
网状泡沫具有开放的腔室，其可从例如聚氨酯和聚乙烯来制造。对孔尺寸的控制可以通过控制生产方法来实现。通常，网状泡沫可具有3至100孔/英寸，并且展示出可高至66cm2/cm3的表面积。
可通过化学或物理手段将珠粒烧结为整体有孔结构(monolithporousstructure)。可通过在其熔点之上在滤芯中加热珠粒并施加压力来烧结聚乙烯珠粒。得到的空隙孔尺寸比珠粒填料床的空隙孔尺寸有略微降低。
可用织造的或非织造的肝素化织物来填充柱。通过控制织物的纤维尺寸，可控制空隙孔的尺寸。非织造的织物也作为毛毡已知，其具有由纤维的纠缠和粘着力保持在一起的随机定向。织造的织物具有界定的非随机结构。
可用纤维或从纤维制成的纱来填充柱。可将聚乙烯和其它纤维拉成薄中空或实心纤维，所述纤维可被填充成与传统血液透析滤芯相似的滤芯。此外，这些纤维可被织造成纱。Dyneema是UHMWPE制成的高强度织造纱。Dyneema纤维可被肝素化，并被填充进滤芯，并提供用于除去细胞因子和病原体的高表面积支持。
缠绕滤芯含有薄的膜，其与任选的间隔材料紧密缠绕到一起，以防止相邻表面的接触。膜可从聚合物(例如聚氨酯、聚乙烯、聚丙烯、聚砜、聚碳酸酯、PET、PBT等等)制成。
2.3肝素的连结
本发明的吸附介质可包含与固体基底的表面共价相连的肝素。多种本身已知的方法可用于将肝素与想要的基底连结，例如WendelandZiemer.(H.PWendelandG.Ziemer，EuropeanJournalofCardio-thoracicSurgery16(1999)342-350)的综述性文章中描述的。在一种实施方式中，肝素通过共价末端连结与固体基底相连。该方法通过降低或减少了肝素从基底表面的释放(可能进入血流)增加了设备的安全性。通过血液和进入血液的肝素的“滤取”应当避免，因为这可能增加失血和肝素诱导的血小板减少症的风险。
肝素与固体基底的共价连结较之非共价连结提供了对下述参数的更好的控制，所述参数例如被固定的分子的表面密度和定向。为提供最优的、细胞因子或病原体与被固定的碳水化合物分子的结合，这些参数已被发明人表明为是重要的。肝素在固体基底上的表面浓度可在1-10μg/cm2的范围内。共价末端连结表示肝素经由肝素分子的末端残基与固体基底共价连结。肝素还可在多个点结合。末端连结是优选的。
如果使用珠粒，则可在连结肝素或其它化合物之前对它们进行亲水化。制备珠粒的可能方法包括酸蚀、等离子体处理和暴露给强氧化剂(例如高锰酸钾)。
2.4肝素/克基底的量
每克基底的肝素的量可变化。如果使用珠粒，通过使用的层数以及珠粒的尺寸来确定每克珠粒的肝素量。珠粒越大，则每克珠粒获得的肝素越少。肝素在固体基底上的表面浓度可在1-10μg/cm2的范围内。一种优选的量是2.0±0.5mg肝素/g珠粒(根据MBTH方法)。
用于所要求保护的方法中的肝素的分子量可变化。例如，天然肝素具有22kDa的平均分子量。硝酸降解的肝素具有8kDa的分子量。
可用于本发明的基底还可通过公开的美国专利申请No.2009/0136586中描述的方法来制备，该申请通过引用整体并入本文。
3.用于本发明的方法中的设备
本发明的另一方面是提供了包含经肝素修饰的固体基底的设备的用途，所述肝素具有针对细胞因子或病原体的结合亲和性，所述设备用于体外从哺乳动物血中除去细胞因子或病原体。
在根据本发明的用途和方法中提到的设备可包含用于对来自患者(例如罹患肾衰竭的)的血和血清进行体外处理的传统设备。
已知：接触用于体外循环的医药设备的血的局部血流模式会通过剪切活化和血小板在停滞区的聚集而影响凝块形成。因此，用于本发明中多个方面的设备应当被设计为不产生这些问题的模式。
用于本发明的一些实施方式中的设备可例如具有下述性质：
血流量在150-2000ml/分钟的范围内。
低流动抗性。
具有固定于其上的碳水化合物的基底的大的表面积，例如大约1-40m2。
稳定的涂层(碳水化合物不会漏进与之相接触的血中)。
设备中合适的血液动力学性质(没有停滞区)
最优生物相容性。
可用于根据本发明的用途或方法中的此类设备的非限制性例子是儿科血流透析仪，例如来自ExtheraMedical的、用于除去细胞因子分子的、与高流速相容的体外血液过滤设备。用于体外处理血或血清的设备的其它型号或类型也可使用，例如PrismaM10血过滤仪/透析仪(来自GambroAB，瑞典)。
高流速条件可被定义为高于扩散极限的血流量。
4.病原体
本发明提供了通过从哺乳动物血中除去病原体和/或毒素来治疗疾病的方法，这通过将哺乳动物的血与上述方法中公开的固体基底接触来实现。可使用根据本发明的肝素化基底从血中除去的病原体的例子包括：细菌——炭疽芽孢杆菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌。
如上文所述，待根据本发明治疗的疾病的一个例子是炭疽。在大多数情况下，早期治疗可治愈炭疽。炭疽的皮(皮肤)形式可用常见抗生素(例如青霉素、四环素、红霉素和西氟沙星(Cipro))来治疗。炭疽的肺形式是医疗紧急情况。早期和持续的静脉内抗生素疗法可保全生命。在生物恐怖攻击中，暴露给炭疽的个体将在他们发病前被给予抗生素。存在疫苗，但是尚非一般公众可获得的。炭疽导致的疾病有三种形式：皮(皮肤)型炭疽、吸入型炭疽和胃肠(肠)型炭疽。吸入型炭疽是非常严重的疾病，不幸的是，大多数受影响的个体将死亡，即使它们获得了合适的抗生素。抗生素能有效杀死细菌，但是它们不能破坏已经被炭疽细菌释放出的致命毒素。
本发明的方法可在其它传统治疗(例如施用抗生素)之前或之后使用。
5.将本发明与额外的过滤/分离步骤组合
在根据本发明的治疗方法的一种实施方式中，可以连续循环进行血的提取和再引入，所述循环包括受试者血流的部分。
在另一方面，本文描述的方法可与用于过滤或处理哺乳动物血的其它方法组合。例如，基于对流动力学的滤芯然后可与传统体外循环(例如CPB、血液透析和氧合)依序使用。
6.实施例
下述实施例中进一步描述了本发明的多个方面。这些实施例并非意欲加以限制。
6.1实施例1---制备肝素柱
具有0.3mm的平均直径的聚乙烯(PE)珠粒(批号180153)由PolymerTechnologyGroup(Berkely，美国)供应，柱(Mobicol，1mL)从MoBiTec(德国)获得。肝素和聚乙烯亚胺(PEI)分别购自ScientificProteinLaboratories(Waunakee，Wisconsin，美国)和BASF(Ludwigshafen，德国)。使用的所有化学品都是分析级或更好的。
将肝素固定到珠粒上通过Larm等人(LarmO，LarssonR，OlssonP.Anewnon-thrombogenicsurfacepreparedbyselectivecovalentbindingofheparinviaamodifiedreducingterminalresidue.BiomaterMedDevicesArtifOrgans1983；11：161-173)所述来进行。
使用下文描述的一般方法来肝素化聚合物表面。
用氧化剂(高锰酸钾、过硫酸铵(ammoniumperoxidisulfate))蚀刻聚合物表面，以引入亲水特征和一些反应活性官能团(-SO3H、-OH、-C＝O、-C＝C-)。还可用等离子体或电晕来蚀刻表面。例如，用氧化剂(硫酸中的高锰酸钾)来蚀刻PE-珠粒。这些还含有OH基团和双键的亲水化的珠粒后来被用作为对照。
通过用聚胺、聚乙烯亚胺(PEI)或脱乙酰壳多糖处理，引入反应活性氨基官能团。就一些目的而言，可通过与双功能试剂(例如巴豆醛或戊二醛)交联，在表面上稳定聚胺。
通过与硫酸化的多糖(硫酸葡聚糖或肝素)离子性交联来进一步稳定涂层。如果需要的话，重复这些步骤，建立夹层结构。应当在每个步骤之间进行仔细的漂洗(水、合适的缓冲液)。最后一次添加PEI或脱乙酰壳多糖后，通过还原性氨化作用将天然肝素末端连结(EPA)到氨化的表面，这里用天然肝素中还原性末端残基的醛官能团来实现。
还原性末端残基中更具反应活性的醛官能团可通过对肝素的部分、亚硝化降解来实现。这缩短了反应时间，但是被固定的肝素将具有更低的分子量。通过还原性氨化作用(氰基硼氢化物，CNBH3 -)，在水性溶液中进行偶联。
在该备选方法中，氨化介质被悬浮于乙酸盐缓冲液(800ml，0.1M，pH4.0)中，并加入4.0g亚硝酸降解的肝素(来自Pharmacia，瑞典的肝素)。振荡0.5小时后，加入NaBH3CN(0.4g)。对反应混合物振荡24小时，然后按照上文进行处理，产生肝素化介质。
可将1-10μg/cm2肝素与所有亲水性表面(例如玻璃、纤维素、几丁质等等)以及或多或少的所有疏水性聚合物(例如聚氯乙烯、聚乙烯、聚碳酸酯、聚苯乙烯、PTEE等等)偶联。
用氧化乙烯(ETO)对得到的PE-珠粒(具有共价末端连结的肝素)灭菌，并用0.9％氯化钠和超纯水漂洗。使用MBTH方法，肝素的量被确定为2.0mg肝素/g珠粒(LarmO，LarssonR，OlssonP.Anewnon-thrombogenicsurfacepreparedbyselectivecovalentbindingofheparinviaamodifiedreducingterminalresidue.BiomaterMedDevicesArtifOrgans1983；11：161-173和RiesenfeldJ，RodenL.QuantitativeanalysisofN-sulfated，N-acetylated，andunsubstitutedglucosamineaminogroupsinheparinandrelatedpolysaccharides.AnalBiochem1990；188：383-389)。
聚乙烯珠粒具有0.3mm的平均直径，并用保证肝素分子与表面共价末端连结的技术对其进行肝素化，由此使得碳水化合物链更易被对肝素/硫酸肝素具有亲和性的蛋白质接触到。被固定的肝素的平均分子量为大约8kDa，并且与每克珠粒偶联2mg(等于大约360IU)。通过血液经过肝素化的珠粒预期除去抗凝血酶(AT)浓度的75％(在非肝素化的珠粒上则不除去)，来验证该表面的完整性。
6.2实施例2---除去毒素
从患者的血透析仪取得动脉血。在EDTA真空管中收集血，并立即向之前制备的柱中应用1mL，使用滚轮泵使其以例如1、5和10mL/分钟之一经过柱。已经经过柱的血被立即收集于另一端，并对其进行冷离心(4500G)。随后收集上清液，并冷冻于-80℃用于之后的分析。
简言之，较之非肝素化珠粒，经过肝素化珠粒导致血毒素显著更大的减少。
6.3实施例3---体外除去炭疽芽孢杆菌PA
细菌上清液：于37℃、250RPM振荡下将炭疽芽孢杆菌7702或9131的过夜培养物培养于Luria培养基(LB)。用1mL过夜的7702培养物接种具有0.8％碳酸氢钠(NaHCO3)的pH8的20mLLB(用1MHEPES调节pH)，于37℃、250RPM振荡下培养直至后期指数阶段(大约7小时)。在3500RPM对培养物进行5分钟离心，以除去细菌细胞和残骸。收集上清液，使其经过0.2μm过滤器，并立即使用或贮藏于-20℃。
珠粒的制备：将1g含肝素的珠粒或对照珠粒加入注射器中，所述注射器具有放在珠粒顶部和底部的过滤器。在实验之前，通过添加2mL经Tris缓冲过的盐水(TBS)来预处理(prepped)珠粒。使用胎牛血清(FBS)的时候，通过添加2mLTBS接着2mLFBS(经过珠粒5次)来预处理珠粒。当TBS或FBS液滴不再从注射器中释放出的时候，使细菌上清液经过。
上清液经过：将2mL细菌上清液应用到珠粒上。经过之后，收集上清液，并将其再经过4次。当上清液滴不再从注射器释放出时，收集上清液置于-20℃。
ELISA：将100μL上清液加入到Immulon4HBX高结合微滴定板的每个孔中，并在室温下于摇床上孵育2小时。移除上清液，用含有0.05％Tween的TBS(TBST)洗三次孔。在室温下，于摇床上，用2％牛血清白蛋白对孔加以封闭。再次洗孔。用山羊抗PA(ListBiologicalLaboratories)(TBS中1∶2000稀释)在室温下于摇床上对孔进行1小时的孵育。如所述的那样，洗孔。在室温下于摇床上用兔抗山羊HRP(Invitrogen)(TBS中1∶2000稀释)对孔进行1小时的孵育。如所述的那样，洗孔。在室温下通过添加dH2O中的SigmaFast-OPD(Sigma)，来使孔显影大约30分钟。在450nm处读取吸光度。
Western杂交印迹：按照所述的那样获得细菌上清液，向在甲醇以及接着TBS中预处理3分钟的PVDF膜(BioTrace)中加入2.5μL或5μL的体积。5分钟后，室温下，用TBST中的2％脱脂奶粉对膜进行30分钟的封闭。用TBST洗三次膜，并在室温下与山羊抗PA的1∶3000稀释液一起孵育45分钟。洗三次膜后，并在室温下与1∶3000的兔抗山羊-碱性磷酸酶一起孵育45分钟。以一步NBT/NCIP(Piercenet)来显影膜。
结果
使用Western/点杂交印迹检验，首先验证了在我们的培养条件下产生了毒素。在37℃、有或没有5％CO2的气氛条件下，7702培养物的过夜和8小时培养物二者中均检测到保护性抗原(PA)。FBS被用作为背景抗体检测的对照。
使7702和9131上清液经过对照和肝素化珠粒。使用对照和肝素化珠粒，我们发现了大约75％的降低(图1，B)。迄今，对重复的汇总指示，在应用至肝素化珠粒之后，没有预浸时有43.3％的降低，有预浸时有75％的降低。75％的降低使得对PA的测量接近9131的背景水平，这表明可能有100％的降低。上清液经过珠粒一次后获得了PA的降低。多次经过对PA的降低没有影响。
6.4实施例4---通过肝素化珠粒展示细胞保护
在该研究中，按照实施例3所概括的来进行PA上清液和珠粒制备。上清液7702和9131是浓缩至10x溶液的7702和9131上清液。然后在DMEM细胞培养基(-苯酚红)中将上清液稀释至想要的浓度。培养巨噬细胞，计数，并将其重悬为1x10^6个细胞/ml。向每个孔中的500μlDMEM+FBS中加入1x10^5个细胞，并在37C和5％CO2下孵育过夜。向每个孔中加入0.05g珠粒。然后将DMEM+/-FBS或FBS以100μl的增加(总共300μl)经过双层板孔(transwell)。然后从培养孔中移除培养基，用DMEM对珠粒洗一次。然后向每个双层板孔加入500μl经稀释的上清液。然后在37C/5％CO2对这些孔培养20小时。从每个双层板孔取样50ml，测量LDH水平(细胞毒素毒性)。图2显示了结果。无关上清液稀释，均测量到巨噬细胞死亡的显著降低。对于用FBS和DMEM处理过的珠粒而言，细胞死亡被降低至背景水平。
6.5实施例5---除去菌株USA300甲氧西林(methicilin)抗性金黄色葡萄球菌α-毒素。
使用菌株USA300，按照实施例3所概括的流程，制备具有USA300MRSAα-毒素的上清液。也按照实施例3所概括的流程制备肝素化珠粒。图3显示了结果。无关上清液稀释，通过ELISA型检验均测量到α-毒素浓度的显著降低。

Claims (20)

1.固定于固体基底上的肝素在制备设备中的用途，所述设备用于体外从哺乳动物血中除去来自病原体的毒素，其中所述病原体是选自炭疽芽胞杆菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌构成的组的成员，其中来自炭疽芽孢杆菌的毒素选自炭疽致死毒素、炭疽保护性抗原、炭疽水肿因子、炭疽致死因子、炭疽聚谷氨酸荚膜、anthralysinO、anthralysinB；其中来自铜绿假单胞菌的毒素是LasA；并且来自金黄色葡萄球菌的毒素选自金黄色葡萄球菌α-毒素、金黄色葡萄球菌β-毒素，
其中实施所述设备包括：
a.将血样品与固定于固体基底上的碳水化合物体外接触，其中所述碳水化合物是肝素并且所述碳水化合物具有针对所述毒素的结合亲和性，所述接触在允许所述基底与所述血样品中的所述毒素结合的条件下进行；
b.从所述基底分离所述样品，其中所述毒素至少部分驻留于所述基底上，并且移出的样品具有降低的量的所述毒素。
2.根据权利要求1的用途，其中所述病原体是炭疽芽孢杆菌。
3.根据权利要求1的用途，其中所述基底具有与下述毒素的亲和性，所述毒素能结合多配体聚糖上的硫酸肝素片断。
4.根据权利要求1的用途，其中所述基底具有针对炭疽毒素中的保护性抗原的亲和性。
5.根据权利要求1-4中任意一项的用途，其中所述固体基底包含选自玻璃、纤维素、乙酸纤维素、几丁质、脱乙酰壳多糖、交联葡聚糖、交联琼脂糖、聚氨酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚乙烯、聚乙烯亚胺、聚丙烯、聚砜、聚丙烯腈、硅酮和聚异丁烯构成的组的至少一种成员。
6.固定于固体基底上的肝素在制备设备中的用途，所述设备用于体外从血中除去至少一种病原体或来自所述病原体的毒素，其中所述病原体是选自炭疽芽胞杆菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌构成的组的成员，其中来自炭疽芽孢杆菌的毒素选自炭疽致死毒素、炭疽保护性抗原、炭疽水肿因子、炭疽致死因子、炭疽聚谷氨酸荚膜、anthralysinO、anthralysinB；其中来自铜绿假单胞菌的毒素是LasA；并且来自金黄色葡萄球菌的毒素选自金黄色葡萄球菌α-毒素、金黄色葡萄球菌β-毒素，
其中实施所述设备包括：
使血样品或血清样品以≥50ml/分钟的流速体外在高表面积的固体基底上流动并经过，其中所述固体基底的表面包含具有针对病原体或毒素的结合亲和性的肝素，并且其中，所述基底的各部分之间的空隙通道空间的尺寸和空隙基底表面积的量使得：当所述流动的血或血清以≥50ml/分钟的流速接触所述固体基底时，所述病原体或毒素与所述肝素结合，并从所述血或血清分离，并且，所述血或血清和其中含有的吸附物经过所述基底的运送是通过超过布朗扩散运送的对流运送进行的。
7.根据权利要求6的用途，其中所述基底包含无孔刚性珠粒或颗粒的填料柱，填充有刚性网状泡沫的柱，填充有具内流动通道的烧结珠粒的刚性整体床的柱，填充有织造的或非织造的刚性织物的柱，填充有刚性纱或任选地中空单丝纤维的柱，缠绕滤芯或选自珠粒、刚性网状泡沫、烧结珠粒、织物、纱和单丝纤维构成的组的至少两个成员的组合。
8.根据权利要求6的用途，其中所述固体基底包含涂布有一种或多种多糖的聚乙烯珠粒。
9.根据权利要求8的用途，其中所述多糖中至少一种选自肝素、玻尿酸、水杨酸和脱乙酰壳多糖构成的组。
10.固定于固体基底上的肝素在制备设备中的用途，所述设备用于体外从血中除去至少一种来自病原体的毒素，其中所述病原体是选自炭疽芽胞杆菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌构成的组的成员，其中来自炭疽芽孢杆菌的毒素选自炭疽致死毒素、炭疽保护性抗原、炭疽水肿因子、炭疽致死因子、炭疽聚谷氨酸荚膜、anthralysinO、anthralysinB；其中来自铜绿假单胞菌的毒素是LasA；并且来自金黄色葡萄球菌的毒素选自金黄色葡萄球菌α-毒素、金黄色葡萄球菌β-毒素，
其中实施所述设备包括：
使血样品以≥50ml/分钟的流速体外流动接触容器中的刚性聚乙烯珠粒，其中所述珠粒的表面包含具有针对毒素的结合亲和性的肝素，其中所述珠粒足够刚性，使得血不经过所述珠粒中的孔，并且其中，所述珠粒中各个之间的空隙通道空间的尺寸和所述珠粒的空隙表面积的量使得：当血样品以≥50ml/分钟的流速流动接触所述基底时，所述毒素与所述肝素结合，以从所述血分离，并且所述血经过所述基底的流动运送是通过超过布朗扩散运送方法的对流运送进行的。
11.权利要求6-9中任一项的用途，其中血或血清的所述流速在大约150至2000mL/分钟的范围内。
12.权利要求10的用途，其中血的所述流速在大约150至2000mL/分钟的范围内。
13.权利要求7、8和10中任一项的用途，其中所述珠粒包含聚乙烯的聚合物。
14.权利要求7、8和10中任一项的用途，其中所述珠粒具有范围从100至450微米的直径。
15.权利要求14的用途，其中所述珠粒具有0.3mm的平均直径。
16.权利要求7、8和10中任一项的用途，其中所述珠粒被涂布有：相对每克珠粒而言0.5-10mg肝素。
17.权利要求16的用途，其中所述珠粒被涂布有：相对每克珠粒而言2±0.5mg肝素。
18.权利要求1-4和6-10中任一项的用途，其中所述肝素具有大约8kDa的平均分子量。
19.权利要求1-4和6-10中任意一项的用途，其中所述肝素通过共价末端连结与珠粒连结。
20.根据权利要求1--4和6-10中任意一项的用途，其中实施用于除去细胞因子或病原体的所述设备与对所述血的至少一种其它体外处理组合进行，其中所述至少一种其它体外处理包含选自心肺分流术(CPB)、血液透析和氧合构成的组的至少一种成员。
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