CN102762741B - 包含纳米管的流体流动装置及其用于细胞迁移的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于细胞迁移的装置及方法。特别地，本发明涉及流动表面上固定有纳米管的流体流动装置。纳米管的外表面具有支持细胞滚动的分子。同时提供从混有不同细胞类型的混合物或从流体中分离一种细胞类型的方法，所述方法基于各种细胞类型在流动表面上滚动性质的差异。

Description

包含纳米管的流体流动装置及其用于细胞迁移的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2009年10月8日申请的美国临时专利申请号61/249,871的优先权，其公开内容通过引用的方式并入本发明。
技术领域
本发明涉及细胞分离的装置及方法。特别地，本发明涉及从混有不同细胞类型的混合物中或从流体中分离选定的细胞类型，所述分离基于细胞在涂覆有支持细胞滚动的细胞粘附分子的基底上的滚动能力。
背景技术
纯化细胞群在生物医学研究及临床治疗领域具有多种应用。通常，可根据细胞间不同的尺寸、密度或电荷对其进行分离。然而，对于具有相似物理性质的细胞，经常通过利用细胞表面上存在的分子的差异对其进行分离。细胞亲和层析法就是基于该途径，主要利用针对细胞表面特定抗原的固定的抗体。该亲和层析分离法需要若干不同的步骤，包括将细胞与抗体共同孵育、细胞洗脱、细胞收集及结合抗体的释放，每个步骤都会降低细胞的总收率并增加工艺成本。
还需要从富含所需生物学靶点的供体中获得细胞样品。因为异质样品可能仅包含极少量的所需生物实体，经常无法通过分离方法来提供研究、诊断或治疗用途所需的具有足够纯度及数量的有活力及效力的生物学靶点。由于分离及纯化后的收率较低，必须将一些细胞类型，如干细胞、祖细胞以及免疫细胞(特别是T-细胞)置于长期培养系统中，所述长期培养系统中的条件确保维持细胞活力及临床效力，并且在所述条件下细胞可增殖(细胞扩增)。这些条件不一定都是现有存在的。为获得足够量的生物学靶点，必须从供体中一次性获取大量的样本，如外周血；或从一个供体中多次提取样本，然后进行一次或多次冗长、昂贵及通常收率较低的分离步骤以实现生物学靶点的有效分离。综上所述，这些问题给供体、分离方法、技术人员、临床医师及病人产生了显著的负担，这些负担显著增加了分离所需细胞的所需要的时间及费用。因此，以连续、流动方式分离/隔离细胞的方法及装置的需求始终存在。
发明概述
本发明提供一种用于细胞迁移的装置及方法，所述装置及方法使细胞在拓扑结构已被纳米管改变的流动表面上进行流动，所述纳米管的外表面附着有支持细胞滚动的细胞粘附分子。利用不同细胞类型在该表面上滚动速度的差异可分离不同的细胞群。
本发明装置具有用于细胞滚动的表面。该表面可以是流体流动腔的一部分。在表面上布置有纳米管，以使纳米管固定在所述表面上。该纳米管又涂覆有支持细胞滚动的细胞粘附分子。在一个实施例中，在已固定有纳米管的表面上具有包含正电荷分子组合物(如聚赖氨酸)的涂层。
本发明同时提供一种制备装置的方法，所述装置具有改变的拓扑结构以支持细胞的差异性滚动，从而实现所述细胞的分离、隔离和/或纯化。该方法包括获得具有流动表面的流体流动腔。在其外表面已附着有纳米管，然后在流动表面上直接布置细胞粘附分子，或用包含正电荷分子(如聚赖氨酸)的组合物进行涂覆后，再布置细胞粘附分子。在一个实施例中，可将纳米管布置在流动表面上，然后用细胞粘附分子涂覆纳米管。
本发明的装置也用于富集、分离、隔离和/或纯化细胞。该方法包括让包含细胞或细胞混合物的流体组合物沿所述表面流动。由于特定细胞与涂覆的表面间发生粘附，导致不同细胞类型以不同速度滚动，因此可从其他细胞中分离、富集或纯化出特定细胞。
附图简述
图1.在生理学剪切力范围内，KG1a细胞在涂覆有多水高岭土纳米管的表面上的平均滚动速度降低。P-选择素以2.5μg/mL的浓度孵育(A)。在较低(B)或较高(C)剪切力下，KG1a细胞的平均滚动速度作为P-选择素孵育浓度的函数。误差以SEM表示(N＝3)，***P＜0.001，**P＜0.01，*P＜0.05。
图2.在对照表面(A)及涂覆有纳米管的表面(B)上，细胞滚动的代表性显微照片中可观察到被捕获的细胞数目显著增加。单位面积表面中被捕获的KG1a细胞数目作为在较低(C)或较高(D)剪切力下选择素孵育浓度的函数。误差以SEM表示(N＝3)，***P＜0.001。
图3.微型管内表面上的多水高岭土纳米管涂覆层增强Colo205上皮癌细胞的捕获，通过滚动速度(A)及单位面积导管表面所捕获的细胞数目(B)进行定量。误差以SEM表示(N＝3)，***P＜0.001。
图4.与分散于培养基中的纳米管孵育72h后，KG1a(A)或Colo205(B)细胞的存活未受影响。“经处理”条代表在10％多水高岭土纳米管与90％培养基中培养的细胞的平均存活性，而“未处理”条代表在10％蒸馏水与90％培养基中培养的细胞的平均存活性。误差以SEM表示(N＝3)。
图5.假设(hypothesized)的纳米级表面拓扑结构图示，其中单个纳米管竖立在表面外，并在细胞沉积于表面时促进早期的细胞捕获(A)。在破碎处理并除去大的聚集物处理之后(B)及之前(C)，固定在表面上的多水高岭土纳米管的代表性原子力显微镜图像。需要通过该处理步骤，产生重现性更高的细胞粘附行为。
图6.在P-选择素孵育溶液一定浓度范围内，比较涂覆有纳米管的表面及对照表面的免疫荧光(A)。涂覆有多水高岭土的导管(B)及对照导管(C)都与10μg/mL的P-选择素进行孵育，获得代表性的显微图像。误差以SEM表示，***P＜0.001。
图7.在50cm涂覆有纳米管的导管及对照导管中保持恒定的压差值，并计算通过每种类型导管的所得流速。通过改变流体容器相对于导管出口的高度，获得不同的压差，并将结果与不具有可调参数的理论值进行比较(A)。将荧光微球灌注通过导管，并测定接近导管表面的微球速度作为流速的函数。从AFM数据中，确定最大表面粗糙度高度，发现纳米管涂覆层上的平均最大值是505nm，而空白对照表面上的平均最大值是30nm。通过方程式1，计算表面-表面分离距离(δ)为505nm及30nm时的微球理论速度，发现其与不具有可调参数的实验观察值相匹配(B)。AFM图像中代表性的表面特征。为便于观察，将纳米管涂覆层的曲线上移100nm(C)。误差以SEM表示，***P＜0.001。
图8.采用与其他滚动实验相同的方式制备导管，然后与用于封闭的抗P-选择素抗体进行孵育。在对照导管或纳米管涂覆导管中均只出现极少量的细胞粘附。
图9.在另一组实验中，制备用于滚动实验的涂覆有纳米管的导管及对照导管，允许细胞发生粘附及滚动。随后引入EDTA，以螯合溶液中的所有二价离子，从而使P-选择素失活。在轻柔洗涤导管以除去所有未结合细胞后，在导管中未观察到保持粘附的细胞。
图10.当P-选择素浓度低于2.5μg/mL时观察到细胞捕获急剧下降。
优选实施例的详细描述
本发明提供用于细胞迁移的装置及方法，基于细胞滚动速度的差异，从而分离细胞群。本发明源自这样的发现，使细胞流动通过流体腔可增强基于细胞滚动的细胞迁移，所述流体腔表面的拓扑结构已被固定的纳米管所改变，其中纳米管采用支持细胞滚动的细胞粘附分子进行功能化。纳米管的存在可显著改变细胞的平均滚动速度，从而使流过腔体的流体中的多种细胞得到分离。至少部分增强效应被认为归因于那些伸出表面并伸进流动流体中的纳米管。本发明中，通过使用原子力显微镜检查及免疫荧光定量技术获得的数据支持该模型。因此，虽然所述纳米管几乎不影响宏观流体动力学，但却改变了对流颗粒或细胞的平衡流线。基于这些发现，本发明提供用于细胞迁移的装置及方法。
本发明装置包含流体流动腔(本发明中也被称为微型管)，其中所述流动腔的内表面上固定有纳米管。纳米管的外表面上载有支持细胞滚动的细胞粘附分子。细胞迁移时，使包含细胞的流体流动通过流动腔。与细胞表面未表达细胞滚动分子的细胞相比，在其细胞表面表达与细胞粘附分子互补的配体的细胞以不同的速度沿腔壁滚动，从而可被分离。
细胞滚动或细胞的滚动在本申请中是指，当受体介导的粘附作用导致细胞移动速度降至低于自由流体动力学速度的50％时，细胞在表面移动至少一个细胞直径(即，速度不为零)。例如，使白细胞在血管内皮上进行滚动的粘附即称为细胞滚动。所述粘附涉及P-选择素和E-选择素(在血管内皮细胞上)与选择素结合性糖配体(在循环的造血干细胞和白细胞上表达)之间的弱亲和作用。认为通过这样的弱的相互作用使得细胞“被捕获”，并且在“被捕获”后，细胞在表面缓慢滚动，与之相反，未被捕获的细胞在总流体中快速流动。因此，细胞滚动涉及选定的细胞以短暂的方式发生粘附，从而当暴露于流动场中的切变速率时，细胞与粘附分子之间并未紧密结合，而是沿着涂覆表面发生滚动，所述切变速率优选50-1000s-1(0.5至10dynes/cm2及中间的所有整数，以及整数间十分之一距离的所有数值)的范围及其中的所有整数。支持细胞滚动的细胞粘附分子实例包括选择素、钙粘素、整合素以及GP-1，或这些分子的片段，或整合了这些支持细胞滚动分子的融合分子的嵌合体。
在一个实施例中，细胞滚动分子是选择素。选择素是造血干细胞(HSC)及白细胞可短暂性粘着的蛋白。例如，CD34+干细胞是未成熟的干细胞并具有最高的干细胞活性，与更定型或分化的CD34-干细胞相比，其显示出更有效的(或更缓慢的)滚动。红细胞及血小板不在选择素上发生滚动，而白细胞及一些肿瘤细胞呈现滚动。选择素的实例有，P-选择素、L-选择素和E-选择素以及重组选择素分子，如P-选择素-IgG嵌合体及E-选择素-IgG嵌合体。
整合素及钙粘素是细胞粘附分子家族的成员。整合素介导免疫应答中重要的粘附活动。已知这些分子涉及细胞滚动。例如，α4整合素被认为介导白细胞滚动。钙粘素包括E-钙粘蛋白、P-钙粘蛋白以及N-钙粘蛋白。
GP1b是一种肽，涉及血小板沿血管壁的滚动。流动的血小板与血管壁之间的最初粘附相互作用被认为由血小板GP1b短暂性地结合于固定的血管假性血友病因子的A1结构域所介导，并且认为需达到～1dyn/cm2剪切力的阈水平以实现短暂的粘附，这类似于中性白细胞粘附于L-选择素及P-选择素的动力学特征。一般而言，GP1b:vWF(血管假性血友病因子)的结合时间随着施加的作用力而急剧降低。
可通过在表面上直接进行物理吸收(吸收)，将细胞粘附分子附着或涂覆在纳米管的外表面上。另一个附着细胞粘附分子的方法是，首先将亲合素蛋白(包含例如″Neutravidin″或″Superavidin″的变体)吸收或附着在表面上，随后将该涂覆有亲合素的表面与包含生物素基团的细胞粘附分子发生反应。可使用静电荷或疏水作用在表面上附着细胞粘附分子。其他将分子附着到表面上的方法对本领域技术人员而言也是显而易见的，并且取决于表面及所涉及的细胞粘附分子的类型。
细胞粘附分子可直接附着于纳米管的外表面。然后可将纳米管固定在表面上。“固定”是指在由流体流经所产生的剪切力作用下，例如生理剪切力(通常介于0.5至10dynes/cm2)，纳米颗粒仍然保持附着在内表面上。
纳米管可由任何材料制成，所述材料通常为惰性的、在流体流动过程中可保持固定在表面上，并可提供适宜于粘附分子附着的表面。在一个实施例中，纳米管具有500nm至1.5μm的平均长度、通常为中空且具有40至200nm的平均直径。适宜的纳米管材料包括多水高岭土、二氧化硅及氧化钛。多水高岭土纳米管是自然形成的，因此容易获得。例如，自然形成的纳米管可从如NaturalNano公司(Rochester，NY)购得。源自多水高岭土或其他材料的纳米管也可通过合成获得。
自然形成的纳米管通常具有500nm至1.2μm的长度。在一个实施例中，用于涂覆的至少50％的导管长为500nm至1.2μm。在其他实施例中，至少50、60、70、80、90％或100％(以及50至100之间的所有百分数)的导管长为500nm至1.2μm。纳米管通常具有40至200nm的直径。在不同的实施例中，50、60、70、80、90％或100％(以及50至100之间的所有百分数)的导管具有40至200nm的直径。纳米管通常是中空的。
对于制备流体流动腔而言，优选采用包含荷电分子的组合物先涂覆流动表面。例如，可使用包含正电荷分子的组合物，如聚赖氨酸或钛酸丁酯。随后将纳米管置于流动表面。为避免纳米管成团分布，可对包含纳米管的组合物进行过滤或采用其他适宜的方法除去团块。例如，可对包含多水高岭土导管的溶液进行超声处理(如1min)后进行过滤(如使用0.45μm滤器)。如果允许纳米管形成多层涂覆，则细胞行为及捕获将会变得不可预测。因此，优选为单层纳米管，且一些纳米管可插入内腔。当在涂覆前稀释纳米管的浓度时，会观察到细胞捕获减少，表明形成了单层结构。在纳米管的外表面附着所需的细胞粘附分子(如选择素)。可在除去团块之前或之后附着选择素，但是在优选的实施例中，在除去团块后进行选择素的附着。
纳米管可覆盖或可不覆盖整个流动表面。一些纳米管可伸出流动表面。在一个实施例中，纳米管在流动表面上伸出至多一个纳米管的长度。在另一个实施例中，纳米管伸出至少50nm。因此，纳米管可以向流体腔的腔内伸进50nm至1.2μm。在不同的实施例中，纳米管在流动表面上向腔内最多伸进50nm至低于1.1μm、1.0μm、900nm、800nm、700nm、600nm及所述范围间的所有整数。在一个实施例中，纳米管伸出40nm至1.2μm，以及在此之间的所有整数和范围。
在一个实施例中，本发明利用细胞的滚动性质，将细胞与其他细胞类型或从流体组分中分离。因此，呈现滚动行为的细胞类型可与那些不呈现滚动行为，而是随着流体进行流动的细胞类型得到分离。此外，也可基于滚动速度的差异对不同细胞类型进行分离，该差异可能是细胞上的细胞粘附分子配体的数目或类型不同所导致。
在一个实施例中，本发明利用造血干细胞(HSC)的天然滚动性质将其与其他血细胞进行分离。在该实施例中，血细胞沿着表面滚动，该表明涂覆有选择素修饰的纳米管。选择素与HSC间的粘附减缓了HSC沿表面滚动的速度，而其他细胞以其正常的速度进行滚动或流动。滚动速度的差异可将HSC从其他细胞中分离及富集。
HSC的分离可用于治疗多种癌症、血液及免疫缺陷疾病。癌症及免疫疾病的治疗通常需要激进的放射治疗及化学治疗，这些疗法会杀死造血所需的健康骨髓。通过骨髓及外周HSC移植，医生能够将病态的或受损的骨髓替换为能产生正常血细胞的健康骨髓。本发明装置可实现从外周供血中分离HSC，用于随后重新给回人体。
本发明也可用于捕获循环的肿瘤细胞(CTCs)，即从原发性肿瘤中脱离并在血液中进行循环的细胞。一些CTCs有可能最终会在不同位点及不同组织中形成额外的肿瘤。此外，这些细胞也可在切除肿瘤时被释放，且一些CTCs在外科手术过程中被释放。因此，本发明的装置及方法可用于捕获CTCs。此外，本发明也可用于净化血液、用作检测CTCs是否存在的诊断工具、或者甚至捕获这些CTCs并重新改造/重新引入宿主以用作/对抗肿瘤。
在本发明的一个实施例中，本发明的装置可用作植入性装置，用于在体内分离、富集和/或纯化体液中的细胞。植入性装置是指，可用在本发明描述的方法中，用于改变体内目标细胞浓度的任何器件。植入性装置可以是支架、导管、插管、胶囊、贴剂、线、输液套、纤维、分流器、接枝等等。只要可以根据本发明方法进行使用，植入性装置及其各组件部分可以是任何生物相容性材料、几何学形式或构造。
装置可包含循环流，其中装置中的部分输出流循环至输入流。这可有效增加所需细胞的输入浓度，从而改善输出流的浓度。
在另一个实施例中，装置可包含多级串联流动腔。在此种情况下，至少两个装置串联连接，其中一个装置的输出流进入另一个装置的输入流。后续的每个装置可进一步富集、分离和/或纯化所需细胞。
在一个实施例中，对流动腔进行构造，使得流体呈现出骨髓中的复杂的正弦曲线流动，而不是产生明确的抛物线速度曲线。
在一个实施例中，可在纳米管内腔中提供递送分子，用于在滚动过程中递送至细胞。因为在多水高岭土纳米管的内表面和外表面带有净负电荷，而边缘部分是两性的，所以可使用纳米管包封及持续释放药物，尤其是阳离子药物。因此，可在纳米管内装载阳离子药物，然后将纳米管涂覆在微型管的内表面，随后进行功能化步骤，将细胞粘附分子(如选择素)附着在纳米管的外表面。在一个实施例中，可将纳米管进行功能化后将其附着至微型管内表面。在纳米管涂覆上能够进行滚动的靶细胞将处于具有相对高浓度药物的微环境中，所述药物从纳米管中稳定地释放。在另一可选的方式中，治疗药物可装载在纳米管中，该纳米管随后松散地结合于流动表面。在流动表面进行滚动的靶细胞将与纳米管结合并将摄入纳米管，从而内化所装载的治疗剂。由于纳米管上存在的净电荷，因此阳离子药物是最优的候选，适宜的治疗剂包括盐酸多柔比星、盐酸依立替康、以及阳离子抗微生物肽(CAPs)等等。
下列实施例用于对本发明进行说明。应当理解本发明不限于下述实施例所详细描述的特定条件或细节。
实施例1
材料及方法
试剂及抗体
RPMI 1640细胞培养基、胎牛血清、青霉素-链霉素、磷酸盐缓冲液(PBS)、Hank’s平衡盐溶液(HBSS)、及1×胰酶购自Invitrogen(Grand Island，NY)。重组P-选择素-IgG嵌合体及重组E-选择素-IgG嵌合体从R&D system(Minneapolis，MN)获得。多水高岭土纳米管水溶液(6.6％，按重量计)由NaturalNano(Rochester，NY)提供。台盼蓝染料(0.4％)从Lonza(Wilkersville，MD)获得。聚-L-赖氨酸(0.1％w/v的水溶液)从Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)获得。印迹级封闭剂脱脂奶粉从Bio-Rad实验室(Hercules，CA)获得。小鼠抗人CD62P(P-选择素)单克隆IgG从eBioscience(San Diego，CA)获得。Alexa Fluor 546驴抗小鼠IgG(H+L)抗体从Invitrogen(Carlsbad，CA)获得。
细胞系及细胞培养
急性骨髓白血病KG1a细胞系(ATCC号CCL-264.1)及结肠癌Colo205细胞系(ATCC号CCL-222)从ATCC(Manassas，VA)获得。这些细胞系在37℃及5％CO2的湿润条件下培养于添加有2mM 1-谷氨酰胺、25mM HEPES、10％(v/v)胎牛血清及100U/mL青霉素-链霉素的RPMI 1640培养基(通用培养基)中。
制备用于滚动实验的细胞
Colo205细胞，一种粘附细胞系，经胰酶消化5min，然后在使用前对其培养至多5h以确保正常的表面受体的表达。KG1a细胞及Colo205细胞均在4℃的Allegra X-22冷冻离心机中采用1×PBS以1100rpm洗涤两次，并以106细胞/mL的浓度重悬于流动缓冲液中。流动缓冲液由含有Mg2+及饱和Ca2+的PBS组成。经台盼蓝染色，证实至少90％的细胞存活。
制备多水高岭土纳米管溶液
处理多水高岭土储备溶液，以破碎并除去大的聚集物。剧烈搅拌储备溶液并将其用超声波破碎仪进行处理，超声波破碎仪从Fisher Scientific(Pittsburgh，PA)获得。随后采用0.45μm孔径的PVDF膜注射器式滤器(Pall Life Sciences，Port Washington，NY)对所得溶液进行过滤。
制备表面
将重组人P-或E-选择素-IgG嵌合蛋白溶于PBS，以得到20μg/mL的浓度。先用75％乙醇、然后用蒸馏水洗涤表面。对照表面与稀释至2.5-10μg/mL浓度的P-或E-选择素-IgG孵育2h，然后与溶于PBS的5％乳蛋白孵育1h。最后，将固定的选择素分子与含钙流动缓冲液孵育10min，使其活化。涂覆有纳米管的表面与2:8聚-L-赖氨酸溶液(0.02％w/v)孵育5min，然后与经处理的纳米管溶液孵育3min。随后采用与对照表面相同的方式在涂覆有纳米管的表面上涂覆P-或E-选择素-IgG及乳蛋白。所有孵育都在室温下进行。
滚动实验
Micro-Renathane微型管(300μm内径)从Braintree Scientific(Braintree，MA)获得，切割成50cm的长度，并在如上所述的表面功能化后，将其固定在Olympus IX81电动倒置研究用显微镜(Olympus America，Melville，NY)的载物台上。使用CCD照相机(Hitachi，Tokyo，Japan)及DVD记录仪(Sony Electronics)，记录实验数据用于离线分析。通过一台注射器泵(KDS 230，IITC Life Science，Woodland Hills，CA)，控制细胞悬浮液流过微型管，所述细胞悬浮液以106细胞/mL的浓度悬浮于流动缓冲液中。在进行流动实验前，以2.5dyn/cm2的剪切力将细胞载入微型管中且持续5min。随后启用2.5-6.67dyn/cm2的剪切力值，并持续1min以允许建立流动，然后收集数据。
存活实验
用KG1a及Colo205细胞进行存活实验，做三个重复，其中经处理的细胞在含有10％的经处理的多水高岭纳米管溶液的培养基中孵育72h。在血细胞计数器(HausserScientific，Horsham，PA)上使用台盼蓝染料在72h周期的起始和结束时进行活力计数。细胞初始被稀释至2.5×105细胞/mL的浓度。
原子力显微镜检查
使用与涂覆微型管相同的方法，涂覆玻璃盖玻片，由此制备涂覆有多水高岭土纳米管的表面的平坦样本，用于进行原子力显微镜检查。采用如上所述方法，使用处理前或处理后的纳米管溶液制备表面。将新导管切成平面底物，以对内表面进行成像。随后使用Veeco DI-3000原子力显微镜对样本进行成像。在每个样本的五个随机位点记录10μm×10μm的图像，使用Mac OS中的Image SXM 189软件记录表面拓扑结构及相移数据，并进行离线分析。在Image SXM中分析每个平坦的涂覆有纳米管的样本及未处理的管样本的三个图像，以核查表面高度数据。对于每个图像，在贯穿全部图像的20个随机位点上完成该工作。
抗体封闭实验
如上所述，制备涂覆有纳米管的表面及对照表面。在PBS_中将P-选择素-IgG稀释至2.5μg/mL，并在室温(RT)下在微型管内孵育2h。随后在室温下采用溶于PBS_的5％乳蛋白封闭微型管1h。通过与Ca2+饱和的PBS+孵育15min，活化微型管中的P-选择素。在PBS+中将小鼠抗人CD62P(P-选择素)AK-4单克隆抗体稀释至100μg/mL，并在室温下在微型管内孵育2h。随后以低剪切力(2.5dyn/cm2)将流动缓冲液中的细胞悬浮液灌注通过微型管，所述细胞悬浮液包含浓度为106细胞/mL的KG1a细胞，并采用影像显微镜观察流动下的细胞行为。
Ca 2+ 螯合实验
以滚动试验中相同的制备方法，制备涂覆有纳米管的表面及对照表面，PBS_中的P-选择素-IgG蛋白以2.5μg/mL的浓度进行孵育(2h)并用5％乳蛋白进行封闭(1h)。在用Ca2+饱和的PBS+活化P-选择素后，以2.5dyn/cm2的剪切力将浓度为106细胞/mL的KG1a细胞悬浮液灌注通过导管5min。随后停止流动，并用包含5mMEDTA(VWR Inc.，West Chester，PA)的PBS_的注射器替代注射器泵中的注射器，所述注射器泵中的注射器用于从通过导管的细胞来源中抽取细胞悬浮液。将注射器泵从抽取模式转为灌注模式，并经每个导管缓慢泵入一个导管的体积。将EDTA溶液在导管中静置10min，然后经导管缓慢泵入另一个导管体积的EDTA溶液以清除未结合细胞。随后使用影像显微镜检查扫描导管中存在的粘附细胞。
测定P-选择素的表面密度
将八个导管切至20cm的长度。其中四个导管采用多水高岭土纳米管进行涂覆，剩余的四个导管不经涂覆，用作对照导管。使用溶于PBS_的不同浓度的P-选择素-IgG对三个涂覆有纳米管的导管及三个对照导管进行涂覆，然后使用5％乳蛋白进行封闭。用PBS_孵育剩余的涂覆有纳米管的导管及对照导管2h，然后使用5％乳蛋白封闭1h。随后采用Ca2+饱和的PBS+孵育所有导管，以活化被吸收的P-选择素，然后用含100μg/mL的小鼠抗人CD62P(P-选择素)IgG的PBS+孵育2h。采用PBS+充分洗涤导管，并在避光下，在所有导管中用含200μg/mL驴抗小鼠IgG的PBS+孵育2h。随后采用PBS+充分洗涤导管。每次将一个导管置于显微镜载物台上，以避免不等的光漂白作用，且在置于显微镜前，使用手术钳密封导管的两端。使用4×物镜拍摄荧光显微图像，以观察到大面积的背景和导管的大部分。在沿着每个导管长度的随机位点收集十五张显微图像。每个图像的曝光时间被设为300ms。在ImageJ中离线分析显微图像，标出关注区的轮廓，并定量在关注区内的光亮强度柱状图。从柱状图中测定平均强度和标准差。通过扣除导管外区域的强度，分析个体显微图像。随后通过在未涂覆P-选择素的导管中所观察到的平均亮度值，校正相对荧光强度值。
压差实验
如上所述，采用多水高岭土纳米管涂覆50cm导管，并将其与50cm未涂覆的对照导管进行比较。将一个75mL容器与导管相连，并在开始时使用环架将所述容器悬挂，使导管出口达到工作台。工作台上的导管出口与容器上75mL标记处的垂直距离初始设为84cm。随后用水填充容器至75mL标记处，并在整个试验中手动维持该水位。将导管出口置入干燥的称量皿中，同时启动秒表并收集5min的流出液，然后立即将导管出口移除称量皿，并将称量皿称重，以确定流经导管的水体积。将每个导管在四个高度：84、74、64及49cm时都重复上述过程三次。
微球灌注实验
如上所述，制备涂覆有纳米管的导管及对照导管，以2.5μg/mL涂覆2h并封闭1h。将荧光微球以5×105微球/mL的浓度悬浮于流动缓冲液中，并以不同流速灌注通过导管，所述荧光微球具有1.9μm的平均直径及520nm的(Bangs Inc.，Fishers，IN)发射波长。对于各个流速，沿着每个导管选择随机位点，并使用装载1.6×倍数器的20×物镜启动聚焦。使用荧光模式拍摄100张时间分布为10至75ms的经时显微照片，使用TRITC过滤器设定，使得每张显微照片间的间隔为500ms。重复上述工作，使得在四个中的每一个测定的流速下：0.03、0.06、0.095及0.13mL/min，沿着每个导管长度的三个随机位点记录100张显微照片。通过由靠近导管表面的微球移动所产生的焦距内条纹长度，测定微球速度。使用ImageJ进行测定，且使用载玻片测微尺(Olympus，Tokyo，Japan)确定刻度。
数据分析
通过测量滚动细胞在30s的时间间隔内移动的距离计算滚动速度。滚动细胞被定义为，以小于流体自由流动速度50％的平均速度，沿着流动方向移动的细胞。在沿着微型管的三个随机位点拍摄滚动细胞的影像。通过记录沿微型管的30个随机位点的显微图像，确定粘附于表面的细胞数量。所有误差表示为平均值的标准误差，通过GraphPad Prism(GraphPad Software，San Diego，CA)的非配对t检验确定统计学显著性。
结果
多水高岭土纳米管涂覆层降低癌细胞的滚动速度
将流动缓冲液中包含KG1a细胞的细胞悬浮液灌注通过毛细管，流速的范围可传递已知剪切力至导管的内表面上。将涂覆有以P-选择素涂覆的多水高岭土纳米管的导管，与单独涂覆P-选择素的导管进行比较，其中P-选择素溶液孵育浓度为2.5μg/mL。在剪切力范围内，与对照导管相比，涂覆有纳米管的导管中的KG1a细胞平均滚动速度出现显著降低(图1A)。
由纳米管涂覆层导致的滚动速度降低随着P-选择素表面密度的增加而减弱
在P-选择素的表面密度范围内，比较KG1a细胞在涂覆有纳米管的表面上与在对照表面上的平均滚动速度。发现在涂覆有纳米管的表面上，细胞的平均滚动速度显著低于在对照表面上的平均速度；然而，平均滚动速度减少的程度随着P-选择素表面密度的增加而降低。在较低及较高的剪切力下(分别对应图1B及C)均存在上述发现。同时发现P-选择素表面密度的增加显著影响在对照表面上的滚动速度，但是对涂覆有多水高岭土的表面上，在较低及较高剪切力下，对滚动速度的影响均较小。
多水高岭土纳米管涂覆层增加被捕获细胞的数目
滚动及静态粘附于导管表面的细胞数目可用于指示表面捕获靶细胞群的效力。分析粘附在导管内表面的细胞数目，作为剪切力及P-选择素表面密度的函数。发现在涂覆有纳米管的表面上，捕获的细胞数目的显著增加(图2A，B)，在较低及较高剪切力(分别对应图2C及D)下的所有P-选择素表面密度下均如此。有趣的是，纳米管涂覆层的效果对P-选择素的表面密度不敏感。
上皮CTC在涂覆有纳米管的表面上呈现相似的行为
将Colo205结肠癌细胞灌注通过涂覆有多水高岭土及E-选择素的导管以及单独涂覆E-选择素的导管，并在一定的剪切力范围内比较其行为。Colo205细胞被用作上皮癌CTC模型。对于这些实验，E-选择素孵育溶液的浓度恒定在2.5μg/mL。由于涂覆有多水高岭土纳米管，使得Colo205的平均滚动速度均降低且粘附细胞数量增加，这类似于KG1a细胞中的情况(分别对应图3A及B)。
多水高岭土纳米管未影响细胞的存活
在分散有和未分散有多水高岭土纳米管的培养基中培养细胞，在37℃及5％CO2的湿润条件下孵育72h后测试细胞的存活。经处理的细胞是那些培养在10％纳米管溶液与90％培养基中的细胞，而未处理的细胞是那些培养在10％蒸馏水与90％培养基中的细胞。如图4A及4B所示，在72h孵育后，KG1a及Colo205细胞均未受到培养基中存在的纳米管的影响。
AFM显示纳米管伸出表面
对涂覆在聚-L-赖氨酸薄层上的纳米管拍摄原子力显微镜的图像，显示纳米管的定位使得其伸出表面数百纳米至数微米的距离。同时拍摄了未处理的纳米管(图5B)及经处理的纳米管(图5C)，并发现处理步骤可有效破坏并除去大的聚集物，因此基本上不含有聚集物；而同时，纳米管大多保持了伸出表面的高度。
免疫荧光标记显示纳米管涂覆层上增加的P-选择素吸附
用P-选择素特异性的标记抗体进行荧光显微镜检，显示吸附在涂覆有纳米管表面上的P-选择素的表面密度显著大于对照导管上的P-选择素的表面密度(图6A)。随着P-选择素孵育溶液浓度的升高，由于纳米管涂覆导致的P-选择素表面密度的相对差异减弱。代表性的显微图像如图6B及C所示。对各图像计算相对于背景亮度的荧光强度值，随后通过由于导管自发荧光或非特异性抗体结合而观察到的少量荧光，对导管的平均荧光值进行校正。
选择素介导的细胞捕获的特异性
在一组实验中，采用与其他滚动实验相同的方式制备导管，然后与用于封闭的抗P-选择素抗体进行孵育。在对照导管或涂覆有纳米管的导管中均只有极少量的细胞粘附(图8)。在另一组实验中，制备用于滚动实验的涂覆有纳米管的导管及对照导管，允许细胞发生粘附及滚动。随后引入EDTA，以螯合溶液中的所有二价离子，从而使P-选择素失活。在轻柔洗涤导管以除去所有未结合细胞后，在导管中未观察到保持粘附的细胞(图9)。
多水高岭土纳米管涂覆层未改变宏观流体动力学
将具有或不具有纳米管涂覆层的50cm纳米管置于恒定的流体静压差中。通过称重在导管出口处5min时间内收集的流体，测定四个不同容器高度下流经导管的流速。计算在涂覆有纳米管的导管中及对照导管中的流速，发现在各容器高度下的平均流速差异为：84cm相差0.18％、74cm相差0.71％、64cm相差0.77％而49cm相差2.1％。使用Hagen-Poiseuille方程式计算理论流速，发现实验值与理论十分匹配(图7A)。
多水高岭土纳米管涂覆层改变流动颗粒的表面分离距离
将荧光微球以不同流速灌注通过涂覆有纳米管的导管及对照导管，以获得流体速度及壁切变率的局部量值。经时荧光显微镜检可计算个体微球的速度。发现涂覆有纳米管的导管中，平均微球速度显著高于对照导管中的速度，且发现在涂覆有纳米管的导管中，伴随灌注率增加的微球速度增长率更高(图7B)。
分析若干纳米管涂覆表面及未处理管表面的AFM图像，以表征其纳米级拓扑结构(图7C)。在AFM图像的20个随机薄层断片中，评估最大表面特征高度，发现对照导管中的平均最大表面特征高度是～30nm，而涂覆有纳米管的表面上的平均最大特征高度是～505nm。由于微球不能流动到比表面上的最高的粗糙元件更接近于管表面的地方，因此可将该平均最大特征高度用于限制表面-表面分离参数。根据剪切流体中近壁球体的Stokes流体方程，可以计算微球在离平面壁特定距离移动时的理论速度
U hS ~ 0.7431 0.6376 - 0.200 ln ( δ / a ) - - - ( 1 )
其中U是微球速度、h是微球中心与壁之间的距离、S是切变率、δ是微球表面与壁(分离距离)之间的距离、而a是微球半径(图7B)。根据测量的表面粗糙度预测得到的微球速度，与不具有可调参数的实验观察值十分匹配。这表明，在涂覆有纳米管的表面上移动的微球，与在对照表面上流动的微球具有相同的速度场；但是，由于大的粗糙元件的作用，而使它们处于不同的流线。
在本实施例中，我们已证明，多水高岭土涂覆层可显著增强在流动条件下选择素介导的细胞向微型管表面的粘附，且该细胞粘附特异性地由选择素相互作用所介导(图8及9)。随着剪切力的增加，发现滚动速度增加以及被捕获细胞数目减少。这很可能是因为增加的剪切力将传递更大的作用力，以对抗细胞沿表面滚动时选择素分子与其细胞表面配体间的结合。此外，发现滚动速度曲线与纳米管涂覆层的浓度具有密切的相关性，当纳米管涂覆层被持续稀释后，滚动速度变快(数据未显示)。此外，当P-选择素浓度低于2.5μg/mL时，可观察到细胞捕获急剧降低(图10)。
我们发现，当选择素的表面密度较低时，涂覆有纳米管的表面与对照表面间的滚动速度存在巨大差异，且该滚动速度的差异随着选择素表面密度的增加而减小(图1B及C)。该现象可通过纳米管涂覆层上的饱和效应加以解释。当相对大尺寸的多水高岭土纳米管附着在表面上时，表面的总面积必然会增加，并提供更大的可吸收选择素分子的面积。因此，对于给定的选择素孵育浓度，在涂覆有纳米管的表面上将会具有更加宏观的表面选择素密度。选择素表面密度的增加将会导致滚动速度随之降低，因为每个细胞会具有更大的结合平均数目，并需要破坏更多的结合才能实现细胞的继续滚动。
免疫荧光测试支持了该假设，纳米粒涂覆的表面具有显著更高的P-选择素密度，且在P-选择素孵育浓度最高时，该差异减小(图6A)。需要注意的是，所使用的P-选择素抗体特异性针对P-选择素的糖识别域(CRD)，CRD为P-选择素与细胞结合的区域。因此，该实验仅检测那些能够以适当的方向进行结合的P-选择素分子。
进一步研究了表面上的粘附细胞的数目，以表征纳米管涂覆层的影响。在所有条件下均观察到捕获的显著增强。然而，随着表面上的选择素表面密度的增加，并未发现纳米管涂覆层的影响如此前对滚动速度那样出现减弱。因此，由纳米管导致表面积增加的简单解释不能完全说明该趋势，因为表面上被捕获的细胞数目未出现饱和。
对上述观察到的现象的一种可能的解释参考了已报道的纳米管尺寸：纳米管的定位为从表面向外伸出，将选择素分子进一步向外伸出至流体面中(图5A)。因为流体润滑力，当细胞靠近壁时，其沉降时间值以1/δ(其中δ是表面-表面分离距离)增加。因此，选择素分子可能出现在接近表面的润滑区域内，而原本需要更多沉降时间才能接触表面的流动细胞则较早地被捕获至表面并开始滚动。因此，随着选择素孵育浓度的增加，更多的选择素出现在流动场内，且细胞以更高的比率被捕获。在平坦表面上加入更多选择素并不会产生该现象，因此，多水高岭土对捕获细胞数目的影响并未减小。
通过原子力显微镜研究表面上的纳米管定向，发现纳米管的确在表面上伸出数百纳米(图5B)。还发现，为在所有试验中制备均质的溶液，开发了对多水高岭土储备溶液进行处理的步骤，该步骤不会显著改变纳米管涂覆层的拓扑结构，因为那些纳米管在表面上伸出相似的高度，并具有可比的表面峰密度(图5C)。
在两个单独的实验中检验纳米管涂覆层对微型管内流体动力学的影响，上述实验被设计为探究宏观及微观流动行为。在一个实验中，通过维持容器中的流体水平，将沿导管长度的压差设定为恒定值，同时测定流速。随后移动容器至不同高度以产生不同的恒定压差。观察到涂覆有纳米管的导管及对照导管的总体流速差异极小。研究了2至15范围内的雷诺数，该范围超出了粘附实验中所使用的流速范围。其较好地分布于层流区内，因而，认为摩擦因子与表面粗糙度无关。因此，可以使用Hagan-Poiseuille方程式评估各导管中的流体流动速度，并且与实验结果的比较也证实了这一点(图7A)。用于流经导管的粘稠、不可压缩流体的Hagan-Poiseuille层流方程式将压差与流量进行了如下的关联
ΔP = 8 μLQ π r 4 - - - ( 2 )
其中ΔP是压差、μ是流体的动力学粘度、L是导管长度、Q是体积流量、而r是导管半径。因为实验中控制了ΔP、μ、及L，而且也发现Q在两种导管中是相同的，因此我们可以得出两种导管具有相等的水力学半径。
检验了涂覆有纳米管的导管中的微量流体动力学，并将其与对照导管进行比较。荧光微球的显微镜延时动态视频最初显示，接近导管表面的流体动力学是不同的，这是由于微球在涂覆有纳米管的导管中比在对照导管中移动更快的观察结果。然而，既然之前已确定，总流体流动对应于具有或不具有纳米管涂覆层的相同的导管直径，对于该观察结果的另一种解释是，涂覆有纳米管的导管中的微球在远离导管表面的流线上进行移动。
沿着表面流动的负浮力粒子接近表面的最近距离只能与表面上的最大粗糙度特征相同。当考虑接近表面的微球的沉降速度时，这是显而易见的。可通过Smart及Leighton所使用的针对Stokes定律的Brenner校正，对沉降速度进行计算(Phys.FluidsA，1989，1(1)：52-60)。
F＝6πμa2USλ             (3)
其中US是球体沉降速度，而λ是校正项
λ = 4 3 sinh ( α ) ×
Σ n = 1 ∞ [ ( n ( n + 1 ) ( 2 n - 1 ) ( 2 n + 3 ) ) ( 2 sinh ( 2 n + 1 ) α + ( 2 n + 1 ) sinh ( 2 α ) 4 sin h 2 ( n + 1 2 ) α - ( 2 n - 1 ) 2 sinh 2 ( α ) - 1 ) ] - - - ( 4 )
α = cosh - 1 ( 1 + δ ) = ln ( 1 + δ + δ ( 2 + δ ) ) - - - ( 5 )
通过进行微球受力平衡、对较正阻力及净浮力进行平衡，预测沉降速度，即4/3πa3Δρg，在δ＝505nm时是5×10-5nm/s，而在δ＝30nm时是3×10-6nm/s。考虑到微球以102-103μm/s的数量级进行移动，且存在每10μm 1个数量级的粗糙度特征，预期微球将以距离表面恒定的距离进行移动，该距离由最高粗糙度特征所确定。纳米管伸入流体中的高度足以解释微球在其上流动的分离距离，并进一步提供证据证明导管中的流体流动场未被出现的纳米管涂覆层所改变，而颗粒/细胞对流将会被改变(图7C)。因此，导管中的切变率，以及通过Poiseuille定律所预测的导管表面上的剪切力，在给定的流速下与光滑面是等同的。既然导管半径比微球大约150倍，且比特性参数δ大约150倍，因此假设为平面构造而产生的误差是可忽略的。
不同于之前一些关于纳米颗粒对细胞具有细胞毒性的报道，发现多水高岭土纳米颗粒是无毒的(图4)。该发现，结合其对于白血病及上皮CTC捕获的同等的增强作用，表明多水高岭土纳米管涂覆层提供了用于增强癌细胞捕获的有效并实用的方法，并最终有望推动个体化癌症治疗的可行性。
虽然本发明通过特定的实施例进行描述，但是本领域技术人员显然知道，经过常规的修改可得到各种不同的实施例。这些变化方式也落入本发明的保护范围内。

Claims (16)

1.一种用于细胞迁移的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供其上固定有纳米管的表面，所述纳米管选自多水高岭土和二氧化硅，且所述纳米管的外表面固定有支持细胞滚动的细胞粘附分子，其中所述支持细胞滚动的细胞粘附分子选自下组：选择素、钙粘素、整合素和GP1b；以及
b)在所述表面上流动包含细胞混合物的流体，其中，与细胞表面不表达细胞粘附分子的配体的细胞相比，在细胞表面表达细胞粘附分子的配体的细胞呈现滚动并因此以不同的速度进行流动，从而允许将表达配体的细胞与不表达配体的细胞分离，其中所述滚动是指当受体介导的粘附作用导致细胞移动速度降至低于自由流体动力学速度的50％时，细胞在表面移动至少一个细胞直径。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述选择素选自下组：P-选择素、L-选择素和E-选择素。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞混合物中的一种细胞是干细胞或癌细胞。
4.根据权利要求1所述的方法，其中步骤b)包括使细胞承受0.5至10dynes/cm2的剪切力。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述纳米管是多水高岭土纳米管，且至少50％的纳米管具有500至1200nm的长度及40至200nm的直径。
6.一种用于细胞迁移的装置，所述装置包含内表面上固定有纳米管的流体流动腔，所述纳米管选自多水高岭土和二氧化硅，并且所述纳米管的外表面固定有支持细胞滚动的细胞粘附分子,其中所述支持细胞滚动的细胞粘附分子选自下组：选择素、钙粘素、整合素和GP1b。
7.根据权利要求6所述的装置，其中所述装置的内径介于10-500微米以促进靶细胞朝着装置表面靠边。
8.根据权利要求6所述的装置，其中在固定所述纳米管之前，采用包含正电荷分子的组合物对腔体内表面进行涂覆。
9.根据权利要求8所述的装置，其中所述正电荷分子是聚L-赖氨酸或钛酸丁酯。
10.根据权利要求6所述的装置，其中所述纳米管是多水高岭土纳米管且至少50％的纳米管具有500nm至1.2μm的长度及40nm至200nm的直径。
11.根据权利要求6所述的装置，其中所述纳米管插入所述流体流动腔的内腔至多1.2μm的高度。
12.根据权利要求11所述的装置，其中所述纳米管插入所述流体流动腔的内腔至多900nm的高度。
13.根据权利要求6所述的装置，其中所述选择素选自下组：P-选择素、L-选择素和E-选择素。
14.根据权利要求6所述的装置，其中所述纳米管在所述内腔中装载递送分子，用于在滚动过程中递送至细胞。
15.根据权利要求14所述的装置，其中所述递送分子是阳离子分子。
16.制备用于细胞迁移装置的方法，所述方法包括如下步骤：
a)提供流体流动腔；
b)提供纳米管，所述纳米管选自多水高岭土和二氧化硅，所述纳米管不含聚集物；
c)将支持细胞滚动的细胞粘附分子附加至所述纳米管的所述外表面，其中所述支持细胞滚动的细胞粘附分子选自下组：选择素、钙粘素、整合素和GP1b；
d)将c)中的所述纳米管附加至所述流体流动腔的流动表面。
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