CN102732510A - 一种同时驱除炭疽杆菌毒力大质粒pXO1和pXO2的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种同时驱除炭疽杆菌毒力大质粒pXO1和pXO2的方法。本发明提供了一种DNA分子，其核苷酸序列为序列表中的序列1。含有所述DNA分子的重组载体、转基因细胞系或重组菌。所述重组载体为将所述的DNA分子插入穿梭质粒的HindIII和EcoRI识别位点间得到的载体。本发明的实验证明，本发明根据质粒不相容原理构建一个不相容质粒，获得了一株不含毒力大质粒的菌株A16QT。该方法具有简单、快速、特异性好、安全性高的特点。该方法对于构建炭疽杆菌的质粒缺失株，从而研究大质粒pXO1和pXO2与染色体的相互作用具有极其重要的意义，对于构建新的疫苗株提供了新的实验手段，为炭疽杆菌的防治提供了新的思路。

Description

一种同时驱除炭疽杆菌毒力大质粒pXO1和pXO2的方法

技术领域

本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种同时驱除炭疽杆菌毒力大质粒pXO1和pXO2的方法。

背景技术

炭疽杆菌是一种杆状、能形成芽胞的革兰氏阳性杆菌，能够引起人畜的炭疽病，如果不及时治疗，死亡率极高。炭疽杆菌含有两个致病相关的毒力大质粒：pXO1(181.6kb)和pXO2(96.2kb)。质粒pXO1编码保护性抗原、致死因子和水肿因子等炭疽毒素蛋白及他们的调控基因。质粒pXO2编码参与荚膜形成和降解的基因。这两个质粒对于炭疽杆菌的致病性至关重要，丢失任何一个质粒都会导致炭疽菌的毒力极大的减低。因此对于炭疽杆菌毒力大质粒的研究一直是研究的热点。构建驱除毒力质粒的突变菌株对于研究质粒在炭疽杆菌致病中的作用及染色体的相关调控非常重要。

驱除细菌的大质粒可以使用驱除化学试剂、高温培养或紫外照射等方法。Sterne等在1937-1939年期间，用含50％动物血清的培养基上，于20％CO₂条件下培养，挑选粗糙型集落，选育出无荚膜之弱毒菌株(pXO2^-)，广泛用于世界各国制备兽用炭疽芽胞苗。我国杨叔雅、庄汉澜等人1953年，采用人工紫外线照射定向变异方法，选育出人用弱毒菌苗株A16R(其为pXO1⁺pXO2^-)，经检定证明安全性和免疫原性较好，1960年正式用于制备人用炭疽活菌苗。2004年王秉翔采用在42.5℃高温培养筛选出一株pXO1丢失的突变炭疽菌，该菌株完全丧失了形成芽胞的能力。2006年展德文等采用42℃高温培养法，驱除了炭疽杆菌人用减毒疫苗株A16R(pXO1⁺pXO2^-)中的大质粒pXO1，获得一株无质粒的炭疽菌A16RP(pXO1^-pXO2^-)，该菌株芽胞形成能力正常；2007年韩国的Sung-Ha Park等人，采用42℃高温培养法从炭疽杆菌H9401(pXO1⁺pXO2⁺)株中驱除了大质粒pXO1，获得了一株衍生菌H94O1(pXO1^-pXO2⁺)。这些驱除大质粒的方法中，毒力大质粒的丢失是随机的，在驱除一个目的质粒的时候，很可能同时驱除另一个质粒，因而必须经过大量的筛选过程，有时甚至得不到所需要的菌株，另外，在筛选的过程中可能导致宿主菌染色体的随机突变，这必将使后期实验结果的解释复杂化，因而需要建立一种用于炭疽杆菌毒力大质粒驱除的特异、安全和有效方法。

质粒不相容是指两个不同的但是相关的质粒不能稳定地在同一个细胞中遗传。这种不相容性主要是由于互相竞争相同的复制位点或分离位点，或者是由于复制起始的抑制。使用这个原理可以模拟自然机制使用一个小的、高拷贝的质粒来去除毒力大质粒。这种方法驱除质粒可以特异的构建质粒缺失菌株而避免了诱导突变的危险。在一些细菌中已经应用质粒不相容原理成功的驱除了目的质粒，证明这是一种高效、安全的方法。但是由于对炭疽杆菌大质粒的复制和分离的还不是很清楚，因而该方法在炭疽杆菌中的应用尚未见报道。

一直以来，人们作了很多努力来解释pXO1的复制和分离，但是鉴定质粒pXO1的复制子的研究进展很慢，这是因为这个质粒不编码任何与其它质粒编码的已知的复制起始蛋白有相似性的蛋白。Robertson等人于1990年尝试这定位pXO1的复制起始区，克隆了pXO1的DNA片段进入大肠杆菌的质粒然后转化到枯草杆菌中，鉴定到了几个克隆，定位在质粒pXO1上一个11kb的区域，这段序列包含10个开放阅读框，编码的产物与已知参与theta复制的rep蛋白无序列相似性。1999年，Jacques Ravel等人用鸟枪法获得了pXO1质粒的全序列，pXO1质粒不含有已知的革兰氏阳性菌复制和分离相关的序列及复制蛋白。在2009年，Andrei P等人应用Cre-loxP重组系统鉴定到一个不同于以前鉴定到的pXO1复制起始区，这段序列长约5.95kb。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种DNA分子。

本发明提供的一种DNA分子，为如下(1)或(2)或(3)

(1)序列表中序列1所示的DNA分子；

(2)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能蛋白的DNA分子；

(3)与(1)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码具有相同功能蛋白的DNA分子。

含有所述DNA分子的重组载体、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。

所述重组载体为将所述的DNA分子插入穿梭质粒的HindIII和EcoRI识别位点间得到的载体。

所述穿梭质粒为温敏型穿梭质粒，

所述温敏型穿梭质粒具体为pKSV7。

所述重组载体在同时驱除炭疽杆菌毒力大质粒pXO1和pXO2中的应用也是本发明保护的范围。

本发明的第二个目的是提供一种同时驱除炭疽杆菌毒力大质粒pXO1和pXO2的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：

将所述重组载体转入出发菌，得到重组菌；将所述重组菌传代培养，至所述重组菌中的炭疽杆菌毒力大质粒pXO1和pXO2被驱除，得到同时驱除炭疽杆菌毒力大质粒pXO1和pXO2的重组菌。

所述同时驱除炭疽杆菌毒力大质粒pXO1和pXO2的方法中，将所述重组载体转入出发菌前，还包括将所述重组载体去甲基化的步骤，

所述去甲基化的方法包括如下步骤：

1)、将所述重组载体转入甲基化酶缺陷的大肠杆菌中，得到重组菌1；

2)、提取步骤1)得到的所述重组菌1的质粒，得到去甲基化的重组载体；

所述同时驱除炭疽杆菌毒力大质粒pXO1和pXO2的方法中，在所述传代培养后，还包括将所述同时驱除炭疽杆菌毒力大质粒pXO1和pXO2的重组菌去除所述重组载体的步骤，

将所述同时驱除炭疽杆菌毒力大质粒pXO1和pXO2的重组菌去除所述重组载体的方法包括如下步骤：

将所述同时驱除炭疽杆菌毒力大质粒pXO1和pXO2的重组菌分别接种在无所述重组载体抗性筛选标记物培养基和含所述重组载体抗性筛选标记物的培养基中培养，选取在无所述重组载体抗性筛选标记物培养基生长且在含所述重组载体抗性筛选标记物的培养基上不生长的菌，得到驱除炭疽杆菌毒力大质粒pXO1、pXO2和所述重组载体的重组菌。

所述出发菌为炭疽杆菌(Bacillus anthracis)；

所述甲基化酶缺陷的大肠杆菌为大肠杆菌SCS110；

所述抗性筛选标记物为氯霉素；

所述传代培养的温度为不高于30℃，所述传代培养的温度具体为30℃；

所述将同时驱除炭疽杆菌毒力大质粒pXO1和pXO2的重组菌去除所述重组载体的方法中，所述培养温度为37℃-42℃，所述培养温度具体为37℃。

由所述方法制备的驱除炭疽杆菌毒力大质粒pXO1和pXO2的重组菌和/或驱除炭疽杆菌毒力大质粒pXO1、pXO2和所述重组载体的重组菌也是本发明保护的范围。

所述的DNA分子、所述重组载体、所述的驱除炭疽杆菌毒力大质粒pXO1和pXO2的重组菌和/或驱除炭疽杆菌毒力大质粒pXO1、pXO2和所述重组载体的重组菌在制备疫苗中的应用也是本发明保护的范围；所述疫苗具体为炭疽疫苗；

一种炭疽疫苗，其活性成分为所述的驱除炭疽杆菌毒力大质粒pXO1和pXO2的重组菌和/或驱除炭疽杆菌毒力大质粒pXO1、pXO2和所述重组载体的重组菌。

本发明的实验证明，本发明根据质粒不相容的原理，把来自于pXO1的一段序列和来自于pXO2的一段序列串联起来，与一个温敏型质粒连接起来构建成一个不相容质粒，该质粒能够特异地从炭疽杆菌A16(pXO1⁺pXO2⁺)中驱除毒力大质粒pXO1和pXO2，得到构建炭疽杆菌的质粒缺失株，该方法对于研究毒力大质粒与染色体的相互作用具有极其重要的意义，必将加深目前对于炭疽杆菌毒力大质粒复制和分离的认识，同时对于构建新的疫苗株提供了新的实验手段，为炭疽杆菌的防治提供了新的思路。

附图说明

图1为外源重组质粒pKORT示意图

图2为外源重组质粒pKORT的PCR鉴定图

图3为重组质粒pKORT导入炭疽杆菌A16中鉴定引物示意图

图4为驱除pXO1和pXO2的初步筛选

图5为驱除pXO1和pXO2的PCR方法鉴定

图6为Western Blotting方法检测PA蛋白

图7为野生株炭疽杆菌A16和驱除质粒炭疽菌pKORT/A16荚膜形成检测

图8为外源重组质粒pKORT从A16中驱除鉴定

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、驱除pXO1的重组菌的获得及鉴定

1、驱除质粒构建

1.1温敏型质粒线性化

将温度敏感型穿梭质粒pKSV7(6.9Kb)用限制性内切酶HindIII和EcoR I双酶切线性化(HindIII和EcoR I是pKSV7的多克隆位点)，之后0.6％琼脂糖凝胶电泳分离，从凝胶上切下目标条带，用DNA凝胶回收试剂盒回收线性化载体pKSV7片段，操作步骤按照说明书进行。

骨架质粒：pKSV7质粒(其上既没有转座子也没有插入序列)：Smith K，YoungmanP.Use of a new integrational vector to investigate compartment-specificexpression of the Bacillus subtilis spoIIM gene[J].Biochimie，1992，74：705-711.，公众可从中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所获得。

1.2.驱除片段的PCR获得

以炭疽杆菌(Bacillus anthracis)A16(既有pXO1⁺又有pXO2^-，记载在自国内强毒炭疽杆菌中一株变异疫苗株的获得，杨叔雅等，军事医学杂志，第1卷，第4期，288，1958，公众可从中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所获得。)基因组为模板，分别使用引物对OR1_F/OR1_FR、OR2_F/OR1_FR(序列见表1)，进行PCR扩增，分别得到PCR产物OR1和PCR产物OR2。

PCR的体系为100uL(1μL Pyrobest DNA polymerase，10μL 10X Polymerase Buffer，8μL dNTP mixture，2μL模板DNA，2μL primer F，2μL primer R，用去离子水补足100uL体系)；PCR的条件为：先94℃变性5min，接着进行30个循环反应：94℃变性40s，56℃退火40s，72℃延伸6min，最后在结束前在在72℃延伸5min。

之后用琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒(博迈德公司)分别回收OR1和OR2，操作按照说明书进行。

1.3驱除片段与线性化载体连接、转化、培养、鉴定

使用CloneEZ连接试剂盒(南京金斯瑞公司)进行1.1得到的线性化载体pKSV7与1.2得到的OR1和OR2连接反应。30μL体系连接体系：6μL质粒载体pKSV7，8μL OR1片段，7μL OR2片段，酶与buffer各3μL，灭菌纯水3μL。具体方法按照试剂盒说明书进行。取连接体系10μL转化化学感受态细胞DH5a，之后在1mL不含抗生素的LB培养基中在200rpm摇床上30℃培养3小时；在含氨苄青霉素(100μg/mL)的LB琼脂板上涂布，在30℃孵箱中培养12小时。挑取单克隆提取质粒进行PCR，引物分别为OR1_F/OR1_R、引物OR2_F/OR2_R、OR1_F/OR2_R，结果见图2所示，图中1为引物OR1_F/OR1_R，2为引物OR2_F/OR2_R，3为OR1_F/OR2_R的扩增条带，M为DNA标准。从图中看出，分别得到4869bp、3857bp、8685bp的片段为阳性质粒，将阳性质粒送去测序，结果为该阳性质粒中含有序列表中的序列1，该质粒为将序列表中的序列1同源重组到pKSV7的HindIII和EcoRI酶切位点间得到的载体，将该质粒命名为pKORT，pKORT的结构示意图如图1所示。

序列表的序列1由8685个核苷酸组成。

2.驱除炭疽炭疽A16中的pXO1和pXO2质粒

A、转化：将1得到的质粒pKORT先电转入大肠杆菌SCS110(购自TransGen公司，电转感受态制备参照：Shatalin KY，Neyfakh AA(2005)Efficient gene inactivationin Bacillus anthracis.FEMS Microbiol Lett 245：315-319)去甲基化后(将电转化的菌株再次提取质粒后，电转入A16，因为非去甲基化的质粒进入炭疽后，将会被降解，影响质粒的转化)，再将其电转入炭疽杆菌A16感受态细胞中(制备参照：Shatalin KY，Neyfakh AA(2005)Efficient gene inactivation in Bacillusanthracis.FEMS Microbiol Lett 245：315-319)，电转化炭疽杆菌时的电击条件是：电压，0.6kv；电阻，500Ω；电容，25μF；所用电击仪为：产自美国的Bio-RADGenePulser II electroporator；电击杯规格为0.1cm。

B、筛选过程：电转完毕后加1mL不含抗生素的LB培养基，在200rpm摇床上30℃培养3小时；在含氯霉素(5μg/mL)的LB琼脂平板上涂布(炭疽芽孢杆菌是革兰氏阳性菌，在革兰氏阳性菌中使用氯霉素进行筛选)，在30℃培养箱中培养12小时。然后对平板上长出的单克隆进行PCR鉴定，鉴定引物采用ORTid_F/ORTid_R(序列见表1，PCR示意图如图3所示)，得到约645bp(序列表中序列1的第4512-5156位核苷酸)的片段为阳性克隆，提取阳性克隆的质粒送去测序，结果为该质粒为pKORT，将含有该质粒的克隆命名为pKORT/A16。

C、鉴定结果：

1)菌落PCR初步筛选

将pKORT/A16接入含氯霉素(5μg/mL)的Luria-Bertani(LB)液体培养基中，在30℃摇床上225rpm培养12小时，吸取4uL培养液转接到4mL新鲜的LB肉汤中(含氯霉素5μg/mL)，在30℃摇床上225rpm培养12小时，如此转接和培养5次，吸取部分菌液适当稀释后，涂LB平板(含氯霉素5μg/mL)。挑取单克隆进行菌落PCR，对质粒pXO1上的特异的几个基因(pagA，lef，cya和atxA)以及pXO2上的特异基因(capA，capB，capC)进行PCR检测，以菌落为模板，pagA的特异引物pag_F、pag_R，lef的特异引物lef_F、lef_R，cya的特异引物cya_F、cya_R，atxA的特异引物atxA_F、atxA_R分别作为引物，capA的特异引物为CapA-F和CapA-R，capB特异引物为CapB-F和CapB-R，capC特异引物为CapC-F和CapC-R(引物的序列均见表1)，结果如图4所示，从图中可以看出，pKORT/A16菌株单菌落都没有阳性扩增条带，表明pXO1和pXO2质粒可能已经丢失。

菌落鉴定没有扩增条带的菌株为阳性pKORT/A16。

传代5次，即可筛选出阳性菌株，传代10次，筛选率可达到92％。

2)使用另外18对引物进一步确定的结果

为了进一步确认pXO1和pXO2的丢失情况，提取初步筛选为阳性pKORT/A16的基因组DNA，对pXO1和pXO2上质粒上的各9个特异基因进行检测(具体见表1)，pXO1_07的特异引物为pXO1_07F和pXO1_07R、pXO1_13的特异引物为pXO1_13F和pXO1_13R、pXO1_16的特异引物为pXO1_16F和pXO1_16R、pXO1_23的特异引物为pXO1_23F和pXO1_23R、pXO1_70的特异引物为pXO1_70F和pXO1_70R、pXO1_90的特异引物为pXO1_90F和pXO1_90R、pXO1_95的特异引物为pXO1_95F和pXO1_95R、pXO1_98的特异引物pXO1_98F和pXO1_98R、pXO1_116的特异引物pXO1_116F和pXO1_116R、pXO2_007的特异引物pXO2_007F和pXO2_007R、pXO2_039的特异引物pXO2_039F和pXO2_039R、pXO2_060的特异引物pXO2_060F和pXO2_060R、pXO2_084的特异引物pXO2_084F和pXO2_084R、pXO2_089的特异引物pXO2_089F和pXO2_089R、pXO2_094的特异引物pXO2_094F和pXO2_094R、pXO2_097的特异引物pXO2_097F和pXO2_097R、pXO2_107的特异引物pXO2_107F和pXO2_107R、pXO2_111的特异引物pXO2_111F和pXO2_111R；引物具体序列如下表1中所示，以A16D1(pXO1-/pXO2+)和A16R(购自兰州生物制品研究所，其为pXO1+/pXO2-)为对照；

结果如图5所示，图中的1，2，3分别代表A16D1(pXO1-/pXO2+)、A16R和pKORT/A16三个菌株；A和B图为pXO1质粒丢失情况鉴定结果，C和D图为pXO2质粒丢失情况鉴定结果。

A16D1(pXO1^-/pXO2⁺)通过如下方法制备：以炭疽杆菌(Bacillus anthracis)A16R(购自兰州生物制品研究所，其为pXO1⁺/pXO2^-)基因组为模板，使用引物对5K_F和5K_R(表1)，进行PCR扩增得到PCR产物(炭疽杆菌质粒pXO1(GenBank accession no.AF065404)上的一段序列，范围包括第19072到23919位)，将温度敏感型穿梭质粒pKSV7(6.9Kb)用限制性内切酶SmaI酶切线性化，使用CloneEZ连接试剂盒(南京金斯瑞公司)将线性化载体pKSV7与PCR片段连接，得到重组质粒pKS5K。将pKS5K先电转入大肠杆菌SCS110(购自TransGen公司)去甲基化后，再将其电转入炭疽杆菌A16感受态细胞中，用氯霉素(5μg/mL)的LB琼脂平板筛选，得到重组菌pKS5K/A16。将pKS5K/A16接入含氯霉素(5μg/mL)的LB液体培养基，在30℃摇床上225rpm培养12小时，吸取50uL培养液转接到5mL新鲜的LB肉汤中(含氯霉素5μg/mL)，在30℃摇床上225rpm培养12小时，如此转接和培养8次，吸取部分菌液适当稀释后，涂LB平板(含氯霉素5μg/mL)。挑取单克隆进行菌落PCR，对质粒pXO1上的特异的几个基因(pagA，lef，cya和atxA)行PCR检测，PCR检测结果显示pXO1已经去除的单菌落命名为pKS5K/A16D1，将pKS5K/A16D1，接5m无抗性LB液体培养基在37℃的摇床上培养10h，然后按1％转接到另一5mL无抗性LB液体培养中于37℃摇床上培养12h，反复按1％转接多次后，对菌液进行梯度稀释，取10^-4、10^-5两个稀释度的菌液，涂布无抗平板。次日，挑取平板上的单克隆进行点板，每一个单克隆分别点板于LB无抗板和含氯霉素(Cm浓度为5μg/mL)的LB琼脂平板，将点板后的平板置30C培养箱中培养。次日，挑取在无抗性平板上生长而在Cm抗性琼脂平板上不生长的单克隆进行菌落PCR鉴定(pKSV7P3_F和pKSV7P3_R，pKSV7P6_F和pKSV7P6_R)和Cm抗性试管(5μg/mL)转接培养(30℃，225rpm摇床培养)，确定其在Cm抗性试管中不长，并用PCR鉴定，以pKSV7P3的特异引物为pKSV7P3_F和pKSV7P3_R、pKSV7P6的特异引物为pKSV7P6_F和pKSV7P6_R，PCR结果没有相应的特异性条带的为正确的菌株，将该克隆命名为A16D1(pXO1-/pXO2+)。

具体结果如下：以A16R基因组DNA为模板时，pXO1上的9对特异引物都能扩增出特异条带，pXO1_07(1104bp，AF065404第8352到6544)；pXO1_13(787bp，AF065404第19002到15040)；pXO1_16(742bp，AF065404第22188到23897)；pXO1_23(1286bp，AF065404第33006到31621)；pXO1_70(757bp，AF065404第84298到85611)；pXO1_90(1250bp，AF065404第106772到108730)；pXO1_95(1076bp，AF065404第113430到114761)；pXO1_98(767bp，AF065404第118950到117718)；pX01_116(799bp，AF065404第143333到146110)(这里的位置是阅读框全长的位置，标示的长度为实际扩增的阅读框中的一部分序列，引物的位置见引物列表)；

而当以A16D1(pXO1^-/pXO2⁺)、pKORT/A16的基因组DNA为模板时，以pXO1上的9对特异引物都没有扩增出特异条带，这进一步确定了pXO1确实从炭疽杆菌A16中丢失了。

以A16D1(pXO1^-/pXO2⁺)基因组DNA为模板时，pXO2上的9对特异引物都能扩增出特异条带，pXO2_007(689bp，NC_007323第4731到3589)、pXO2_039(918bp，NC_007323第33625到32087)、pXO2_060(620bp，NC_007323第50376到48928)、pXO2_084(855bp，NC_007323第68439到69890)、pXO2_089(783bp，NC_007323第74581到73022)、pXO2_094(948bp，NC_007323第76444到77709)、pXO2_097(866bp，NC_007323第80259到78745)、pX02_107(645bp，NC_007323第89625到88591)、pXO2_111(625bp，NC_007323第93097到91328)(这里的位置是阅读框全长的位置，标示的长度为实际扩增的阅读框中的一部分序列，引物的位置见引物列表)；而当以A16R和pKORT/A16的基因组DNA为模板时，9对特异引物都没有扩增出特异条带，这进一步确定了pXO2确实从炭疽杆菌A16中丢失了。

结果显示炭疽杆菌野生株A16的两个毒力大质粒pXO1和pXO2已经被驱除，该菌株为pKORT/A16。

3)表型鉴定：

因为pXO1上有编码保护性抗原(PA)的基因，驱除了pXO1后的菌株一定不能产生PA，所以通过Western Blotting来检测PA的表达情况来进一步确认pXO1的丢失情况。

pKORT/A16在含0.9％碳酸氢钠的LB琼脂平板上划线，在37℃，15％CO₂条件下培养12h，从平板上刮去菌苔制成菌悬液，加上样缓冲液(配方参见科学出版社《分子克隆实验指南》第二版)沸水浴煮10min，离心，取上清，SDS-PAGE上样，电泳结束后将蛋白转印至PVDF膜上，做WB检测。一抗为PA抗体，二抗为IgG-HRP。医用胶片，显影液，定影液购自柯达公司。以A16(样品制备方法同上)和PA蛋白(大肠杆菌表达的PA蛋白，PA蛋白的genbank号为PID：2820165)为对照。抗体购自Santa Cruz公司，一抗PA抗体货号sc-52123，二抗羊抗小鼠IgG-HRP sc-2031。

结果如图6所示，从图中看出，显示A16的菌体蛋白能够与PA抗体产生特异的Western杂交带，而pKORT/A16的菌体蛋白与PA抗体没有特异的Western杂交带，这再次说明pXO1已经从A16中驱除。

因为pXO2上有编码炭疽杆菌芽孢荚膜的基因，驱除了pXO2后的菌株一定不能产生荚膜，所以通过墨汁负染在光镜下观察荚膜的形成情况，以进一步确认pXO2的丢失情况。荚膜培养条件为：含0.9％(质量百分含量)碳酸氢钠，5％(体积百分含量)马血清的LB培养基上划线接菌。37℃，15％二氧化碳下培养14小时。以A16为对照。

结果如图7所示，图A为野生株A16形成荚膜情况；图B为双质粒驱除株pKORT/A16荚膜形成情况，可以看出，A16的菌体能正常形成荚膜，而pKORT/A16的菌体不能形成荚膜，这再次说明pXO2已经从A16中驱除。

3、把不相容质粒pKORT从炭疽杆菌A16中驱除的过程

筛选：因为构建的外源质粒的骨架质粒pKSV7为温敏性质粒，在37℃-42℃下丢失，而37℃为炭疽杆菌的最佳生长温度，为了避免炭疽菌在过高的温度生长传代，所以选择在37℃丢外源重组质粒。挑取驱除pXO1和pXO2质粒的单克隆pKORT/A16接5mL无抗性LB液体培养基在37℃的摇床上培养10h，然后按1％转接到另一5mL无抗性LB液体培养中于37℃摇床上培养12h，反复按1％转接多次后，对菌液进行梯度稀释，取10-4、10-5两个稀释度的菌液，涂布无抗平板。次日，挑取平板上的单克隆进行点板，每一个单克隆分别点板于LB无抗板和含氯霉素(Cm浓度为5μg/mL)的LB琼脂平板，将点板后的平板置30℃培养箱中培养。次日，挑取在无抗性平板上生长而在Cm抗性琼脂平板上不生长的单克隆进行菌落PCR鉴定(pKSV7P3_F和pKSV7P3_R，pKSV7P6_F和pKSV7P6_R)和Cm抗性试管(5μg/mL)转接培养(30℃，225rpm摇床培养)，确定其在Cm抗性试管中不长，由此选出阳性克隆A。

对选出的阳性克隆A进行接种于无抗性试管培养，然后提取它的基因组，以基因组做模板，以pKSV7P3的特异引物为pKSV7P3_F和pKSV7P3_R，pKSV7P6_F和pKSV7P6_R(pKSV7P3和pKSV7P6为pKSV7载体的特异片段，进行PCR鉴定，以pKORT/A16为对照，结果如图8所示，其中，1为pKORT/A16，2为阳性克隆A，可以看出，2阳性克隆A中均未有片段扩增，而pKORT/A16分别得到843bppKSV7P3和535bppKSV7P6的片段。将PCR鉴定无片段的阳性克隆命名为A16QT。该菌株A16QT为pXO1和pXO2质粒都缺失同时又不含外源质粒的突变株。

表1为实验中使用的引物序列

Claims (10)

1.一种DNA分子，为如下(1)或(2)或(3)

(1)序列表中序列1所示的DNA分子；

(2)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能蛋白的DNA分子；

(3)与(1)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码具有相同功能蛋白的DNA分子。

2.含有权利要求1所述DNA分子的重组载体、转基因细胞系或重组菌。

3.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于：

所述重组载体为将权利要求1所述的DNA分子插入穿梭质粒的多克隆位点得到的载体。

4.根据权利要求2或3所述的重组载体，其特征在于：

所述穿梭质粒为温敏型穿梭质粒，

所述温敏型穿梭质粒具体为pKSV7。

5.权利要求2-4中任一所述重组载体在同时驱除炭疽杆菌毒力大质粒pXO1和pXO2中的应用。

6.一种同时驱除炭疽杆菌毒力大质粒pXO1和pXO2的方法，包括如下步骤：

将权利要求2-4中任一所述重组载体转入出发菌，得到重组菌；将所述重组菌传代培养，至所述重组菌中的炭疽杆菌毒力大质粒pXO1和pXO2被驱除，得到同时驱除炭疽杆菌毒力大质粒pXO1和pXO2的重组菌。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：

所述同时驱除炭疽杆菌毒力大质粒pXO1和pXO2的方法中，在将权利要求2-4中任一所述重组载体转入出发菌前，还包括将权利要求2-4中任一所述重组载体去甲基化的步骤，

所述去甲基化的方法包括如下步骤：

1)、将权利要求2-4中任一所述重组载体转入甲基化酶缺陷的大肠杆菌中，得到重组菌1；

2)、提取步骤1)得到的所述重组菌1的质粒，得到去甲基化的重组载体；

所述同时驱除炭疽杆菌毒力大质粒pXO1和pXO2的方法中，在所述传代培养后，还包括将所述同时驱除炭疽杆菌毒力大质粒pXO1和pXO2的重组菌去除权利要求2-4中任一所述重组载体的步骤，

将所述同时驱除炭疽杆菌毒力大质粒pXO1和pXO2的重组菌去除权利要求2-4中任一所述重组载体的方法包括如下步骤：

将所述同时驱除炭疽杆菌毒力大质粒pXO1和pXO2的重组菌分别接种在无所述重组载体抗性筛选标记物培养基和含所述重组载体抗性筛选标记物的培养基中培养，选取在无所述重组载体抗性筛选标记物培养基生长且在含所述重组载体抗性筛选标记物的培养基上不生长的菌，得到驱除炭疽杆菌毒力大质粒pXO1、pXO2和所述重组载体的重组菌。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：

所述出发菌为炭疽杆菌(Bacillus anthracis)；

所述甲基化酶缺陷的大肠杆菌为大肠杆菌SCS110；

所述抗性筛选标记物为氯霉素；

所述传代培养的温度为不高于30℃，所述传代培养的温度具体为30℃；

所述将同时驱除炭疽杆菌毒力大质粒pXO1和pXO2的重组菌去除权利要求2-4中任一所述重组载体的方法中，所述培养温度为37℃-42℃，所述培养温度具体为37℃。

9.由权利要求6-8中任一所述方法制备的驱除炭疽杆菌毒力大质粒pXO1和pXO2的重组菌和/或驱除炭疽杆菌毒力大质粒pXO1、pXO2和所述重组载体的重组菌。

10.权利要求1所述的DNA分子、权利要求2-4中任一所述重组载体、权利要求9所述的驱除炭疽杆菌毒力大质粒pXO1和pXO2的重组菌和/或驱除炭疽杆菌毒力大质粒pXO1、pXO2和所述重组载体的重组菌在制备疫苗中的应用；所述疫苗具体为炭疽疫苗；

一种炭疽疫苗，其活性成分为权利要求9所述的驱除炭疽杆菌毒力大质粒pXO1和pXO2的重组菌和/或驱除炭疽杆菌毒力大质粒pXO1、pXO2和所述重组载体的重组菌。

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