CN102732507A

CN102732507A - 一种改进的dna配基筛选方法

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Publication number: CN102732507A
Application number: CN2012102146263A
Authority: CN
Inventors: 张晓光; 闫晓; 詹少兵
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2012-06-26
Filing date: 2012-06-26
Publication date: 2012-10-17
Anticipated expiration: 2032-06-26
Also published as: CN102732507B

Abstract

本发明涉及一种改进的DNA配基筛选方法。本发明采用随机合成的DNA文库，通过随机文库与特定蛋白孵育、PCR扩增和测序筛选可以与特定蛋白相结合的单链DNA链。在扩增与特定蛋白有亲和活性的配基时，将结合有特定蛋白和配基的琼脂糖载体作为模板直接加入到PCR体系中，进行扩增。该方法省略了将DNA配基从载体上洗脱和纯化的过程，简化了操作步骤，提高了扩增成功率。该方法可以用于蛋白配基、多肽配基以及化学小分子配基的筛选。

Description

一种改进的DNA配基筛选方法

技术领域

本发明建立了一种改进的配基筛选方法。包括随机筛选配基文库的合成、蛋白分子与载体连接、文库与连接有蛋白或多肽或化学小分子的载体进行孵育反应、洗涤未结合的配基、直接将载体-分子-配基作为模板进行扩增、测序等步骤。本发明采用随机合成的DNA文库，通过随机文库与特定蛋白孵育、PCR扩增和测序等步骤筛选可以与特定蛋白相结合的单链DNA链。在扩增与特定蛋白有亲和活性的配基时，将结合有特定蛋白和配基的琼脂糖载体作为模板直接加入到PCR体系中，进行扩增。该方法省略了将DNA配基从载体上洗脱和纯化的过程，简化了操作步骤，提高了扩增成功率。该方法可以用于蛋白配基、多肽配基以及化学小分子配基的筛选。

背景技术

指数富集配体的系统进化(systematic evolution of ligands by exponentialenrichment,SELEX)是一项将文库技术(library)与筛选技术相结合的新技术，可以从构建的随机核酸文库中筛选出与靶分子特异结合的核酸配基。其基本原理就是利用分子生物学技术，构建人工合成的单链随机寡核苷酸文库，其中随机序列长度在40nt左右，文库容量在10¹⁴～10¹⁵之间。由于单链随机寡核苷酸片段特别是RNA短链易形成发卡、G-四聚体等多种二级结构，能与蛋白质、核酸、小肽、氨基酸等有机分子，甚至金属离子结合，形成具有很强结合力的复合物。将随机寡核苷酸文库与抗原或药物等靶分子相互作用，洗脱筛选出特异寡核苷酸配基（aptamer），经RT-PCR或PCR及体外转录生成新的次一级文库，再与该靶结合，反复多个循环，可筛选出能与该靶分子特异结合的寡核苷酸片段。

SELEX技术主要有以下优点：①靶分子范围广泛，包括肽、氨基酸、蛋白质（包括细胞膜蛋白）、金属离子、染料、药物小分子（如茶碱）、生长因子、类固醇、基因调节因子、细胞黏附因子、植物血凝素，甚至可以是完整的细胞、孢子等；②筛选到的配体具有高亲和力、高特异性，结合力可以与单抗和抗原之间的结合相媲美，其解离常数（Kd）多在pmol/L-nmol/L级，能够分辨出靶分子结构上细微的差别，甚至可以区分1个甲基或1个羟基的差别；③适体无免疫原性，无毒性，稳定性好，可长期保存，能在常温下运输，容易再生，组织穿透力强，可用于细胞内诊断和治疗；④适体易于添加报告基团，可以在合成时精确、定点连接其他功能基团和分子，如巯基、氨基、萤光素、生物素、酶等；⑤不依靠动物，筛选周期短，一般一个SELEX需要8～15个循环，约2～3个月时间，目前其筛选过程已经可以自动化，大大加快了筛选速度，而制备单克隆抗体，即使很顺利也需要3～6个月；⑥化学合成的适体精确度高，重复性强，生产中很少存在批次间的差异。目前，已经有适体作为药物进入临床试验阶段。2002年，抗血管内皮生长因子（VEGF）适体EYE001用于治疗老年性视网膜退化性变（AMD），率先进入第一阶段的临床试验。3个月后，15名接受适体治疗的患者中有80％视力稳定或得到改善，结果证实该适体的安全性较好；第二阶段临床试验显示，21名患者在接受抗VEGF适体玻璃体注射治疗3个月后，有87.5％视力稳定或得到改善且没有不良反应。2004年12月美国食品与药品管理署（FDA）正式批准第一种适体药物Macugen上市，用于AMD的治疗。SELEX技术自1990年问世以来，在基础研究、药物开发、临床治疗中的应用不断增多。

发明内容

本发明克服了SELEX技术操作步骤多，建立了一种简化的配基筛选技术。其工作原理为：在连接了蛋白或者多肽或者化学小分子等目标分子的载体与配基结合后，通过洗涤，去除非特异性结合的配基，然后将结合有目标分子和配基的载体直接加入到PCR反应体系中进行扩增，反复重复配基筛选和扩增过程，富集与目标分子可以特异性结合的DNA配基，最后通过测序得到DNA配基序列。

本发明所采用的方法是：

将目标蛋白与载体连接；

合成并扩增两端有特定引物序列的随机DNA文库；

将扩增的DNA文库与完成蛋白连接的载体进行反应；

通过洗涤步骤去除未结合的DNA，完成筛选步骤；

将连接有蛋白和配基的载体作为模板进行PCR扩增反应；

重复筛选步骤和扩增步骤；

将扩增得到的序列连接克隆载体后进行测序，得到与目标蛋白有结合活性的DNA配基。

该检测方法与其他检测方法相比具有如下优点：

操作简单。本方法操作程序与传统SELEX技术相比，减少了从载体上将配基洗脱和纯化的步骤，提高了筛选效率。

成功率高。由于与目标分子结合的DNA配基数量极少，因此在洗脱后纯化中得到的配基数量低于PCR扩增的下限，造成试验失败；本方法将全部与目标分子结合的配基作为模板进行扩增，显著提高了筛选成功率。

附图说明

图1配基扩增电泳图Selex配基筛选结果1:3：1-3轮配基筛选结果4：阴性对照5：25bpDNA ladder

图2特异性寡核苷酸配基测序结果

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于一下实施例。

下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中，所述百分含量如无特殊说明，均为质量百分含量。

实施例中使用的各种单位，统一采用国家标准。

实施例1：HIV-1p24特异性DNA配基筛选

1.P24蛋白与PharmaLink（购自pirerce公司）蛋白柱偶联。

使用活化的微珠状琼脂糖及稳定的偶联化合物将蛋白及其他配基通过其上的伯胺（-NH2）固定在树脂上。偶联反应是首先在醛基（介质上的）和氨基（配基上的）之间自发的形成希夫碱键，随后在温和还原剂氰硼氢化钠中进行孵育稳定。其他蛋白也可参考该试剂盒说明书进行偶联，或采用分子生物学其他常规偶联方案。具体步骤如下：

考虑到P24蛋白的耐受力，选择PBS(PH7.2)作为缓冲液，所有的离心条件均为1000g，1min。

（1）树脂柱上下颠倒，避免空气进入柱中，移除上下盖，柱子离心，去除保持缓冲液（树脂柱买来时就泡在缓冲液中）。

（2）加入2ml PBS(PH7.2)，coupling buffer，离心，重复2次。

（3）加底盖，向柱中加入3mL P24蛋白。

（4）留取0.5ml蛋白样测定结合效率。

（5）通风橱中加入40μL氰硼氢化钠溶液（试剂盒提供）。

（6）加上盖，室温震荡4小时。

（7）去除上下盖，置于新的离心管中，离心，收集管中未结合的蛋白。

（8）测定原始蛋白和未结合蛋白的浓度。

（9）小心移除顶盖（在反应过程中会产生一些气体压力）。

（10）移除下盖，将柱放入新的管中，离心，去除coupling buffer。

（11）用2mL Quenching Buffer(淬灭缓冲液)洗柱，重复一次。

（12）测得浓度为0.149(A260),0.029(A280)。

（13）加下盖，在通风橱中，在柱子中加入2mlQuenching Buffer和40μL氰硼氢化钠的混合液（试剂盒提供）。

（14）加上盖，上下颠倒，轻柔混匀30min。

（15）小心移除顶盖（反应中会有一些气体产生）。

（16）移除底盖，将柱子置于新的管子中，离心，去除Quenching Buffer。

（17）用2mL的洗涤液洗涤反应物以及未偶联的蛋白，离心，重复4次。

（18）加入2mL的Storage Buffer平衡柱，离心，重复2次。

（19）加底盖，从树脂柱子上方加入2mL的Storage Buffer。

加上盖，4℃保存。

2.合成并扩增随机DNA文库（在针对不同的蛋白时，该步骤所采用的引物和具体步骤都相同。）

（1）合成DNA配基文库，序列如下：

5’-ATCCGTCACACCTGCTCT-N₃₆-TGGTGTTGCTCCCGTAT-3’(N=A,T,C,G)

（2）PCR扩增文库（Taq酶及扩增试剂购自大连宝生物公司）

反应体系如下：10×Buffer 2.5μL，dNTPs 4μL，primer F（ATCCGTCACACCTGCTCT）0.75μL（0.3μM），primer R（ATACGGGAGCAACACCA）0.75μL（0.3μM）,TaqHS DNA聚合酶0.5μL，MgCl₂（25mM）4μL,加入5μL（1）中合成DNA配基文库，加灭菌的双蒸水至25μL,设置阴性对照。

反应条件：94℃预变性3min，循环参数94℃/1min，53℃/1min，72℃/1min，25个循环；72℃延伸10min；4℃保存。

3.Selex第一轮筛选（在针对不同的蛋白时，具体步骤相同。）

（3）将水浴锅预调到95℃。

（4）将56nmol的步骤2中构建的随机DNA文库和1mL BB buffer（0.5M Nacl,10mM TrisHcl,1mM mgcl₂）的混合液在95℃加热5min，使DNA全部解为单链。

（5）用2mL的BB buffer平衡步骤1中的蛋白柱，洗涤3次，1000g离心1min。

（6）向平衡好的蛋白柱中加入步骤（4）中的单链模板，37℃孵育2h。

（7）用2mL BB buffer清洗3次。

4.PCR扩增DNA配基（Taq酶及扩增试剂购自大连宝生物公司）（在针对不同的蛋白时，该步骤所采用的引物和具体步骤都相同。）

PCR扩增反应体系（25μL）：10×Buffer 2.5μL，dNTPs 4μL，primer F 0.75μL（ATCCGTCACACCTGCTCT）（0.3μM），primer R（ATACGGGAGCAACACCA）0.75μL（0.3μM）,Taq HS DNA聚合酶0.5μL，25mM MgCl₂4μL,加入5μL步骤3中连接有P24蛋白和DNA配基的琼脂糖珠作为模板，加灭菌的双蒸水至25μL,设置一个阴性对照。

反应条件：94℃预变性3min，循环参数94℃/1min，53℃/1min，72℃/1min，25个循环；72℃延伸10min；4℃保存。将扩增产物作为下一轮筛选的文库。

5.重复步骤3和步骤48-15次，将DNA文库进行进一步筛选和富集。

6.PCR扩增产物连接到T载体并测序（在针对不同的蛋白时，该步骤所采用的引物和具体步骤都相同。）

以Selex技术筛选到的单链核酸产物为模板进行PCR扩增。

反应条件：94℃预变性3min，循环参数94℃/1min，53℃/1min，

72℃/1min，1个循环；72℃延伸10min；4℃保存。

PCR扩增反应体系（25μL）（试剂盒购自大连宝生物公司）：Taq Buffer 8μL，dNTPs4μL，primer F（ATCCGTCACACCTGCTCT）0.75μL，primer R（ATACGGGAGCAACACCA）0.75μL,Taq HS DNA聚合酶0.5μL，加入5μL步骤5中连接有P24蛋白和DNA配基的琼脂糖珠作为模板，加灭菌的双蒸水至25μL。

将T载体（pMD18-T，购自大连宝生物公司）放在在冰上融化，然后将装有载体的离心管瞬时离心，使黏在管壁的液体沉于底部。连接反应体系为20μl：PCR扩增目的基因片段9μl，BufferI 10μl，T-vector 1μl。将该连接体系置16℃连接2h。反应结束后，将离心管置于冰上用于转化。

将感受态细胞Ecoli DH5α放在冰上解冻几分钟，取50μL于一新EP管中，向感受态细胞中加入1μL连接产物，轻轻地快速混匀，冰水浴30min，然后快速的再于42℃循环水中热击90s（此过程中不要摇动管）；快速将管移动到冰水浴中冷却2min；加入200μL无抗LB液体培养基，于摇床上37℃摇1h（转速225rpm）；取50μL用涂板，37℃倒置培养12-16h。

挑选分隔良好的克隆委托测序公司进行测序，然后将测序结果进行比对分析。测序结果见图2。

Claims

1.一种配基筛选方法，其特征是用结合有特定蛋白、多肽或化学分子的载体及与这些蛋白、多肽或化学分子可以特异性结合的配基作为模板进行配基扩增。

2.权利要求1所述的配基筛选方法，所述与载体结合的特定蛋白分子为HIV-1p24。

3.权利要求1或2所述的配基筛选方法，其中载体与特定蛋白、多肽或化学分子以化学键偶联，或以静电吸附或疏水聚集等非化学键偶联，或是通过生物素亲和素等桥联方式连接。

4.权利要求1-3所述的配基筛选方法，所述载体是琼脂糖珠，磁珠。

5.权利要求1-4所述的配基筛选方法用于检测与之有亲和力的蛋白、多肽或化学分子。

6.权利要求1-4所述的配基筛选方法用于识别或阻断与之有亲和力的蛋白、多肽或化学分子的生物活性。