CN102731619A - 特异性靶向人类胚胎干细胞的肽段 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种特异性靶向人类胚胎干细胞的肽段。该肽段，其氨基酸残基序列为序列表中序列1所示的氨基酸残基序列。本发明的特异性靶向人类胚胎干细胞的肽段可用于制备人类胚胎干细胞的识别和/或标记和/或分选和/或靶向的产品。

Description

特异性靶向人类胚胎干细胞的肽段

技术领域

本发明涉及一种特异性靶向人类胚胎干细胞的肽段。

背景技术

胚胎干细胞（embryonic stem cell，ES）是研究胚胎早期发生、细胞增殖与分化及基因表达调控等发育生物学基础研究的良好细胞模型系统，是细胞治疗和组织工程的理想来源（Wobus AM，Boheler KR.Embryonic stem cells:prospects for developmentalbiology and cell therapy.Physiol Rev.2005，85:635-678；Vats A，Bielby RC，TolleyNS，Nerem R，Polak JM.Stem cells.Lancet.2005，366:592-602.），并可用于药物筛选（Pouton CW，Haynes JM.Embryonic stem cells as a source of models for drugdiscovery.Nat Rev Drug Discov.2007，6:605-616）。近年来一直是生物学研究的热点。

ES细胞的高度自我更新能力和分化全能性是它区别于其它细胞的重要特征。目前对Oct4、Nanog、Sox2等胞核内转录因子的大量研究揭示这些ES细胞特异性标志分子对维持ES细胞的自我更新和分化的全能性发挥着重要的作用（Nichols J，Zevnik B，Anastassiadis K，et al.Formation of pluripotent stem cells in the mammalian embryodepends on the POU transcription factor Oct4.Cell.1998，95(3):379-391；Avilion AA，Nicolis SK，Pevny LH，et al.Multipotent cell lineages in early mouse developmentdepend on SOX2 function.Genes Dev.2003，17(1):126-140）。ES细胞膜表面蛋白质则主要包括信号通路受体、黏附分子、转运蛋白和蛋白水解酶类（Nunomura K et al.CellSurface Labeling and Mass Spectrometry Reveal Diversity of Cell Surface Markers andSignaling Molecules Expressed in Undifferentiated Mouse Embryonic Stem Cells.Mol CellProteomics.2005，4:1968-1976.），LIF、TGFb、BMP、FGF-PI3K信号通路对ES细胞的自我更新起到重要作用（Rebecca Stewart，Miodrag Stojkovic and Majlinda Lako.Mechanisms of self-renewal in human embryonic stem cells.Eur J Cancer.2006，42:1257-1272）。这些研究斗表明ES细胞表面特异性标志分子可通过介导外源信号来调节ES细胞的增殖和分化行为。由于目前发现的ES细胞标志分子数量有限，而且与其他的成体干细胞或肿瘤细胞有共同的表达，因此更多更特异的ES细胞标志分子仍有待发现。采用有效的手段发现特异性的、新的细胞表面标志物对于研究干细胞保持自我更新和分化的信号通路、实现细胞增殖、定向诱导分化具有重要意义，并将有助于ES细胞的鉴定、分离纯化、质量控制，加快ES的基础研究和临床应用。

目前国际上对ES细胞表面特异性标志分子的研究现主要采用蛋白质组学技术进行（Adewumi，O.，et al.Characterization of human embryonic stem cell lines by theInternational Stem Cell Initiative.N at Biotechnol.2007.25(7):803-816；Dai，B.and T.P.Rasmussen.Global epiproteomic signatures distinguish embryonic stem cells fromdifferentiated cells.Stem Cells，2007.25(10):2567-2574；Shin，S.，et al.Wholegenome analysis of human neural stem cells derived from embryonic stem cells and stemand progenitor cells isolated from fetal tissue.Stem Cells.2007.25(5):1298-1306；3.Wang，D.and L.Gao.Proteomic analysis of neural differentiation of mouse embryonic stem cells.Proteomics.2005.5(17):4414-4426.）。由于ES细胞膜表面标志分子丰度低，其细胞免疫原性差，难于采用传统的单克隆抗体技术来获得特异抗体。蛋白组学采用二维电泳结合质谱技术虽可高通量筛选ES细胞标志分子，但其结果还需要进一步验证，其方法本身也较为费时费力和价格昂贵。2007年国际干细胞研究所对全球17个实验室的59株人ES细胞的基因表达研究表明这些细胞株之间存在差异（Adewumi，O.，et al.Characterization of human embryonic stem cell lines by the International Stem CellInitiative.Nat Biotechnol.2007.25(7):803-816），很多研究均表明ES细胞具有群体异质性，不同的培养条件会有不同的特异性标志分子的异质表达，加之ES细胞膜蛋白的提取相对困难，丰度低及疏水性使得不易用质谱分析这些蛋白；这些因素使得目前发现的ES细胞表面标志分子数量及其功能研究较为有限。

噬菌体展示技术是一项简单、成熟的，能够将所需性质的多肽从具有大量变异体的集落中提取出来的高效筛选技术。自从Smith首次阐述该方法以来（Smith，G.P.Filamentous fusion phage:novel expression vectors that display clonedantigens on the virion surface.Science.1985.228(4705):1315-1317.），噬菌体展示技术已经发展成为了一种发现新特性多肽以及改变已有多肽性质的强大工具（15.Barry，M.A.，W.J.Dower，and S.A.Johnston.Toward cell-targeting gene therapyvectors:Selection of cell-binding peptides from random peptide-presenting phage libraries.Nature Medicine.1996.2(3):299-305；16.Paschke，M.Phage display systems and theirapplications.Applied Microbiology and Biotechnology.2006.70(1):2-11；17.Petty，N.K.，et al.Biotechnological exploitation of bacteriophage research.Trends in Biotechnology.2007.25(1):7-15.）。传统的筛选方法多采用纯化抗原或重组抗原进行固相筛选，而筛选未知分子却是许多研究工作所需要的，因此近年来使用噬菌体展示技术直接对细胞进行筛选发展非常迅速。采用细胞筛选不需要预先知道细胞表面相关分子信息，直接用细胞进行筛选可保留其膜表面分子的原初信息，并更为真实地模拟配体和受体间的结合状态。但由于细胞膜表面成分及其复杂，而所需要筛选的膜表面抗原往往又丰度低、免疫原性差，容易导致噬菌体的非特异结合，使得用细胞进行筛选难度较大。近年来发展的扣除筛选法，即用阴性细胞先行进行筛选，以去除非特异结合的噬菌体，再用阳性细胞进行多轮富集筛选即可较好地解决这类问题。

在噬菌体展示技术用于筛选干细胞表面特异性标志分子方面，已经有报道将噬菌体展示技术应用到对单一的成体干细胞进行筛选，获得了许多特异性的，功能性的多肽（Nowakowski，G.S.，et al.A specific heptapeptide from a phage display peptide libraryhomes to bone marrow and binds to primitive hematopoietic stem cells.Stem Cells.2004.22(6):1030-1038；19.Letchford，J.，et al.Isolation of C 15:A novel antibody generatedagainst mesenchymal stem cell-enriched adult human marrow.Journal of ImmunologicalMethods.2006.308(1-2):124-137；20.Morita，Y.，et al.Selection and properties for therecognition of P19 embryonic carcinoma stem cells.Biotechnology Progress.2006.22(4):974-978），但将噬菌体库筛选技术应用到人类胚胎干细胞以及胚胎干细胞分化的研究中尚未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种特异性靶向人类胚胎干细胞的肽段。

本发明所提供的特异性靶向人类胚胎干细胞的肽段，其氨基酸残基序列为序列表中序列1所示的氨基酸残基序列。

上述特异性靶向人类胚胎干细胞的肽段的编码核苷酸片段。

所述编码核苷酸片段的序列为序列表中序列2所示的核苷酸序列。

本发明通过对噬菌体库的筛选，获得携带特异性靶向胚胎干细胞的肽段的噬菌体，实验证明，该肽段可以与胚胎干细胞特异性结合，本发明的肽段或其编码基因以及特异性靶向人类胚胎干细胞的量子点与噬菌体的复合物可以用于制备人类胚胎干细胞的识别，标记，和分选和药物靶向的产品。

附图说明

图1为特异性靶向人类胚胎干细胞的氨基酸肽段的筛选流程图

图2为人类胚胎干细胞的培养及AP（碱性磷酸酶）鉴定

图3为本发明肽段的特异性结合ELISA检测结果。

图4为本发明肽段的特异性结合免疫荧光检测检测结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的试验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1、特异性靶向人类胚胎干细胞的氨基酸序列的筛选

特异性靶向人类胚胎干细胞的氨基酸肽段的筛选流程图如图1所示，为了除去非特异性的多肽,本实验采用了减数杂交筛选法,即用自由分化的人类胚胎干细胞作为负筛材料,除去那些非特异性的噬菌体多肽,然后再用未分化的胚胎干细胞作为正筛材料,得到能与其特异性结合的多肽。具体步骤如下所述：

1、细胞的培养和准备

正向筛选细胞悬浮液的制备：人类胚胎干细胞系X-01公众可以以合法的方式从中国科学院干细胞库(Stem Cell Bank,Chinese Academy of Sciences)申请获得）培养于P3辐照处理过的小鼠成纤维细胞(PMEFsCF-1)（上海斯丹赛生物技术有限公司，货号0303-200）上。培养用培养基为含体积百分含量为79% DMEM(Hyclone,Logan,新西兰),体积百分含量为1%非必需氨基酸(nonessential amino acid，Gibco BRL,USA美国),1mM L-谷氨酰胺(Gibco BRL，美国),4ng/L bFGF(Invitrogen,广州)，0.1mMb-mercaptoethanol(Amresco,Solon,Ohio美国),和体积百分含量为20%血清替代物(KSR)(Gibco BRL，美国)，培养时间为14天（复苏后第一代），传代后培养8天。在使用噬菌体展示肽库筛选之前，胚胎干细胞用0.5mg/ml的胰蛋白酶迅速消化，用磷酸缓冲液（PBS，pH7.4）洗两次，然后悬浮于封闭液中(含终质量百分含量为3%FBS于pH7.4的PBS中)，得到的细胞悬浮液用于做正向筛选。AP（碱性磷酸酶）检测采用Alkaline Phosphatase Detection Kit(milipore,German德国)。AP（碱性磷酸酶）检测的结果如图2所示，两个孔均为胚胎干细胞克隆，红色的显示结果表明胚胎干细胞AP结果为阳性，干细胞生长状况正常，图2中，ES为复苏后第7天的胚胎干细胞，平铺细胞为滋养层CF-1细胞，聚团克隆为胚胎干细胞，由形态学可以看出，胚胎干细胞克隆紧凑生长，有清晰的边缘，生长情况正常。dES为分化后的人类胚胎干细胞，细胞为铺散状态，失去清晰边缘。

负向筛选细胞悬浮液的制备：

负向筛选使用自有分化的胚胎干细胞X-01和P3辐照处理过的小鼠成纤维细胞PMEFsCF-1。这两种细胞悬浮液的制备方法如下所述：

自有分化的胚胎干细胞：将上述培养胚胎干细胞X-01形成克隆的核心挑除，留存周围胚胎干细胞，用胎牛血清培养基（培养基成分为由体积百分含量为10％胎牛血清（Gibco BRL，美国）和体积百分含量为90%DMEM(Hyclone,Logan,新西兰)组成的培养基），连续培养20天直至细胞失去胚胎干细胞特征，用于做负向筛选的分化后胚胎干细胞，将分化后胚胎干细胞也用0.5mg/ml的胰蛋白酶迅速消化并悬浮于封闭液中。

小鼠成纤维细胞(PMEFsCF-1)用用胎牛血清培养基（培养基成分为由体积百分含量为10％胎牛血清（Gibco BRL，美国）和体积百分含量为90%DMEM(Hyclone,Logan,新西兰)组成的培养基）培养后，用0.5mg/ml的胰蛋白酶迅速消化并悬浮于封闭液中。

2、噬菌体肽库筛选

本实施例所用的噬菌体库是Ph.D.-12噬菌体展示肽库试剂盒中的Ph.D.-12噬菌体展示肽库，该试剂盒购自NEW ENGLAND BIO-LABS,美国，该试剂盒中Ph.D.-12噬菌体展示肽库使用的噬菌体载体为M13单链噬菌体，肽库表达的随机肽均在噬菌体次要包膜蛋白pIII的N端。M13噬菌体是丝状噬菌体，是一种温和型噬菌体，不裂解宿主菌，成熟的噬菌体可分泌到培养基中，通过离心收集培养上清，再向其中加入沉淀剂即可将上清中大量噬菌体粒子沉淀下来，从而富集得到含外源基因产物的重组噬菌体。

采用负筛/正筛的方法来进行筛选，具体包括下述步骤：

1）负筛：接近1.56×10¹¹的噬菌体（Ph.D.-12噬菌体肽库，NEW ENGLANDBIO-LABS,美国）被加入到1ml的悬浮的上述用作负向筛选的分化人类胚胎干细胞悬浮液中，在室温中轻微晃动1小时，3000rpm离心3分钟。上清液中含有没有结合分化细胞的噬菌体，将上清液转入小鼠成纤维细胞（上述P3辐照处理过的小鼠成纤维细胞PMEFsCF-1）悬浮液中，室温轻微晃动1小时，3000rpm离心3分钟，收集上清液。

2）正筛：将步骤1）获得的上清转入步骤1制备的人类胚胎干细胞系X-01悬浮液中，室温轻微晃动1.5小时，弃上清，所获细胞与噬菌体的混合物用洗脱液1(含终质量百分浓度为3%的BSA和终质量百分浓度为0.1%的Tween-20的pH7.4的PBS)洗5次。接下来用1.6ml洗脱液2(含0.1M glycine-HCl，终质量百分浓度为0.1%的BSA，pH 2.2的溶液)洗脱与细胞结合的噬菌体，然后加入0.3ml中和液（pH 9.1，1M Tris-HCl溶液），目标噬菌体即在液体中。

3）将上述所获噬菌体于宿主细菌大肠杆菌ER2738(Ph.D.-12噬菌体展示肽库试剂盒中提供)中扩增后并进行滴定计数。通过2轮与上述步骤1）和步骤2）同样的筛选，计算每一轮的噬菌体得率。

噬菌体得率（Phage yield rate）=筛选后噬菌体量/加入噬菌体量

表1.两轮筛选后噬菌体的得率

3、噬菌体克隆的挑选和测序

上述二轮筛选后，将10μl得到的噬菌体感染200μl于LB培养基中生长至对数生长期初期的E.coli ER2738宿主菌5分钟，然后将该混合物加入到约50°C的顶层琼脂中，混匀后铺到LB/IPTG/X-gal平板(LB培养基，15g/L琼脂，灭菌后温度低于70摄氏度时加入1ml IPTG/X-gal，Ph.D.-12噬菌体展示肽库试剂盒提供)上，于37°C过夜培养。挑选单个噬菌斑扩增后获得含有肽段的噬菌体单克隆。使用PEG/NaCl溶液（含终质量百分浓度为20% polyethylene glycol-8000和2.5M NaCl的溶液)。使用DNA抽提液（含10Mm Tris-HCL(PH 8.0)，1Mm EDTA和4M NaI的溶液)抽提噬菌体DNA后测序。测序表明，其中一个噬菌体单克隆展示的肽段的序列为序列表中序列1，其编码序列为序列表中序列2。

4、全细胞ELISA检测

于96孔细胞培养板（Falcon,美国）中培养上述X-01细胞（X-01）,x-01分化细胞（x-01分化）及P3辐照处理过的小鼠成纤维细胞(PMEFsCF-1)（CF-1）至70％铺满，培养基与步骤1中所述的培养基相同，每孔加入100μl多聚甲醛溶液（质量百分浓度为4％），室温（25°C）固定细胞15分钟。PBS溶液（pH7.4）洗板三次，向每孔中加入200μl封闭液（1%BSA-PBS-T，含终浓度为1%的BSA和终浓度为0.1%的Tween-20的pH7.4的PBS），于37°C封闭2小时。PBS溶液洗板三次，每孔中加入100μl用封闭液稀释的序列1所示的肽段（广州百奥泰公司合成，尾端（非作用末端）添加His标签，终浓度为1000nmol），于室温下孵育90分钟。使用PBS-T溶液（含终浓度为0.1%的Tween-20的pH7.4的PBS）洗板三次，再用PBS溶液洗板三次。加入100μl封闭液1:1000稀释的辣根过氧化物酶标记的鼠抗His抗体（Invitrogen，广州），于室温下孵育90分钟。使用PBS溶液（pH7.4）洗板三次后，再于每孔中加入100μl ELISA底物显色液（ELISA试剂盒提供，ELISA试剂盒购自碧云天生物技术研究所），并于暗处显色15分钟后用2mol/L的硫酸溶液终止。使用酶标仪在492nm波长下读溶液吸光度值，并用405nm波长的吸光度值作为背景值。结果如图3所示，VPA多肽（序列1所示）针对人类胚胎干细胞x-01具有较高的亲和力，而与分化细胞以及滋养层细胞（CF-1）的亲和力较低。试验结果表明VPA多肽（序列1所示）具有与人类胚胎干细胞x-01结合的特异性。

5、免疫荧光检测

24孔板(falcon,美国)培养人类胚胎干细胞x-01培养到60％铺满，弃培养上清,用PBS溶液（pH7.4）洗细胞一次。多聚甲醛溶液（质量百分浓度为4%）固定细胞10分钟,200μl/孔。吸去固定液,用PBS溶液洗细胞3次。加入封闭液1%BSA-PBS-T,于37℃下封闭2小时。PBS-T溶液洗三次。每孔加入200μl以封闭液（含终浓度为1%的BSA和终浓度为0.1%的Tween-20的pH7.4的PBS）为稀释液的序列1所示的肽段（广州百奥泰公司合成，尾端（非作用末端）添加His标签，终浓度为1μmol/L）），室温（25℃）下孵育90分钟。孵育完成后,使用PBS-T溶液（含终浓度为0.1%的Tween-20的pH7.4的PBS）洗板三次,再用PBS溶液洗板三次。于每孔加入200μl封闭液1:1000稀释的辣根过氧化物酶标记的鼠抗His抗体(Anti-his antibody，mouse,（Invitrogen，广州）,于室温（25℃）下孵育90分钟。PBS-T溶液（含终浓度为0.1%的Tween-20的pH7.4的PBS）洗板三次,再用PBS溶液洗板三次。于每孔加入200μl使用封闭液1:200稀释的异硫氰酸荧光素(FITC)兔抗鼠IgG抗体（Sigma,美国）请提供该荧光素标记抗体的出售公司名称和货号),于暗处37℃下反应1小时。细胞核用hochest33258（Sigma,美国）复染，结果如图4所示。图中含有VPA多肽序列的噬菌体与细胞反应，在细胞膜上显示为阳性绿色的小点，而作为对照（control）的随机多肽（序列为SLHSQPRSWTAY）未表现出特异性的阳性。试验结果进一步表明VPA多肽序列具有与胚胎干细胞表面分子具有结合作用。

Claims (4)

1.一种特异性靶向人类胚胎干细胞的肽段，其氨基酸残基序列为序列表中序列1所示的氨基酸残基序列。

2.权利要求1所述特异性靶向人类胚胎干细胞的肽段的编码核苷酸片段。

3.根据权利要求2所述的编码序列，其特征在于：所述编码核苷酸片段的序列为序列表中序列2所示的核苷酸序列。

4.权利要求1所述的肽段或其编码基因在制备用于人类胚胎干细胞的识别和/或标记和/或分选和/或药物靶向的产品中的应用。

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