CN102725419B

CN102725419B - 用于表观遗传分析的设备和方法

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Publication number: CN102725419B
Application number: CN201080039585.8A
Authority: CN
Inventors: H·G·克雷格黑德; B·R·西普里亚尼; S·利维; P·索洛韦
Original assignee: Cornell University
Current assignee: Cornell University
Priority date: 2009-08-06
Filing date: 2010-08-06
Publication date: 2016-08-03
Anticipated expiration: 2030-08-06
Also published as: WO2011017677A2; US9605298B2; WO2011017681A2; US20120245047A1; CN102725419A; EP2462245A2; US20140322710A1; CN102612652B; EP2462442A4; WO2011017681A3; US20120244532A1; US20170073741A1; EP2462245B1; US9447451B2; EP2462442A2; EP2462245A4; WO2011017677A3; CN102612652A; US9988667B2; US8735065B2

Abstract

本文提供了用于单一物体探测的方法和设备。所述方法和设备可以用于确定遗传物质上的多种表观遗传标记物，或包含其片段的染色质。基于对遗传物质的一种或多种特性的探测，本发明提供了以流体的连续主体形式流过通道的遗传物质的表征。本文提供的方法和系统允许宽基因组的、高处理量的表观遗传分析并克服了全分析技术所共有的各种限制。

Description

用于表观遗传分析的设备和方法

交叉引用

本申请要求2009年8月6日提交的第61/231,979号美国临时申请、2010年2月24日提交的第61/307,827号美国临时申请、2009年8月6日提交的第61/231,963号美国临时申请和2010年6月28日提交的第61/359,266号美国临时申请以及同此一起提交的在律师客户档案号32497-715.601之下的共同未决的案例的优先权利益，其中每个申请为了所有目的通过引用以其整体并入本文。

关于联邦资助的研究的声明

在国家健康研究所的合同号R01DA025722和国家科学基金会(NBTC)的合同号ECS-9876771下以美国政府的支持来进行本发明。

发明背景

位于真核细胞的核中的染色质是DNA与组蛋白的络合物，组蛋白包括H1、H2A、H2B、H3和H4。组蛋白以核小体的形式被组装到DNA上(Luger等人(1997)Nature，389，251-260)。DNA序列携带遗传密码并控制特性的遗传。然而，对特异性DNA序列和它们的相关的组蛋白的可逆共价修饰可以影响相关的DNA如何被利用且因此还可以控制特性(Jenuwein和Allis(2001)Science，293，1074-1080；Klose和Bird(2006)TrendsInBiochemicalSciences，31，89-97)。这些已经被称为表观遗传修饰。对哺乳动物中的DNA的最普通的表观遗传修饰是DNA的甲基化和羟甲基化，它们中每一个可以被放在胞嘧啶嘧啶环的第五个碳上。包括甲基化、乙酰化、核糖基化、磷酸化、Sumo化(涉及小的泛素样改性剂)、泛素化和瓜氨酸化的许多修饰可以在核小体内的四种芯组蛋白的多于30个氨基酸残基处发生。对哺乳动物基因组的表观遗传修饰包括DNA中的胞嘧啶的甲基化；结合至DNA的组蛋白的甲基化、乙酰化、核糖基化、磷酸化、Sumo化和泛素化；和包含核小体的组蛋白在DNA上方的精确定位。

对基因组的表观遗传改变可以如基因组的诱变一样深深地影响发展和健康。最生动的实例之一是p16肿瘤抑制剂的启动子中的DNA的甲基化。这样的甲基化使基因沉默，并同样使基因序列本身的突变沉默，且两个事件促进了结直肠癌的发展和进展。然而，与突变不同，p16的表观遗传沉默在药理学上可以逆转，并因此提供了医疗介入的可能性。

全基因组中发生的表观遗传状态的特异性变化似乎在发展期间调节细胞分化(Mikkelsen等人(2007)Nature，448，553-U552)。成熟组织中的正常表观遗传状态的混乱促进癌症和其他疾病的引发和进展(Feinberg，A.P.(2007)Nature，447，433-440)。另外，研究已经表明，表观遗传状态受环境变量影响，环境变量包括饮食(Waterland和Jirtle(2003)MolecularAndCellularBiology，23，5293-5300)、环境毒素(Anway等人(2005)Science，308，1466-1469)和母性行为(Weaver等人(2004)NatureNeuroscience，7，847-854)。已知表观遗传机理在正常发展的环境响应中起到的基本作用和它们的混乱如何影响疾病状态，越来越多努力致力于表征人类基因组(Bernstein等人(2007)Cell，128，669-681)。

这些表观遗传修饰并不改变主要的DNA序列，但它们对在DNA序列下面的那些如何被表达具有强大影响。因此，表观遗传状态的变化可以如DNA序列的改变一样强烈地改变表型。还如DNA序列状态一样，表观遗传状态可以在有丝分裂期间从母细胞传到子细胞，且可以甚至通过减数分裂持续被从一代传到下一代。虽然表观遗传标记可以变化和比DNA序列的变化更容易地回复至它们的初始状态，但它们如它们所位于的DNA序列的性质一样对发展和疾病很重要。

大量证据已经证明表观遗传调节对于人类疾病——尤其是癌症的重要性。将DNA甲基化的混乱与人类结直肠癌的发展联系起来的早期观察以及随后的研究表明，DNA甲基化状态的实验操纵，药理学上或遗传性上改变肿瘤发展。这些已经推动了使肿瘤样本的表观遗传特征与提供样本的个体的疾病状态和临床结果相关联的研究。重要的是，使用修改表观遗传状态的药物的正在进行的临床试验已经表明治疗希望和减少表示差的预后的表观遗传生物标记物的能力。虽然DNA甲基化的变化在癌症发展和进展期间已经引起相当多的注意，但DNA甲基化状态还受组蛋白修饰状态和核小体定位的改变影响。在所有这些表观遗传标记中，可逆的相互作用全部可能对癌症发展和进展具有重要性。

除了控制对癌症很重要的过程之外，表观遗传状态影响哺乳动物对它们的环境变化的响应。已经表明母性行为在哺育、暴露于内分泌干扰物和饮食营养组合物期间各自引出与表观遗传状态的特异性变化有关的特异性表型。最重要地，这些表型和伴随的表观遗传改变，可以从父代传到后代，即使仅父代经历环境危害而后代没有经历环境危害。这提高了在家族中获得的一些复杂特性比如肥胖症、癌症或行为模式通过表观遗传方式遗传和由在前一代期间经历的环境暴露导致的可能性。

生物学中的一个普通主题是影响疾病状态比如癌症的机理，或对环境的内环境稳定性响应也对发展很重要。已经表明表观遗传机理对果蝇属(Drosophila)发展和哺乳动物发展是关键性的。

用于分析染色质的表观遗传修饰的现有方法例如染色质免疫沉淀反应(ChIP)，可以一次仅评估一个表观遗传标记且是劳动密集的、连续的过程，其对分析处理量和样品量施加显著的限制。ChIP技术涉及使用对感兴趣的一个表观遗传修饰特异性的抗体来分离改性染色质的免疫沉淀反应，改性染色质随后使用整体平行的DNA测序、微阵列杂交或基因特异性PCR来分析。该方法可以用于表征染色质相关的蛋白质的基因组布置且是目前在表观遗传和染色质研究中实践的占优势的分析工具。然而，其遭受两个主要局限性。第一，该分析需要10⁴至10⁷个细胞且不能够评估消失量的表观遗传变化，使得开发胚胎、被分选的细胞或被微切割的细胞的研究不可能。第二，一次仅一个表观遗传标记可以被分离，使得非常难以探测共存标记。测量结果仅提供关于细胞种群中的‘平均’染色质状态的信息且没有关于单个DNA链的任何信息。在涉及ES细胞中的二价体状态的表征的一个公布的实例中，关于如果三甲基化的组蛋白H3赖氨酸27(H3K27me3)和三甲基化的组蛋白H3赖氨酸4(H3K4me3)标记同时存在于给定的基因上或如果两个种群与ES培养物一起存在(每一个具有相互排斥的标记)，这些局限性引入了模糊性。针对两个不同抗体的序列ChIP可以避开该局限性，然而该解决方案对全基因组分析是不切实际的。

因而，用于表观遗传测试的当前方法涉及全分子分析。结果代表来自遗传物质的多个拷贝的复合信号，这不同于单分子分析。组蛋白修饰最通常使用染色质免疫沉淀反应(ChIP)来探测，在ChIP中，修饰特异性抗体用于免疫沉淀相关的DNA，该DNA然后通过杂交至微阵列(Ren等人(2000)Scienc，290，2306-2309)(ChIP-ChIP)或深度测序(Barski等人(2007)Cell，129，823-837)(ChIP-seq)来探测。DNA甲基化还可以通过使用甲基胞嘧啶抗体的免疫沉淀反应(Weber等人(2005)NatureGenetics，37，853-862)或采用提供DNA甲基化状态的更全面分析的亚硫酸氢盐测序(Zhang等人(2006)Cell，126，1189-1201)来探测。使用抗体的全基因组表观遗传分析常常使用大约106至107个细胞。ChIP使用少至100个细胞，然而，使用该少的细胞，分析是基因座特异性的而不是全基因组的(O′Neill等人(2006)NatureGenetics，38，835-841)。当研究设法确定两个或更多个表观遗传标记是否在基因组内重合或是否存在于单件遗传物质例如单一染色质上时，遭遇更多显著局限性。每一个表观遗传标记的分析需要独立的免疫沉淀反应。当用不同的抗体使染色质从细胞总体沉淀时，难以从总体内的多个种群的存在区分被探测的标记的真正重合，每一个具有不同的表观遗传特征。这可以用序列ChIP来稍微克服，序列ChIP中通过一种抗体沉淀的材料用第二抗体再ChIP(Bernstein等人(2006)Cell，125，315-326)。然而，这些技术经不起全基因组分析或调查多于两种表观遗传标记的研究。此外，全分析技术报告种群的平均值且并不考虑单分子水平的变化形式。因此，对提供更可靠的全基因组表观遗传分析的可选择的方法和组合物仍存在相当大的需求。本发明满足该需求并提供相关的优点。

发明概述

在一些实施方案中，本发明提供用于以单一染色质水平评估表观遗传变化形式。单一分子分析提供了超过常规方法的若干优点。首先，分析提供了单个分子上的信息，单个分子的特性在由普通的整体测量技术记录的统计学平均信息中被隐藏。此外，因为分析可以是多路的，所以其有助于高处理量实现，需要更少量的试剂并利用了探测系统的高带宽，探测系统例如用于极迅速的数据收集的现代雪崩光电二极管。此外，因为单分子计数自动地产生对照亮和光收集起伏现象的抗干扰度，所以单分子分析在测量材料的量方面可以提供比全技术更大的准确度。因此，单分子分析大大地改进了表观遗传分析、基因分型、基因表达谱分析、DNA测序、核苷酸多态性探测、病原体探测、蛋白质表达谱分析和药物筛选的效率和准确度。因此，相当需要克服全分析技术的这些缺点。因此，本发明提供应克服先前技术的局限性的设备和方法和如何进行表观遗传和染色质研究的变换(transform)。

本发明提供了用于进行通道中的遗传物质的表观遗传分析的方法，该方法包括：(a)使所述遗传物质流过所述通道，其中所述遗传物质被标记有多个标记，所述多个标记中的至少一个与所述遗传物质上的表观遗传标记物特异性络合，且至少一个其他标记与所述遗传物质的蛋白质和/或核苷络合；(b)照亮所述通道以产生多个探询容积，每一个探询容积由所述通道的壁和光束限制；和(c)探测来自所述多个的相同或不同探询容积的所述至少一个标记和所述一个其他标记，以产生所述至少一个标记和所述至少一个其他标记的时间相关的分辨率，由此进行所述表观遗传分析。

本发明的另一个方面提供了用于进行通道中的遗传物质的表观遗传分析的方法，该方法包括：(a)使所述遗传物质流过被照亮的探询容积，所述探询容积由所述通道的壁和光束限制，其中所述遗传物质被标记有多个标记，所述多个标记中的至少一个与所述遗传物质上的表观遗传标记物特异性络合，且至少一个其他标记与所述遗传物质的蛋白质和/或核苷络合；和(b)同时地探测在所述探询容积内的所述至少一个标记和所述至少一个其他标记，由此进行所述表观遗传分析。

本发明的另外的方面提供了用于获得关于通道内的物质的实时分析数据的方法，该方法包括：(a)使所述物质流过被照亮的探询容积，所述探询容积由所述通道的壁和光束限制，其中所述物质被标记有多个标记，所述多个标记中的至少一个与所述物质上的标记特异性络合，且至少一个其他标记与所述物质络合；(b)实时探测在所述探询容积内的所述至少一个标记和所述至少一个其他标记，由此产生所述实时分析数据；和(c)在显示设备上显示所述实时分析数据，其中所述实时分析数据反映在所述至少一个标记和所述至少一个其他标记上的信息。

本发明的一个方面提供了一种用于表征单一核酸分子的系统，该系统包括：(a)通道，其配置成保持所述分子；(b)一个或多个光源，其配置成照亮所述通道以产生一个或多个探询容积；(c)探测系统，其配置成探测表示来自所述一个或多个探询容积的所述核酸分子的两种不同的特性的至少两种类型的信号；和(d)处理器，其被编程成提供来自所述一个或多个探询容积的所述至少两种类型的信号的实时的时间相关的分辨率，由此表征所述单一核酸分子。

在前述系统和方法中的任何的另外的方面中，两种类型的信号被同时地探测或所述探测系统探测四种类型的信号。在前述系统和方法中的任何的另外的方面中，所述处理器的特征在于：(i)所述处理器被编程为提供来自多于一个探询容积的所述至少两种类型的信号的时间相关的分辨率；或(ii)包括现场可编程门阵列，所述现场可编程门阵列被编程为提供所述至少两种类型的信号的实时的时间相关的分辨率。

本发明的另一个方面提供了一种用于表征物体的系统，该系统包括：(a)通道，其配置成保持所述物体；(b)一个或多个光源，其配置成照亮所述通道以产生一个或多个探询容积；(c)探测系统，其配置成探测表示来自所述一个或多个探询容积的所述物体的两种不同的特性的至少两种类型的信号；(d)处理器，其被编程为提供来自所述一个或多个探询容积的所述至少两种类型的信号的实时的时间相关的分辨率，由此表征所述物体；和(e)用户界面，其配置成接收来自所述处理器的数据和显示所述数据，其中所述数据包括关于来自所述一个或多个探询容积的所述至少两种类型的信号的信息。

本发明提供了包括以下步骤的方法：a)提供包括DNA片段或染色质的样品，其中染色质包括DNA片段；b)用对DNA特异性的一种或多种标记标记所述DNA片段或染色质；c)用对一种或多种表观遗传标记物特异性的一种或多种标记标记所述DNA片段或染色质；d)使经标记的样品与包括亚微米通道的微流控设备接触；e)应用跨过亚微米通道的电压电位或压差，其中电压电位或压差足以使所述DNA片段或染色质流过亚微米通道；f)通过探测对DNA特异性的一种或多种标记来探测DNA；和g)通过探测对一种或多种表观遗传标记物特异性的一种或多种标记来探测表观遗传标记物；其中探测用单分子分辨率来进行。

本发明提供包括使包括亚微米通道的设备与反应混合物接触的方法，亚微米通道包括探测容积和第一端部以及至少第二端部，反应混合物包括(a)包括DNA和一个或多个表观遗传修饰(epigeneticmodification)的多个染色质片段；(b)对DNA特异性的标记；和(c)对一个或多个表观遗传修饰特异性的标记；其中亚微米通道具有使得基本上一个染色质片段一次地被布置在探测容积内的尺寸。

在一个实施方案中，本发明提供使被限制在纳流控通道内的溶液中的DNA样品流动、用高斯形状的激光剖面照亮样品和探测表示组蛋白或DNA组分的荧光事件的方法。样品可以用两个高斯形状的激光剖面照亮。在一些实施方案中，用于照亮样品的光源是LED或VCSEL。

本发明的另外的方面提供(a)对DNA特异性的一种或多种标记；和(b)对一个或多个表观遗传修饰特异性的一种或多种标记的时间重合探测。

在前述方面和实施方案中的任何一个中，遗传物质是染色质、核酸分子或单一核酸分子。待被分析和/或被分选的物质可以是染色质、核酸分子或单一核酸分子。

在前述方面和实施方案中的任何一个中，物质可以用单分子分辨率来分析。在一些实施方案中，探测步骤提供超过约10微秒的时间依赖性分辨率。本发明方法还可以包括探测对DNA特异性的一种或多种标记和对一种或多种表观遗传标记物特异性的一种或多种标记的时间重合探测。一种或多种表观遗传标记物可以选自一种或多种甲基化的DNA核苷酸、一种或多种羟甲基化的DNA核苷酸、一种或多种乙酰化的组蛋白、一种或多种甲基化的组蛋白、一种或多种泛素化的组蛋白、一种或多种Sumo化的组蛋白、一种或多种磷酸化的组蛋白、甲基DNA结合蛋白(MDB1)、RNA聚合酶II和SWI/SNF。

在前述方面和实施方案中的任何一个中，一种或多种甲基化的DNA核苷酸可以包括5-甲基胞嘧啶。一种或多种乙酰化的组蛋白可以包括乙酰化的组蛋白H3K4、乙酰化的组蛋白H3K9、乙酰化的组蛋白H3K14、乙酰化的组蛋白H3K18或乙酰化的组蛋白H3K23。一种或多种乙酰化的组蛋白可以包括乙酰化的组蛋白H4K5、乙酰化的组蛋白H4K8、乙酰化的组蛋白H4K12或乙酰化的组蛋白H4K16。一种或多种甲基化的组蛋白可以包括单甲基化的、二甲基化的或三甲基化的组蛋白H3K4；单甲基化的、二甲基化的或三甲基化的组蛋白H3K9；单甲基化的、二甲基化的或三甲基化的组蛋白H3K27；或单甲基化的、二甲基化的或三甲基化的组蛋白H3K36。一种或多种甲基化的组蛋白可以包括单甲基化的、二甲基化的或三甲基化的组蛋白H4K20。一种或多种甲基化的组蛋白可以包括单甲基化的或二甲基化的组蛋白H3R2；单甲基化的或二甲基化的组蛋白H3R17；单甲基化的或二甲基化的组蛋白H3R26；单甲基化的或二甲基化的组蛋白H3R128；单甲基化的或二甲基化的组蛋白H3R129；单甲基化的或二甲基化的组蛋白H3R131；或单甲基化的或二甲基化的组蛋白H3R134。一种或多种甲基化的组蛋白可以包括单甲基化的或二甲基化的组蛋白H4R3。

在一些情况中，表观遗传修饰选自由以下组成的组：甲基化的DNA核苷酸(例如5-甲基胞嘧啶)、羟甲基化的DNA核苷酸、乙酰化的组蛋白(例如，H3K4、H3K9、H3K14、H4K12、H3K18、H3K23、H4K5、H4K8、H4K12、H4K16)、甲基化的组蛋白(例如单甲基化的、二甲基化的或三甲基化的H3K4、H3K9、H3K27、H3K36、H4K20、H3R2、H3R17、H3R26、H3R128、H3R129、H3R131、H3R134、H4R3)、泛素化的组蛋白、Sumo化的组蛋白、磷酸化的组蛋白、甲基DNA结合蛋白的存在、SWI/SNF的存在和RNA聚合酶II的存在。

在前述实施方案中的任何一个的另外的方面中，本发明提供了将(a)对DNA特异性的一种或多种标记；和(b)对一种或多种表观遗传修饰特异性的一种或多种标记的时间重合探测鉴定为表示表观遗传修饰的DNA或染色质。

在前述方面和实施方案中的任何一个的另外的方面中，该方法还可以包括确定是否已经发生对DNA特异性的标记和对一种或多种表观遗传修饰特异性的标记的时间重合探测或时间相关的探测。在一些实施方案中，本文提供的方法还可以包括将对DNA特异性的一种或多种标记和对一种或多种表观遗传标记物特异性的一种或多种标记的时间重合探测鉴定为表示表观遗传修饰的DNA。该方法还可以包括将对DNA特异性的标记和对一种或多种表观遗传修饰特异性的标记的时间重合探测鉴定为表观遗传修饰的染色质片段的探测。该方法还可以包括计数所探测的表观遗传修饰的染色质片段的数量。

在前述方面和实施方案中的任何的另外的方面中，该方法可以包括探测四种标记中的至少三种。

在前述方面和实施方案中的任何的另外的方面中，该方法可以包括探测与表观遗传标记物和至少一个其他标记特异地络合的一个标记。至少一个其他标记可以与组蛋白络合或是选自由以下组成的组的核酸结合剂：序列特异性探针、嵌入染料、小沟粘合剂和DNA结合蛋白。至少一个其他标记与结合剂络合，结合剂与选自由非组蛋白蛋白、转录因子、MBD1、RNAPolII和RNA组成的组的靶络合。

在前述方面和实施方案中的任何一个中，探询容积小于约10、1、0.5、0.2、0.1或0.05飞升(femtoliter)。遗传物质可以在小于约1、0.5、0.1、0.01、0.001或0.0001秒被表征。被照亮的探询容积可以包含单一染色质。一个或多个探询容积可以是以下中的一个或多个：(a)小于约10、1、0.5、0.2、0.1或0.05飞升、(b)不大于物体的尺寸的约10,000倍，提供单分子分辨率、(c)形成所需的尺寸以保持单一核酸分子、和(d)由通道的壁和来自所述光源的光束限制，所述光束具有不大于X微米的直径。

在前述实施方案中的任何一个中，探测系统可以测量大于约2的信噪比。通道包括光学透明的壁。光源提供具有不同波长的多个光束。

在前述实施方案中的任何一个的另外的方面中，本发明提供了用照亮源例如白炽源、发光二级管、闪光灯或激光器激发对一种或多种表观遗传修饰特异性的标记和激发对DNA特异性的标记。照亮源可以是一种或多种激光器。在前述实施方案中的任何一个的另外的方面中，本发明提供用光探测器例如光电倍增管、雪崩光电二极管、CCD或CMOS阵列探测被发射的光子。

发射可以包括用雪崩光电二极管或光电倍增管探测被发射的光子。

该方法还可以包括计数表观遗传修饰的DNA的量。该方法还可以包括将所述计数表观遗传修饰的DNA的量的结果存储在计算机可读的介质上。

该方法还可以包括将所探测的表观遗传修饰的染色质片段的数量存储在计算机可读的介质上。

该方法还可以包括改变所应用的跨过亚微米通道的电压的量以从不提供对DNA特异性的一种或多种标记和对一种或多种表观遗传标记物特异性的一种或多种标记的时间重合探测的DNA分选表观遗传修饰的DNA。该方法还可以包括改变所应用的跨过亚微米通道的电压的量以从不提供对DNA特异性的一种或多种标记和对一种或多种表观遗传标记物特异性的一种或多种标记的时间重合探测的DNA分选表观遗传修饰的DNA。该方法还可以包括应用分选激光器以从不提供对DNA特异性的一种或多种标记和对一种或多种表观遗传标记物特异性的一种或多种标记的时间重合探测的DNA分选表观遗传修饰的DNA。本发明方法还可以包括改变跨过亚微米通道的磁矩以从不提供对DNA特异性的一种或多种标记和对一种或多种表观遗传标记物特异性的一种或多种标记的时间重合探测的DNA分选表观遗传修饰的DNA。

在前述实施方案中的任何一个中，被分选的表观遗传修饰的DNA可以通过PCR、核酸杂交分析、微阵列分析、ChIP或DNA测序来进一步分析。在前述实施方案中的任何一个中，该方法还可以包括从通过探测对DNA特异性的一种或多种标记提供的信号幅度计算所探测的DNA的尺寸。在前述实施方案中的任何一个的另外的方面中，本发明提供一种用于通过改变电压、使用分选激光器、改变磁矩或改变跨过亚微米通道的压差来分选表观遗传修饰的DNA或染色质的方法。在前述实施方案中的任何一个的另外的方面中，本发明提供了通过PCR、核酸杂交、微阵列、ChIP、DNA测序、质谱法和NMR来进一步分析被分选的DNA。在前述实施方案中的任何一个的另外的方面中，本发明提供了从通过探测对DNA特异性的一种或多种标记提供的信号幅度计算DNA的尺寸。

该方法可以包括改变所应用的跨过亚微米通道的电压或压力的量以从不提供对DNA特异性的一种或多种标记和对一种或多种表观遗传修饰特异性的一种或多种标记的时间重合探测的DNA分选表观遗传修饰的DNA。

该方法还可以包括使用分选激光器以从不提供对DNA特异性的一种或多种标记和对一种或多种表观遗传修饰特异性的一种或多种标记的时间重合探测的DNA分选表观遗传修饰的DNA。在一些实施方案中，被分选的表观遗传修饰的DNA可以通过PCR、核酸杂交分析、微阵列分析、ChIP或DNA测序来进一步分析。一种或多种表观遗传修饰可以选自一种或多种DNA核苷酸的甲基化、一种或多种DNA核苷酸的羟甲基化、一种或多种组蛋白的乙酰化、一种或多种组蛋白的甲基化、一种或多种组蛋白的泛素化、一种或多种组蛋白的Sumo化、一种或多种组蛋白的磷酸化、RNA聚合酶II的结合和SWI/SNF的结合。

该方法还可以包括应用跨过亚微米通道的电压电位或压差，其中电压电位或压差将多个染色质片段从亚微米通道的第一端部推动至亚微米通道的另一个端部。该方法还可以包括探测对DNA特异性的标记。该方法还可以包括探测对一种或多种表观遗传修饰特异性的标记。

通过引用的并入

在本说明书中提到的所有出版物和专利申请通过引用并入本文，其达到的程度如同特别且单独地指明每个单独的出版物或专利申请通过引用并入。

附图简述

在所附权利要求中详细地阐述了本发明的新颖特征。通过参考阐述例证性实施方案的下面详述的描述将获得对本发明的特征和优点的更好理解，其中本发明的原理被利用，且其中附图：

图1A、图1B和图1C描述本发明的示例性设备。图1A是包含27个设备的100毫米直径晶片的照片，每一个设备由平行阵列的16个用于单分子光谱学的亚微米流控通道组成。加入流控端口(晶片的左侧)以与通向通道的流体储器连接。设备可以用于收集单分子时间重合数据，其中电压梯度可以被设置成使染色质从底部向顶部或从顶部向底部运动。图1B描绘存在于27个设备中的一个上的16个流控通道中的15个的光学显微照片。图1C描绘流控通道中的一个的放大图。该图是用于SCAN(纳米级的单一染色质分析)的典型的纳流控通道的微分干涉相衬光学显微照片。在荧光探测期间使用具有500nm宽和250nm深的横截面的窄区域。这些通道中的432个被组装在单一100mm直径熔融石英晶片上。标度线是10μm。

图2描绘本发明的设备的一个实施方案的框图。激光器可以用于激发与染色质相关的荧光团，染色质由电动流定向成通过安装在成像平台例如共焦显微镜上的纳米级设备。由DNA特异性标记和表观遗传修饰特异性标记发射的光子可以使用光探测器例如雪崩光电二极管(APD)来单独探测。可选择地，在本发明的设备和方法中可以采用其他探测方式，例如探测磁性或电特性。同样地，除了需要显微镜的那些方法和设备之外的方法和设备可以用于数据收集，例如固体状态方法和同时允许多个流体通道的数据收集的方法。

图3阐明本发明的微流控设备，其包括适合于单分子探测(SMD)的检查或探测容积。所描绘的是荧光标记的物质流过的纳米级通道和约0.18飞升检查容积。三种类别的荧光发射粒子可以被探测。这些包括结合至缺乏包括标记的表观遗传标记物的核小体的DNA的DNA标记(深色圈-被标记有TOTO-3荧光团)、包括缺乏DNA标记的标记的表观遗传标记物的核小体(浅色圈，被标记有eGFP荧光团)和包括包含在标记的DNA上的标记的表观遗传标记物的核小体的染色质(深色圈和浅色圈组合)。染色质可以充分地低的浓度被装载到设备上，使得两个单独的分子同时占据检查容积的概率＜0.005。

图4A和图4B描述使用场照明来帮助流过流体通道的平行网络的DNA的显像的荧光光学显微照片。图4A阐明示出保留在流体通道内的荧光标记的DNA的快照的显微照片。图4B阐明示出在流动和单分子隔离(狭窄的区域)期间同一荧光标记的DNA的显微照片(随着时间消逝)。

图5A和5B描述DNA片段分级实验的结果。图5A描绘已经用HindIII消化的λ噬菌体DNA的光子猝发直方图。峰的位置取决于DNA片段的长度；峰面积与每一个片段的相对浓度成比例。图5B描绘作为已知的片段尺寸的函数的猝发尺寸(burstsize)的图。虚线是表示准确地确定各种DNA片段的尺寸的能力的线性最小二乘拟合。

图6A和图6B描述通过本发明的设备收集的单分子数据。图6A描绘当结合至有机AlexaFluor488(AF488顶部)分子的量子点(底部)电动地流过微流控通道时，在单独的光谱通道中被探测的作为时间的函数的光子数量。图6B描绘小的扩展时间间隔以便看到三个重合探测实例，其中量子点和AF488标记在相同的时间通过聚焦容积。

图7A和图7B描述通过用于探测荧光团标记的核酸树状大分子的本发明设备收集的单分子数据。图7A示出展示了3R1G(3红色(深色圈)、1绿色(浅色圈)荧光团)标记的Y形核酸设计的(NAE)结构的光子猝发扫描。阴影带表示时间重合探测的猝发。图7B阐明猝发强度(高度)直方图的检查可以如何展示1G1R(1绿色和1红色荧光团)和4G4R(4绿色和4红色荧光团)标记上的易于区别的荧光团含量。

图8A和图8B描述了用于制备双色标记的核酸以比较扩增子产物同一性的实验方法。右边的图描绘显示与分别以单分子水平被探测的颜色引物和扩增子产物两者一起用于探测的未纯化的PCR反应含量的实验时间跟踪。最大的探测灵敏度使用具有附着于每一种分子的给定颜色的单一荧光团来证明。

图9A描绘作为PCR循环次数的函数的产物百分比，PCR循环次数在亚微米流控通道中使用单分子光谱学来测量。浅色阴影的圈和深色阴影的正方形分别表示作为绿色引物和红色引物的函数的产物百分比。误差棒相当于一个标准偏差。

图9B描绘作为PCR循环次数的函数的产物百分比，PCR循环次数使用常规的凝胶电泳方法来测量。

图10A阐释1ng/ul的DNA-抗体偶联物的代表性的1分钟时间扫描。量子点标记的抗体通道在顶部，标记的DNA通道在底部。

图10B在左边阐明24-28秒的时间扫描的展开图，以清楚地阐明单分子猝发。对两个探测通道中的时间重合猝发画阴影。

图11阐明通过本发明设备收集的单分子数据。阴影区域同时地突出表明DNA和核小体的单分子探测的时间重合的DNA和核小体探测。

图12阐明GFP示踪的组蛋白H2B(H2B-GFP)核小体和TOTO-3标记的DNA的时间重合。具有每一个荧光团颜色的单分子事件可以针对它们的时间重合来分析以鉴定被结合的DNA-组蛋白络合物或核小体。在所测试的条件下，超过95％的重合猝发在+/-1bin时间(bin时间是500微秒)内发生，阐明了DNA和组蛋白的优良的共局部化。该样品可以使用5-min微球菌核酸酶消化来制备并以1∶5(染料∶碱基对)被标记有TOTO-3。

图13描绘来自使用三种不同的摩尔比的TOTO-3与DNA或没有TOTO-3的实验的重合统计学。报告了在红色通道(TOTO-3标记的DNA)和绿色通道(H2B-GFP示踪的核小体)中探测的光子猝发的数目，以及每次猝发的持续时间和与其他颜色的猝发重合的百分比。还报告了变异系数，变异系数从每一个实验的总事件计算。注意，当TOTO-3用于以1∶10或更高的浓度比标记DNA时，大于95％的包含GFP的粒子还携带DNA嵌入剂TOTO-3。这表明许多流动的染色质在我们的设备上是完整的。在缺乏TOTO-3时看到的红色猝发是由于从前面的试验留在可重复使用的设备上的残余的TOTO-3染料。

图14A、图14B、图14C和图14D阐释稀释分析证实GFP(核小体标记)和TOTO-3(DNA标记)重合测量。将表达H2B-GFP的HeLa细胞与缺乏GFP转基因的HeLa细胞以在X-轴上示出的比例混合，然后使用15分钟和5分钟的微球菌核酸酶消化时间从混合物制备染色质。染色质被标记有TOTO-3并进行重合测量。图14A和图14B示出每分钟荧光事件的数量的图，其中TOTO-3(图14B)和GFP(图14A)信号作为表达用于制备染色质的Hela细胞的H2B-GFP的比例的函数是重合的。图14C和图14D示出来自5minMNase消化的重合速率被归一化为H2B-GFP荧光事件(图14C)和TOTO-3事件(图14D)的数量。每GFP事件重合速率在GFP示踪的染色质的所有稀释中是恒定的。每TOTO-3事件重合速率随GFP输入减小而减小。

图15A和图15B描绘甲基化的DNA和被设计为探测甲基化的DNA的试剂的时间重合探测和试剂与未甲基化的DNA的时间重合探测的缺乏。

图16A和图16B描述本发明的示例性的分析和制备设备的实施方案的显微照片。图16A示出其中标记有YOYO-1的10KbpDNA片段从底部流到顶部的分选设备的光显微照片，且顶部的两个分叉(来自一个分叉点)代表两个可能的流出道。图16B示出从底部到顶部流经分选设备的YOYO-1标记的DNA的长曝光荧光显微照片。在该图像中，流出道的左臂中的电极被充电，使DNA定向到左收集室。注意，在右臂中的电极可由高速开关充电，高速开关被编程为对在恰好在分叉之下的检测容积中进行的观察作出响应。可以是染色质的样品可以被标记有TOTO-3并同样地被分析和/或被分选。

图17示出包括安装在共焦荧光显微镜上的晶片的实验平台的示意图。两个重叠的激光器照亮1.3μm长度的纳流控通道并形成0.16fL的检查容积。使用空间上限制对检查容积的光学收集的共焦孔径和提供单一光子探测的雪崩光电二极管(APD)来实现每一个分子的暗淡的荧光特征的收集。

图18示出单分子探测和双色重合分析的过程。光子猝发的时间跟踪记录通过每一个APD来观察，显示15分钟纳流控扫描中的0.25秒。具有总计10个或更多个光子的猝发满足阈值条件并被标明为单分子探测(SMD)事件，本文通过在分别确定DNA和组蛋白H2B的顶部图或底部图中的圈符号示出。在图上用跨过两个图的竖直阴影条确定的完整的染色质片段，通过红色和绿色事件两者的时间重合探测来确定。

图19A和图19B示出GFP-HeLa染色质在不同的消化时间的示例性纳流控SCAN。将染色质从野生型HeLa细胞和具有H2B-GFP融合转基因的HeLa细胞的核分离出来且然后通过SCAN分析15分钟。(A)TCH阐明当分析来自野生型HeLa核的染色质时，不存在重合的双色SMD事件。使用来自5分钟消化的GFP-HeLa染色质，对应于发射两种荧光颜色的完整的染色质分子的中心的高斯峰，从不相关事件的背景显露出来。通过对在峰下的面积积分和减去不相关的背景，我们观察到多于16,000种双色染色质分子。(B)双色染色质分子的比例与GFP-HeLa核含量成正比例增加，如通过分别对于5分钟和15分钟消化测定的R²＝0.98和R²＝0.95的线性拟合所描述的。误差棒表示来自结合分子和非结合分子两者的SMD(单分子探测)的传播误差。

图20示出DNA甲基化的探测。(图20A)标记有TOTO-3的未甲基化的(顶部)和甲基化的(底部)的DNA样品均用摩尔过量的标记有AlexaFluor488的MBD1探针温育且然后分析15分钟。底部图中现出的峰表明甲基化的DNA的SMD。摩尔过量的标记的MBD1归属于每一个实验内不相关事件的背景。(图20B)我们分析甲基化的DNA和未甲基化的DNA的混合物。双色标记的MBD-DNA的比例被示出为随甲基化的DNA而增加，如通过R²＝0.99的线性拟合所描述的。误差棒表示来自结合分子和非结合分子两者的SMD的传播误差。

图21示出TOTO-3SMD事件的持续时间的直方图。

图22示出单独的荧光染料颜色的猝发分离图。

图23是显示在不同批次的MNase消化期间制备的染色质片段的凝胶。

图24是显示在不同批次的MNase消化期间制备的染色质片段的凝胶。

图25是显示在采用甲基化敏感的限制性内切酶HpaI的DNA消化之后的甲基化反应的效率的凝胶。

图26是显示AlexaFluor488标记的MBD1保留其对甲基化的DNA的特异性的凝胶。

图27A描绘包括多个分叉点的通道。

图27B描绘包括在分支点流体地连接至多于两个下游流路或通道的上游通道的通道。

发明详细描述

组合高处理量探测和单一染色质片段的分析的微流控和纳流控平台可以克服现有表观遗传方法的局限性。在一些实施方案中，本发明包括用于使单一天然染色质分子流动和探测单一天然染色质分子的组合物和方法。在一些实施方案中，用于使单一天然染色质分子流动和探测单一天然染色质分子的方法可以通过以高处理量分析染色质内的DNA和组蛋白两者的时间重合的荧光特征来进行。在一些实施方案中，本发明包括使用并行的染色质研究和可以结合至甲基化的DNA的荧光标记的探针的条件来研究DNA中的表观遗传标记的方法。这些方法可以被称为SCAN(纳米级的单一染色质分析)且是单分子高处理量表观遗传分析的第一证明。

在一个方面，本发明提供了用于以单分子分辨率探测表观遗传修饰的方法和设备。本文提供的方法和设备可以应用到单个染色质或DNA分子的表观遗传分析。染色质的单分子研究允许同时探测单个染色质片段上的多个表观遗传标记且需要非常少量的输入细胞材料。这显著地提高了表观遗传分析的质量并开发了以单分子水平研究的新途径。本文提供的设备和方法可以同样应用到在形式上可能不被认为是表观遗传性质的其他染色质相关要素的分析。这些方法可以提供多个表观遗传标记的同时探测和可以解决发育生物学和人类健康中的根本问题。

方法

本发明提供了用于进行遗传物质的表观遗传分析的方法。本发明的一个方面提供了一种用于对通道中的遗传物质进行表观遗传分析的方法，该方法包括(a)使所述遗传物质流过所述通道，其中所述遗传物质被标记有多个标记，所述多个标记中的至少一个与所述遗传物质上的表观遗传标记物特异性络合，且至少一个其他标记与所述遗传物质的蛋白质和/或核苷络合；(b)照亮所述通道以产生多个探询容积，每一个探询容积由所述通道的壁和光束限制；和(c)探测来自所述多个的相同或不同探询容积的所述至少一个标记和所述一个其他标记，以产生所述第一标记和所述第二标记的时间相关的分辨率，由此进行所述表观遗传分析。

在本发明的另一个实施方案中，同时地进行第一标记和第二标记的探测。对通道中的遗传物质进行表观遗传分析可以包括：使遗传物质流过被照亮的探询容积，所述探询容积由所述通道的壁和光束限制，其中所述遗传物质被标记有多个标记，所述多个标记中的至少一个与所述遗传物质上的表观遗传标记物特异性络合，且至少一个其他标记与所述遗传物质的蛋白质和/或核苷络合；和同时地探测探询容积内的第一标记和第二标记，由此进行所述表观遗传分析。

在一些实施方案中，用于产生关于通道中的物质的实时分析数据的方法可以包括：使物质流过被照亮的探询容积，所述探询容积由所述通道的壁和光束限制，其中所述物质被标记有多个标记，所述多个标记中的至少一个与所述物质上的标记物特异性络合，且至少一个其他标记与所述物质络合；实时探测探询容积内的第一标记和第二标记，由此产生所述实时分析数据；以及在显示设备上显示所述实时分析数据，其中所述实时分析数据包括所述第一标记和第二标记上的信息。

本发明可以增加表观遗传分析的灵敏度，这可以允许使用包括单细胞量的遗传物质的样品。其还可以增加可能的同时的表观遗传分析的数量。本发明提供允许使用比目前组蛋白分析所需要的低几个数量级的极端限制量的材料来同时分析多种表观遗传标记物(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或更多种)的方法。在一些实施方案中，该方法依赖于每分钟流过纳流控设备上的单一电泳通道的多于4,000个DNA和染色质片段的单分子三色荧光显微术成像。使用该设备，可以显著地扩大样品处理量和使用流控通道的平行网络和同时的光学分析来分析的表观遗传标记的数量。分选性能可以允许回收被成像的和被分选的材料，用于整体平行的DNA测序。

在一些实施方案中，本发明提供表观遗传修饰的全基因组的全冗余覆盖(fullredundantcoverage)。在一些情况下，本发明提供用于在我们的全分析中的基因组(例如小鼠、人类、脊椎动物、动物、植物、真菌、古细菌、细菌等)的2x、3x、4x、5x、6x、7x、8x、9x、10x或更高覆盖的方法和设备。在一些情况下，每分钟具有1,000；2,000；3,000；4,000；5,000；6,000；10,000；15,000；20,000；30,000；50,000；75,000；100,000bp或更大的平均靶片段尺寸的1,000；2,000；3,000；4,000；5,000；6,000；10,000；15,000；20,000；30,000；50,000；75,000；100,000或更多的DNA片段，在小于3小时、2小时、90分钟、75分钟、60分钟、45分钟、30分钟、15分钟、10分钟、5分钟、3分钟、2分钟、1分钟、30秒、15秒、10秒、5秒或更少时间内提供2x或更高的基因组覆盖。分析数据的时间可以随着所探测的染色质标记的数量增加而增加，但这不会限制数据采集的速度。设备结构可以被修改以允许样品分选和回收，用于测序。该实施方案可以利用实时数据分析和切换电路的控制。分析速度可以取决于软件设计、计算机速度和所选择的具体电路。值得注意的是，在商业流式细胞仪设备比如BD-BiosciencesFACSAria中，30,000个事件每秒的分选速率是常规的。本发明的设备能够具有比得上的或甚至更快的分选速率。例如，本发明的设备每秒能够分选大约或大于大约30,000、35,000、40,000、45,000、50,000、55,000、60,000、70,000、80,000、90,000、100,000个事件或更多。以每秒20,000bp片段的30,000个成像事件，整个哺乳动物基因组可以在5秒内被分析。

在本发明的一些实施方案中，遗传物质可以在小于约1、0.5、0.1、0.01、0.001或0.0001秒内被表征。表征可以通过接收来自探测模块的对应于遗传物质的特性的信号的处理器来进行。在一个实施方案中，探测模块是雪崩光电二极管。探测模块可以传输对应于多于一个或单一特性或标记的信号。探测模块可以传输对应于多于两个特性或标记的信号。处理器可以基于所述信号确定表观遗传标记物的存在或不存在。

本发明还提供用于以单分子形式进行类似于沉淀测定的分析技术的方法。例如，可以使用本发明的方法、系统和设备来改进任何免疫沉淀反应测定以获得单分子分辨率和/或实现分子或物体的高速表征。

样品

本发明的方法和设备可以适合于分析包括物体、遗传物质、核酸(例如，DNA、RNA或其任何混合物)、肽、蛋白质、适配子、其任何片段或其任何组合的样品。这些物体中的任何可以是单一物体，例如单一核酸或单一染色质。

术语“物体”可指本文所述的任何分子、单分子、络合物、细胞、细胞组分或珠子。例如，系统、设备和方法可用于分选和/或分析生物分子，包括但不限于遗传物质、核酸(例如，DNA、RNA及其混合物)、核酸片段、蛋白质、蛋白片段、适配子、碳水化合物、脂质、核酸-蛋白质络合物、蛋白质-蛋白质络合物及其任何组合。物体也可以是细胞、细胞组分或细胞片段。例如，系统、设备和方法可用于分选和/或分析其它分子，包括聚合物、有机分子、小有机分子、药物、药物目标和化合物。本发明设备还可以分选和/或分析粒子，例如珠子、囊泡和脂囊泡。在一些情况下，本文提供的系统、设备和方法可用于分选和/或分析具有特定的结合蛋白质或改变的化学状态的核酸，用于表观遗传分析。在一些情况下，本发明提供对染色质的分选和/或分析，染色质包括整体染色质和染色质片段和/或组蛋白。待分选和/或分析的物体可以具有各种尺寸。例如，待分选的物体一般具有小于在分选系统中的通道的尺寸、直径或宽度的尺寸。在一些实施方案中，物体的所有尺寸小于通道的宽度和高度。在其他实施方案中，物体的长度可以大于通道的宽度，例如细长的核酸。如本文所述的，待分选的物体可针对内在特性被测量，或可使用与物体络合的另一分子来标记。这样的标记的例子包括荧光染料，例如任选地偶联到核酸探针的量子点。可以利用的其它标记包括嵌入染料，例如YOYO-1、TOTO-3、SyberGreen、溴化乙啶。

遗传物质可以是单分子或由单个分子形成的络合物。在一些实施方案中，遗传物质是染色质(包括染色质片段)或单一染色质(包括单一染色质片段)。染色质可以针对表观遗传标记物的存在或不存在或存在于染色质上的表观遗传标记物的数量被分析。

样品可以从任何细胞或组织源获得。在一些情况下，本发明的方法和设备可以适合于分析包括少量或限制量的DNA的样品，DNA包括但不限于：MEFDNA、ESDNA、Dnmt1-/-ESDNA、小鼠胚泡DNA、来自微切割肿瘤的DNA、来自植入前胚胎、MEF染色质、ES染色质、Dnmt1-/-染色质和胚泡染色质的DNA。

物体、遗传物质、核酸、DNA、染色质肽、蛋白质或其任何组合在其流入通道之前(或之后)可以通过本领域已知的任何方法来分段，且取决于DNA或遗传物质的源，不同的方法可能是优选的。对于在200μl或更大容积中总计若干微克的大量和浓缩的源，可以将标准超声波仪探针插入容纳DNA的管中。备选方案是使用DNAseI来分段DNA。另一个备选方案是使用微球菌核酸酶或任何其他合适的核酸酶例如双链DNA核酸外切酶或核酸内切酶来分段染色质。

本文提供的方法可用于分析从极端低丰度的源获得的DNA或其他遗传物质中的甲基化状态。单一哺乳动物细胞可以保持约3pg的遗传DNA，且可以使用本发明来分析来自约30个激光微切割的肿瘤细胞、包含八个细胞的单一小鼠桑椹胚和包含约40个细胞的胚泡的DNA。

当用少量细胞或本文描述的任何其他样品来工作时，使用蛋白酶处理和有机提取，随后醇沉淀的纯化方法可以是相当可靠的，且在一些情况下它们需要糖原或tRNA作为载体来最大化DNA回收。用于溶解DNA的一种可选方法是通过将容纳细胞的管放在杯角超声波仪(杯角超声波仪)中用物理方法破坏细胞。被微切割的细胞和胚胎的超声处理可以从核释放DNA，避免样品在纯化期间损失和使得不需要使用载体。采用纳米级流和抗体探测，这些粗提取物在合适的缓冲条件下可以是可相容的。超声处理可能产生可以堵塞本发明的设备的纳米级通道的碎屑，除非碎屑小于设备的可以测量为例如约500nm×500nm截面通道尺寸。离心分离可以足以除去粒子。可选择地，可以制备其间距小于通道开口的格网在输入通道之前的设备-这可以通过在分析之前过滤设备上的颗粒来防止通道堵塞。此外，对于经超声处理的材料，可能需要少量EDTA和SDS来保护DNA完整性并溶解细胞材料。当超声处理植入前胚胎时，可能需要使用Tyrode酸液(acidTyrode’ssolution)来除去透明带。透明带是可以抵抗超声处理的结实蛋白聚糖层。

可以通过本发明方法分析的遗传物质可以包括植入前胚胎。对于植入前小鼠胚胎，透明带可以在使染色质与甲醛交联之前使用Tyrode酸液除去。富蛋白聚糖的带可以妨碍甲醛通向核。超声处理可以使用包含容纳单一胚胎的管的杯角超声波仪来进行。可以一次一个或组合深测特异性表观遗传标记。

激光器微切割的材料还可以通过本发明的方法和设备来分析。被微切割的样品中的染色质的分析可以使用冷冻切片来进行。通过使用来自冷冻组织的切片，可以控制交联时间，可以限制暴露于甲醛的细胞与细胞之间的差异。还可以分析石蜡包埋的样品。

天然染色质以及通过使用甲醛使蛋白质与DNA交联制备的保藏的染色质两者可以用于本发明分析。交联具有使蛋白质固定和稳定在它们在DNA上的接触点处的优点，且已经广泛用于ChIP、ChIP-ChIP和ChIP-Seq研究。在需要时，可以使用来自ES和MEF细胞的交联染色质。染色质可以用QD标记的抗体染色，QD标记的抗体识别不同的表观遗传标记，包括DNA甲基化、DNA羟甲基化、结合的RNApolII、改性的或未改性的组蛋白或任何其他已知的表观遗传标记，然后单个分子可以在本发明的纳米级流控通道中在定向电压流期间成像。通过结合不同的抗体，每一个抗体被标记有其光谱特性是可区别的不同的QD，可以研究每一个特征的重合或相互排斥。可以同时分析多个独立特征(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、14、15、16、18、20、25、30个或更多)。

待分析的包括遗传物质、DNA、染色质或任何其他样品的输入材料可以通过本领域已知的许多方法例如使用蛋白酶K处理、苯酚/氯仿提取和乙醇沉淀来制备。同样地，染色质可以通过本领域已知的许多方法来制备，方法包括天然的或非天然的提取方法。可以影响每单位时间多少序列千碱基对被分析的重要变量是被分析的DNA片段的平均长度。可以容易地分析和排列来自YOYO-1标记的600bp至27,000bp的DNA片段的光子猝发的数量。因此可以使用宽范围的片段尺寸。通过使用大的片段，可以通过询问较少的片段和光子猝发事件来提供全基因组分析。然而，使用大的片段提供了分辨DNA甲基化位于之处的有限能力。在一些情况下，预先根据抗5-甲基胞苷抗体结合分选的DNA片段的全面的基于亚硫酸氢盐的分析可以通过本发明的方法来进行。

在一些情况下，本发明的方法利用已经经历ChIP程序以富集携带感兴趣的标记的输入材料的染色质。例如，ChIP可以用抗-H3K4me3来进行，且该材料可以用于本发明的纳米级设备中以探测H3K27me3。然后，该富集的输入材料可以用于优化在设备上探测表观遗传标记的缓冲条件。值得注意的是，由于纳米级通道中存在的极高的表面积与容积比，为了最小化表面驱动的人工制品以及确保适当的抗体与抗原相互作用，缓冲条件是关键性的。

标记

物体或样品中的遗传物质可被络合、预处理或与一个或多个标记混合。在一个实施方案中，遗传物质被标记有多个标记，其中至少一个标记特别与所述遗传物质上的表观遗传标记物络合，而至少一个其它标记与所述遗传物质的蛋白质和/或核苷络合。标记包括荧光染料、量子点、磁性粒子、金属粒子和有色染料。在本文描述染料的例子。染料或标记可被偶联到结合部分，例如抗体、核酸、蛋白质、适配子、亲和钳、肽、天然出现的蛋白质和结合到所关注的靶蛋白质的蛋白质结构域。结合部分可以是特异性的或一般的。在一些实施方案中，一个结合部分是对表观遗传标记物特异的，而第二结合部分一般结合到核酸、蛋白质或生物分子。

待分析的遗传物质可以在有或没有标记的情况被分析。在一些实施方案中，遗传物质不被标记，且不依赖于标记的探测技术可以用于表征遗传物质。例如，电导率和UV吸光度可以在没有标记的情况下探测DNA。在其他实施方案中，待分析的遗传物质被标记，使得可以观察遗传物质的特性。标记可以是对某些系列的遗传物质特异的，或标记可以是一般的。一般的标记包括非特异地结合至核酸的标记(例如，嵌入染料、核酸槽结合染料和小沟结合剂)或蛋白质。嵌入染料的实例包括YOYO-1、TOTO-3、SyberGreen和溴化乙锭。在一些情况下，该方法提供了除了YOYO-1或TOTO-3之外的标记染色质的可选择的方法。

样品可以用特异性标记来标记。特异性标记可以包括与结合至特异性遗传标记的部分偶联的可探测的部分(例如，染料、金属粒子、放射性粒子和磁性粒子)。染色质可以使用这样的特异性标记来标记。从处于受精至原肠胚形成的不同阶段的胚胎分离的染色质可以用QD标记的抗体标记，使用对每一种抗体不同颜色的QD，QD标记的抗体识别H3K27me3、H3K4me3和5-甲基胞苷或任何其他已知的表观遗传标记物。可选择地，任何合适的标记试剂可以用于标记表观遗传修饰，例如特异地识别如本文提供的表观遗传标记物的结合剂，包括但不限于，标记的抗体、抗体片段、微小抗体、亲合体、高亲和性多聚体(avimers)、适配子、结合表观遗传标记物或与染色质相关的标记物组的其他蛋白质，例如MDB1。本文使用的经标记的结合剂可以与本文描述的感兴趣的任何靶络合。感兴趣的靶可以包括MBD1、RNAPolII、RNA、DNA、SWI/SNF、mRNA、pre-mRNA、miRNA、piRNA、lincRNA和siRNA。同样地，合适的标记可以包括但不限于QD、有机荧光团或可以通过磁性或电特性的变化被探测的剂。如果需要，经标记的染色质可以在本发明的设备上被分选，且具有这些标记的每一个组合的部分可以被分离，用于随后的高处理量(例如Solexa、Illumina、454/Roche等)测序。

样品可以用偶联至与靶络合的结合部分的标记来标记。在一些实施方案中，靶是特异性DNA序列。特异性DNA序列可以使用经标记的结合部分来识别，例如经标记的探针、核酸序列和DNA结合蛋白。DNA结合蛋白包括但不限于，在Jamieson，NatRevDrugDiscov2：361-8(2003)；Umov，Nature435：646-51(2005)；Moscou，Science326：1501(2009)和NielsenScience254，1497(1991)中描述的那些。

在一些情况下，两种一般染料和对应于第一特性的一种特异性染料可以用于标记样品。这可以允许在游离染料、没有第一特性的物体和具有第一特性的物体之间的区别。在其他实施方案中，两种一般染料和两种特异性染料可以用于标记样品，其中第一特异性染料对应于第一特性且第二特异性染料对应于第二特性。除了探测游离染料、没有第一特性的物体和具有第一特性的物体之外，这将允许探测没有第一特性或第二特性的物体、具有第二特异性特性的物体、没有第二特性的物体和具有第一特性和第二特性两者的物体。

核酸结合剂可以用于标记样品。标记或标记部分的非限制性实例包括特异性序列探针、嵌入染料和小沟粘合剂。通常，荧光嵌入剂可以是通过将它们插入在邻近碱基对之间而结合至双链DNA或双链RNA的染料。通常，小沟粘合剂可以是结合至双链DNA的小沟的染料。仍存在可以经由多种模式结合至核酸的其他染料，包括在带正电荷的染料和带负电荷的核酸之间的静电相互作用。在一些情况下，期望使所有的染色质片段成像，而不管它们的表观遗传状态。例如，可以确定胚泡基因组中携带H3K27me3和H3K4me3表观遗传标记的部位的比例。至少两种可选方法可用于标记所有的染色质片段，不依赖于嵌入染料。一种方法是使用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)将Alexa耦合的核苷酸标记至每一个染色质片段的3’末端。所选择的Alexafluor可以在光谱上不用于被选择用于抗体的QD。该TdT介导的标记不受交联限制且仅取决于每一个染色质片段的末端的3’-OH基团。另一种方法是使用识别H1(抗-H1)或芯组蛋白之一的抗体来标记组蛋白而不是DNA。在20,000bp尺寸范围的染色质片段的制备中，使用80％的与核小体相关的遗传序列，仅极罕见的染色质片段将保持未被抗-H1标记。

样品可以用QD-抗-甲基-C来标记以探测甲基化的DNA。在一些情况下，针对核小体的甲基胞嘧啶可能难以接近交联染色质中的QD-抗-甲基-C。相对于缺乏相同的DNA序列的交联蛋白质，这可以提供对于染色质片段的较低的QD荧光发射。然而，在核小体之间的连接体DNA可能不受交联影响，所以连接体DNA在纯化DNA中如在交联染色质中一样易接近。第二，甚至对于DNA缠绕的核小体，小于一半的信号可以损失，这是因为甲基胞嘧啶延伸入DNA的大沟中，所以溶液中的抗体对大沟的接近就决定了结合至甲基化的DNA的QD-抗-甲基-C；将DNA以对组蛋白足够近的接近性缠绕在具有小于一半大沟表面积的核小体的外表面周围以排斥抗体；因此核小体中的大部分甲基胞嘧啶能够接近QD-抗-甲基-C。核小体相关的DNA和连接体DNA中的甲基胞嘧啶对溶液相的组合接近可以提供包含甲基化的DNA的序列的足够的信号。

在一些情况下，染色质中的甲基化的DNA可以通过用可以结合至甲基胞嘧啶和QD-抗-H1的QD-抗-甲基-C或可以结合至染色质的5’或3’末端标记来标记样品而被探测。这可以用于例如标记来自培养的ES细胞的染色质以分析染色质的甲基化。在染色质的情况下，Dnmt1突变体细胞可以用作优良的阴性对照来评估结合至甲基胞嘧啶的抗体的特异性。在该情况下，染色质可以来自野生型和Dnmt1突变体ES细胞，其可以类似于在ChIP中一样使用上述标记来制备。使用QD-抗-甲基-C标记的甲基胞嘧啶和经标记的染色质可以在本发明的纳米级设备上被分析。该方法可以确定具有甲基胞嘧啶标记的片段的比例和那些标记在染色质中的密度。可以用使用纯化的DNA获得的数据来进行比较。在一些情况下，ES和MEF细胞染色质可以使用QD-抗-H3K4me3和QD-抗-H3K27me3来标记。

在一些实施方案中，将三种标记与样品混合。在一个示例性的实施方案中，遗传物质可以是ES和MEF染色质。第三QD标记的抗体可以加入到分析中以探测RNApolII。通过将该抗体与QD-抗-H3K4me3和QD-抗-H3K27me3组合，该方法提供了使表观遗传标记放置与标记的基因表达能力相关联。此外，基因组可以针对DNA甲基化和H3K27me3的重合被询问。

在一些实施方案中，样品在没有除去游离染料和/或游离标记的情况下通过系统来处理。游离染料和/或游离标记可以通过利用多种特性的时间相关的或同时的探测由系统适当地表征。在本发明的其他实施方案中，游离染料和/或游离标记在分选之前从样品除去。游离染料和/或游离标记在样品中的浓度可以是大约、小于大约或大于大约0.01、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、9、10、15、30、50倍的与物体或遗传物质络合的染料和/或标记的浓度。

流体运动

可以包含已经用一种、两种、三种、四种或更多种标记进行标记的感兴趣的遗传物质的样品，可以被装载入本发明的设备中，用于探测和分析。样品可以被装载到设备上的输入储器中。当样品运动通过设备时，样品可以形成连续的液体主体。携带遗传物质的流体或单独的遗传物质可以使用外部压力源、内部压力源、电动学、磁学或其一些组合被定向通过通道。外部压力源或内部压力源可以是泵，例如蠕动泵、注射泵或气动阀泵。遗传物质流和/或携带遗传物质的溶液流可以被反向。反向可以通过使电压梯度的极性反向和/或使泵送动作反向来实现。

染色质通过纳流控设备的流动可以使用被施加到设备的储器的电压来电动地引起。在这些设备内部的流速可以精致的准确度被控制在宽的范围内。流速可以被控制至大约或超过约0.00001、0.00005、0.0001、0.0005、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10、50、100、500、1000、5000或10,000fL/s或μL/s的准确度。流速可以是大约、小于大约或大于大约0.00001、0.00005、0.0001、0.0005、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10、50、100、500、1000、5000或10,000fL/s或μL/s。这不仅提供了增加DNA和染色质处理量的速率的机会，而且这将允许使用电方法来进行迅速的单分子分选。Y形的分离室可以被放置为紧接探测区域，即，谚语式的“道路中的分叉”。在一些情况下，更多分支的分离室可以被并联地或串联地利用以实现更大数量的流出道或收集室。通过简单地增加分叉中的相应部件中的偏压，流速可以优选地被增加和被定向至一个分支或分叉中的其他分支。这样，分子被分选向用于最后收回的所需的路径。该控制方法是简单的且可以被应用到DNA或染色质片段，DNA或染色质片段结合至报告表观遗传状态的抗体连接的荧光团。

在本发明的其他实施方案中，物体的流动可以被反向。这可以允许在单一探询容积内对物体进行多于一种测量。可选择地，多个探询容积可以被放置在通道内，在分支点之前，使得在分选或表征事件之前，对物体进行相同特性的多次测量。例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个或更多个探询容积可以被定位在分支点的上游，由此允许用于确定如何分选或表征物体的相同的两种、三种、四种、五种或更多种特性的多次测量。

照亮和探测

在一个方面，本发明提供了用于探测遗传物质的特性以进行表观遗传分析的方法。特性可以使用一种或多种标记来探测。标记可以在一个或多个探询区内被探测。探询区可以是相同的或不同的探询区。在一些实施方案中，染色质和/或单个分子可以同时地针对DNA甲基化和组蛋白改性被探询。

在一些实施方案中，本发明提供了各种分子特性的同时的或时间相关的探测的方法，分子特性包括但不限于，荧光例如量子点荧光特征。如本文描述的，物体的特性可以使用各种探测技术来测量。探测步骤可以测量光学的、电的、放射性的、物理的(例如，尺寸、密度、热导率、弹性、粘度和强度)和/或磁性特性。荧光特征可以被实时观察且实际上用作触发事件以控制如本文提供的分选方法。

探测步骤可以包括探询或检查在界定容积内的物体。界定容积可以被称为探询容积、检查容积或探测容积。在一些实施方案中，当探测光学信号时，探询容积是光学容积。探测步骤可以包括测量来自物体的一种、两种、三种、四种、五种、六种或更多种特性或信号。例如，物体可以具有取决于物体的状态而变化的不同的可测量的特性。这些可测量的特性可以是物体所固有的，或可以由与物体络合的一种或多种标记赋予。可以与物体络合的标记的实例包括与在包含核酸的染色质上的表观遗传标记物络合的荧光标记抗体。

探询容积可以通过用一种或多种光束照亮通道来产生。光束可以来自一个、两个、三个、四个或更多个光源。一个或多个光源可以发射照亮在一个或多个通道内的一个或多个区域或容积的一种或多种光束。光束可以通过光学部件例如高数值孔径物镜来聚焦。照亮通道的光束可以产生由通道的壁和光束界定的一个或多个检查容积。光束和通道的尺寸可以限制检查容积的尺寸，如图3所示的。检查容积可以具有大约、高达大约或大于大约0.01、0.05、0.1、0.2、0.5、0.75、1、5、10、25、50、75或100飞升的容积。

物体或遗传物质的特性的探测可以以同时的或时间相关的方式来进行。同时的探测可以通过在某一时间瞬间测量物体的两种或更多种特性而发生。例如，光的对应于两种不同标记的两个波长可以在单一探询容积或重叠的探询容积中被测量。可选择地，物体的两种或更多种特性可以在不同时间被测量。如果当物体沿着通道行进时物体在通道内的位置可以是已知的、预计的或估计的，那么这可以进行。例如，第一特性可以在位于第二探询容积上游的第一探询容积处被测量，在第二探询容积测量物体的第二特性。来自第一探询容积的信号和来自第二探询容积的信号的相关性可以基于物体通过通道的速度和在两个通道之间的距离。这样，物体的2、3、4、5、6、7、8、9种或更多种特性可以同时地或以时间相关的方式被测量。

所测量的信号可以具有大约或大于大约1、2、3、4、5、10、50、100、200、300、400、500、1000、5000或10,000的信噪比。信噪比可以基于探测器的分辨率和/或准确度、光源、检查容积的尺寸、光源的功率和/或品质、用于照亮检查容积的光的量、用于表示遗传物质的特性的标记或其任何组合来确定。信噪比可以通过在平均光子噪声上方的信号来确定。统计显著的信号可以是在平均光子噪声上方至少约3倍标准偏差的信号。

分选

本发明的分选模块允许物体的探测和实时评估以及物体的收集。分选可以如在2009年8月6日提交的第61/231,979号美国临时申请、2010年2月24日提交的第61/307,827号美国临时申请、2009年8月6日提交的第61/231,963号美国临时申请和2010年6月28日提交的第61/359,266号美国临时申请以及同此一起提交的在律师客户档案号32497-715.601之下的共同未决的案例中所描述的来进行，其中每个申请通过引用以其整体并入本文。物体的分选可以基于在探测期间测量的一种、两种、三种、四种、五种或更多种特性。特性可以同时或以时间相关的方式被测量。处理器可以用于解释在物体上收集的数据和确定物体的所需的流路。

分选可以允许探测和实时评估光谱的或其他单分子特征以及分离和收集这些特异性分子。在一些实施方案中，本发明的设备和方法提供在设备的高度限制结构(流控通道、纳米孔或其他)内检查的时间和光谱上重合的特征的高速评估。使用这些重合特征的单分子分离可以提供显著的特征，例如分离与蛋白质结合的核酸的特异性序列或在其他生物学物种或假荧光污染物的存在下分离分子的能力，全部具有极低比率的假阳性探测。

这样的实现的一个实例是确定染色质中结合的组蛋白的罕见的表观遗传修饰。本发明的方法和设备提供运动通过通道的序列的明确鉴定并通过分离提供这些分子的选择，甚至在常常伴随染色质链的其他细胞碎屑和蛋白质的存在下。

在其他实施方案中，本发明可以提供被分选的染色质的回收。该分选和回收可以通过整体平行的DNA测序提供用核苷酸序列特异性的测定、在极低数量的细胞中隐藏感兴趣的络合的表观遗传特征的基因组的区域。

在一些情况下，通过分析经标记的染色质提供的颜色特征可以实时被观察并用作触发事件以控制分选方法。常规的分选方法常常包括以10’s毫秒时间标度或更慢地运动的阀和门。在本发明中，超过2,000个分子/min的高处理量计数已经被证明，且这可以更进一步增加。因此，本发明允许高速分选方法。两个高速分选方法可以用于对分子的轨迹施加控制，一个方法是电的和一个方法是光学的。这些分选方法可以在使用分支的(例如Y形的)分离室来分选的纳流控通道中被实施。如果需要的话，另外的分支点可以被串联地或并联地合并，进一步增加了分选能力。

在本发明的一些实施方案中，电分选用于基于事件或分子特性的探测来分选分子。本发明提供了可以快速地切换被施加至分支流体通道的电压以将感兴趣的分子分离入收集容积中的设备。流体系统、电子切换的适当设计允许迅速探询分选系统中的大量分子。

本发明还提供了用于包括使用强激光束来保持或“钳出”粒子的粒子处理的光学技术的用途。强激光可以在本发明中用于分选分子。使用强红外激光来最小化对生物聚合物的光损伤和使用高数值孔径光学装置来产生被紧密限制的光势阱，可以捕集QD-染色质偶联物。该技术可以在本设备的分支分离室内部被应用，且然后激光位置可以被偏转以控制粒子轨迹，以便分选。光学的分选技术可以通过利用荧光团、粒子或量子点的介电特性在纳流控设备中以单分子水平来进行。在一些情况下，该分选技术可以使用使分子以界定的方向流过激光器的恒定的外加电压来进行。该分选技术提供超快的分选——具有可以仅受流体力而不是分选激光器偏转限制的速度。光学势能捕集中的力常规上在10-100pN左右，且在该情况下，可以横向施加至流动方向。在高处理量条件下在我们的纳流控中的流速，标称对20nm直径粒子给予了约10pN的斯托克斯阻力。这表明QD在流动的存在下的偏转是可能的，尤其是因为进入适当方向的偏转仅需要可能的捕集力的一部分。用于高速激光偏转和转向的各种方法通常用于光学相控阵列领域，且偏转速率可以扩展到兆赫范围，快于单分子计数事件的千赫频率的数量级。我们的方法允许以接近流控结构内部的基础极限的速率的超快分选控制。

分支分离室和电或光学的分选方法在回收特异性染色质序列方面提供了前所未有的纯度水平和速度。用于该分选方法的触发事件是基于在激光检查容积内在激发期间生成的QD颜色特征。所发射的荧光使用高速、超灵敏的光探测器例如雪崩光电二极管(APD)来观察，光探测器输出表示所观察的光子的数量的数字信号。为了启动实时分选触发信号，可编程高速硬件单元可以进行迅速的决策过程。现场可编程门阵列(FPGA)或其他逻辑设备可以结合若干操作来进行最终的分选决策。表示荧光的输入信号可以使用积分器操作来收集且然后被缓冲至比较器以判断是否已发生单分子事件。该操作可以针对每一个荧光颜色和相应的光探测器同时地进行。当用户指定的用于分选的条件满足时，分选触发被输出到可调节的电压供给(电分选方法)或输出到相控阵列，使红外激光器偏转(光学分选方法)。

设备

本发明提供了用于分析遗传物质的系统和设备。在一些情况下，系统和设备可以用于对染色质进行表观遗传分析。本发明系统通常包括以下部件：通道，其适合于将物体保持在所述通道中的连续液体主体中；一个或多个光源，其配置成照亮通道以产生一个或多个探询容积；和探测模块，其配置成探测表示在所述一个或多个探询容积中的物体的两种不同的特性的至少两种类型的信号。物体可以是染色质或单一核酸分子。

在一个方面，本发明提供了一种用于表征单一核酸分子或染色质的系统，该系统可以包括：通道，其配置成保持所述分子；一个或多个光源，其配置成照亮通道以产生一个或多个探询容积；探测系统，其配置成探测表示来自所述一个或多个探询容积的所述核酸分子的两种不同的特性的至少两种类型的信号；和处理器，其被编程为提供来自所述一个或多个探询容积的至少两种类型的信号的实时的时间相关的分辨率，由此表征所述单一核酸分子。

本发明还提供了一种用于表征物体的系统，该系统可以包括：通道，其配置成保持所述物体；一个或多个光源，其配置成照亮通道以产生一个或多个探询容积；探测系统，其配置成探测表示来自所述一个或多个探询容积的所述物体的两种不同的特性的至少两种类型的信号；处理器，其被编程为提供来自所述一个或多个探询容积的至少两种类型的信号的实时的时间相关的分辨率，由此表征所述物体；和用户界面，其配置成接收来自处理器的数据和显示所述数据，其中所述数据包括关于来自所述一个或多个探询容积的所述至少两种类型的信号的信息。

在一些实施方案中，系统和设备还可以包括下游分选模块。本文提供的可以是纳流控或微流控设备的设备，可以包括在流动通道中的Y形分支点，其具有将材料分选入在分支的两端中任一端处的储器中的能力。在一些实施方案中，本文提供的纳流控设备可以包括以并联或串联方式的多个(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多个)分支点，所述多个分支点还可以提供多个流出道或收集室。将带有特异性表观遗传标记的分子分选入单独的收集室可以允许它们的回收和测序。在一些情况下，全基因组可以在小于10小时、8小时、7小时、6小时、5小时、4小时、3小时、2小时、1小时、45分钟、30分钟、20分钟、10分钟、5分钟或更少时间内被分选。本发明的设备是相当稳定的，且数据可以被收集在已经被重复使用许多次(例如1、2、3、4、5、6、10、15、20、25、30、35、40、50、75、100、1000、10000次或更多次)的设备上。

通道

本发明的设备可包括一个或多个通道或流路。可使用各种技术——包括微制造和纳米制造技术——来制造通道。通道可由各种衬底——包括但不限于硅石、镜抛熔融硅石、硅、石英、玻璃或聚合材料(例如，PDMS、塑料)制成。通道可被蚀刻、烧蚀、模制到衬底中。通道或流路可被涂覆。涂层可改变通道的特性，并可被图案化。例如，涂层可以是疏水的、亲水的、磁性的、顺磁性的、传导的或功能化的，取决于待分选的物体。涂层或络合、偶联或结合到涂层的材料可展示对一种或多种类型的物体的亲和性。涂层或结合到涂层的材料可减小物体对通道的粘附性。涂层材料的例子包括PTFE。通道可具有形成为像圆、椭圆、矩形、方形、梯形、三角形、五角形或任何其它形状一样的横截面。通道可具有一个或多个横截面尺寸，例如高达大约、小于大约或大约10、20、30、40、60、80、100、200、250、400、500、550、600、700、800、900、1000、1250、1500或3000纳米的直径、宽度和/或高度。通道的尺寸可被选择成高达大约、大于大约或小于大约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、75或100倍于待分选的物体的宽度。

一个或多个通道可在一个或多个分支点处彼此流体地连接。一个或多个通道允许在连续液体主体中或以可逆的方式(如上所述)分选物体。分支点可以是分叉，其中单个上游通道在分叉点处连接到两个下游流路或通道。如图27A所示，分选设备可具有多个分叉点。在本发明的其它实施方案中，一个或多个通道可在分支点处流体地连接到多于两个的下游流路或通道。如图27B所示，分选设备可包括在分支点处流体地连接到四个下游流路或通道的上游通道。在本发明的一些实施方案中，设备具有多个分支点，每个分支点具有两个、三个、四个、五个或更多下游流路或通道。分支点可具有相同或不同数量的下游流路。分支点可以是T形、Y形或其任何变形。通道可以是直的或弯曲的。通道可位于两个或三个维度中，使得所有通道在同一平面中，或相同的通道在不同平面中。

通道——包括下游流路和通道——可具有相同或不同的尺寸。下游流路或通道可具有与上游通道比较相同、更高或更低的横截面区域。通道的尺寸可被选择成维持通道内的流体粘性。在一个例子中，上游通道在分叉点处流体地连接到两个下游通道，且每个下游通道的横截面是上游通道的横截面的一半。

本发明的设备可以由借助于光学平版印刷术和等离子体蚀刻在熔融石英衬底上制造的具有亚微米宽度和高度的通道组成(图1)。在一个典型实验中，荧光分子通过电动流(比如仅在流体相中的凝胶电泳)驱动通过通道并由聚焦激光束激发，如图2所示的。从荧光团发射的光被收集并通过光探测器量化。这些实验证明了我们在我们的设备上进行生物分子的高处理量多色成像和定量分析、容易地适合于表观遗传分析的方法的能力。例如，图3描绘用流过通道的荧光染料标记的单一DNA分子。这是新颖的设计，因为其将所研究的样品急剧地降低至超过用单独的常规光学装置可能实现的极限的极限，并结合了流控结构以允许所有分子基于单个分子被迅速地和同等地分析。

用于分析和/或分选物体的通道和系统的其他实例可以在第2009/0050542号和第2009/0234202号美国专利申请、第6,927,065号、第7,405,434号和第6,833,242号美国专利以及第WO/2010/044932号PCT公布中找到，每一个专利通过引用以它们的整体被并入本文。

探测模块和光源

系统可包括配置成测量相应于待分析的物体或遗传物质的特性的信号的一个或多个探测模块。本文所述的探测模块可利用各种探测技术。探测模块可探测光、电、放射性、物理(例如，尺寸、密度、导热率、弹性、粘性和强度)和/或磁特性。探测器的选择可取决于所使用的标记的类型。例如，光探测器可用于探测荧光标记，且电导仪或电探测器可用于探测金属标记。在通过引用以其整体并入本文的第WO/2010/044932号PCT公布中描述了电探测系统的例子。电探测器可包括放置在探测区域附近的电线、纳米线、纳米管、晶体管或电容器。电探测器可由碳、硅、碳/硅或其它半导体材料制成。

利用物体的特性的光学探测的探测模块可包括光探测器或光电探测器。光探测器可以是CCD、CMOS阵列、光电倍增管、雪崩光电二极管(APD)、单光子计数模块、光敏电阻器、光伏电池、光敏晶体管、LED和其任何组合。

探测模块可以包括配置成照亮通道的一、二、三、四或更多个光源。光源可以配置成产生一个或多个探询容积。光源可包括激光器、LED、荧光灯、白炽灯、卤素灯、气体放电灯和/或高强度放电灯。一个或多个光源可发射照亮一个或多个通道内的一个或多个区域或容积的一个或多个光束。光束可由光学部件例如高数值孔径物镜聚焦。照亮通道的光束可产生由通道的壁和光束限定的一个或多个检测容积。光束和通道的尺寸可限定检测容积的尺寸，如图3所示。检测容积可具有大约、高达大约、或大于大约0.01、0.05、0.1、0.2、0.5、0.75、1、5、10、25、50、75或100飞升的容积。术语检测容积也可称为探询容积、光学容积或探测容积。探询容积可以被按尺寸制造成保持单一物体、单一染色质或单一核酸。在一些实施方案中，探询容积可以被按尺寸制造成仅保持单一物体、单一染色质或单一核酸的一部分。

光源可在探询容积内产生高达大约、大约或大于大约0.1、1、5、10、50、100、200、280、300、500、750、1000或2000μW的光束。

在一些实施方案中，多个光束将不同频谱或波长的光发射到通道中的相同或不同位置上。光束可产生重叠的探询容积或不同的探询容积。光束可具有大约、小于大约或大于大约通道的宽度的直径。在一些实施方案中，光束可比通道的宽带宽大约、高达大约或大于大约1、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9或10倍。光束的宽度可被选择成使得通道内的光实质上是均匀的。

探测模块还可包括一个或多个光学部件。例如，探测模块可包括一个或多个高数值孔径物镜或透镜、光纤、反射镜、分色镜、光栅和共焦孔径。光源、探测器和光学部件的布置可允许一、二、三、四、五、六或更多个信号的探测。该探测可以是同时的或时间相关的。时间相关和/或时间依赖性信号的分辨率和/或准确度可以高达大约或大约0.0001、0.0005、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10、50、100、500或1000毫秒。时间相关和/或时间依赖性信号的分辨率和/或准确度可以高达大约或大约0.0001、0.0005、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10、50、100、500或1000微秒。时间相关和/或时间依赖性信号的分辨率和/或准确度可以高达大约或大约0.0001、0.0005、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10、50、100、500或1000纳秒。

一个或多个探测器可配置成将关于一个或多个所探测的信号的信息传输到处理器。处理器可以是可编程逻辑设备、计算机、或可记录或解释信号的任何其它部件。处理器可以是本文所述的分选模块的部件。

处理器和计算机系统

系统可包括处理器，其解释由探测模块测量的一个或多个信号和/或使物体定向到多个下游通道或流路的一个。由探测模块或探测器传输的信息可由处理器接收。处理器可以是计算机或可编程逻辑设备，例如现场可编程门阵列(FPGA)、可编程序阵列逻辑(PAL)、通用阵列逻辑(GAL)或复杂可编程逻辑器件(CPLD)。处理器可在大约、高达大约或大于大约15、25、50、60、75、100、200、500、1000或2000Hz、MHz或GHz处操作。在一些实施方案中，处理器是可解释数据并在小于大约1×10^-2、2×10^-2、1×10^-3、1×10^-4、1×10^-5、1×10^-6或1×10^-7秒内返回指令的FPGA。处理器可被编程为接收信号和/或基于所述信号使物体定向到多个下游流路中的一个。用于将物体分选到一个路径或另一个的条件可由用户经由计算机系统或另一设备上的用户界面编程到处理器中。用于表征和/或分选物体的条件可包括二、三、四、五、六或更多个信号的同时或时间相关的探测。在预先选择的阈值之上的多于一、二、三、四、五、六或更多个信号的探测可用于区别物体。在一些实施方案中，信号相应于物体的光、电、磁、放射性或物理特性。所测量的信号可表示物体的不同特性。

处理器可解释数据以确定如何分选物体并将指令传输到分选进行器或将物体的特性的信息传输到计算机或记录设备。处理器可解释在位于上游通道中的一个探询容积处获得的数据，并将指令提供到分选进行器以在一、二、三、四、五或更多个分支点处使物体定向到多个下游流路中的一个。处理器可解释在一个探询容积处获得的数据，并将指令返回到分选进行器以在紧邻探询容积和/或在探询容积下游的分支点处使物体定向到多个下游流路中的一个。分支点可以是远离探询容积的已知的距离、容积或时间。在探询容积和分支点之间的距离、容积或时间的精确知识可允许物体的准确和/或精确的分选。在探询容积和分支点之间的距离、容积或时间的减小可增加分选的精确度和/或准确度。

分选进行器可通过改变物体的轨迹或流路来进行物体的分选。分选进行器也可改变物体或携带物体的流体的轨迹或流路。分选进行器可通过物理地改变通道内的流路和下游流路或通过传递磁性、电或光学力来分选物体。在一些实施方案中，分选进行器可包括施加在物体上的电动力的一个或多个电极。可选地，分选进行器可包括改变携带物体的流体的流路的一个或多个阀。阀可以是气动阀、机械阀、磁性阀、旋转阀、液压阀、压电阀、梭式阀、弹性阀和电阀。在一些实施方案中，电极也可用于改变携带物体的流体的流路。静电学还可用于改变物体的流路。光镊也可用于通过将物体放置在一位置上以沿着多个下游流路中的一个流动或使物体朝着多个下游流路中的一个偏转来改变物体的流路。光镊可在本发明中用于使用聚焦的光束例如激光器来俘获和移动物体，例如分子或细胞。

系统可以可操作地连接到具有用户界面的计算机，用户界面用于控制分选系统(例如，探测模块和分选模块)、给可编程逻辑设备编程并显示结果。计算机可以是本发明分选系统的整体部分或分离的部分。用户界面可以是图形用户界面。用户界面可通过探测器显示测量、物体的分析和物体的分选，这可以是实时的。用户界面可允许选择操作条件，例如电压梯度、分选条件、信号阈值、总分选时间、光源功率和探测器校准。操作条件可使用键盘、鼠标或其它输入设备来输入。

在本发明的一些实施方案中，分选系统包括用于分选在分选期间由处理器和/或探测器传输的数据的存储模块。存储模块可在分选期间或在分选之后被访问以取回在分选期间收集的数据。

本文描述的分析系统还可以包括用于用户对话和数据取回的计算机系统。计算机系统可以具有用于输入实验参数和显示分析结果的用户界面。用户界面可以实时显示数据。计算机系统可以具有用于显示用户界面和显示实时数据显示设备。

示例性应用

本发明系统提供了一种以单一物体水平分选和/或分析物体的有效工具。本发明系统找到了广泛的应用，包括但不限于，遗传分析例如染色质的表观遗传分析、细胞、核酸分子、蛋白质、碳水化合物、脂质的分选和其任何组合。

量子点的探测

本发明的具有亚微米尺寸的流控通道可以用于分离、探测和鉴定与有机荧光团偶联的单个量子点(QD)。通道可以在熔融石英中被制造成具有100、200、300、400、500、600、750或1000nm平方横截面。所得到的约100-1000阿升(attoliter)的聚焦容积降低了荧光背景并增加了单分子探测的信噪比。通道允许迅速探测50％、60％、75％、90％、95％、99％、99.5％、99.9％或更多的经过聚焦容积的QD和有机荧光团。

QD偶联物可以被电动地驱动通过通道、用单波长激光器激发并用共焦显微镜探测。可以同时收集来自光谱的绿色区域和红色区域的荧光发射。通过量子点的窄的和对称的发射光谱来最小化信号抑制(rejection)。对于单分子结合的有效的多色探测和表征，QD可以结合至AlexaFluor488(AF488)分子并被单独探测，如图6所示的。具有亚微米尺寸的流控通道和作为荧光标记的QD的联合导致了有效的和快速的多路单分子探测和分析。

甲基化状态的分析

使用纯化的哺乳动物DNA分析DNA甲基化状态可以使用本发明的设备和方法来进行。此外，本发明的设备和方法提供了哺乳动物染色质的分析。还进一步地，本发明的设备和方法允许同时分析多个表观遗传标记(多路分析)以评估它们的频率和重合。例如，胚胎干(ES)细胞和小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)细胞染色质可以同时地针对若干标记被分析，包括：DNA甲基化、DNA羟甲基化、H3K27me3；H3K27me3和H3K4me3；和H3K27me3、H3K4me3、结合的RNA聚合酶II(RNApolII)、结合的SWI/SNF和任何其他DNA或染色质结合蛋白质或任何其他已知的表观遗传标记物。这些标记已经牵连彼此的相互调节且还作为哺乳动物发展的基本的、协作的调节剂。本发明的另外部分是从染色质的这些高丰度源到低丰度源(即，被微切割的肿瘤、植入前胚胎和其他低丰度源)进行多路分析的能力。

使用QD标记分析甲基化的DNA

上述方法还可以用于在本发明的设备中使用QD-抗-甲基-C抗体和甲基化的DNA来分析真核生物源或原核生物源的甲基化的DNA。QD-抗体偶联物以约10pM(或1ng/ul的IgG质量抗体)的稀释浓度通过具有亚微米横截面尺寸的流控设备。应用+25伏的偏压以产生电动流。所观察的偶联物的数量平均为约100/min。使用更高的电压和抗体浓度(例如100、200、300、400、500、600、700、1000、10000或更大)，更高的分子计数速率是可能的。所观察的荧光猝发表示单个QD-抗-甲基-C偶联物(矮峰)和偶联物的小的结合聚簇(较高的峰，其高度大约为矮峰的数倍，图10)两者。

接着，甲基化的DNA用YOYO-1或TOTO-3和甲基化的DNA探测试剂例如QD标记的-抗-甲基-C抗体或标记的MBD1标记，并使混合物流过本发明的设备。这样，进行双色时间重合实验以直接地观察DNA(绿色，YOYO-1标记)上甲基化部位(红色，QD标记)的存在。DNA抗体混合物是以约90pM(或1ng/ul的DNA)的稀释浓度。可以清楚地鉴定在YOYO-1或TOTO-3-标记的DNA和QD-抗-甲基-C之间的重合(图11)。

在本发明的一些实施方案中，输入DNA可以从野生型ES细胞和缺失基因例如Dnmt1的ES细胞合子分离。Dnmt1突变体DNA具有它们的减少到在野生型细胞中看到的约15％的水平的总甲基化。当从Dnmt1-/-细胞成像DNA时，可以提供在QD-抗-甲基-C和YOYO-1信号之间的低频率重合。相反，来自野生型ES细胞的DNA可以提供强的DNA甲基化信号，与由野生型ES细胞中的DNA甲基化的标准限制性内切酶分析示出的一致。已经用SssI甲基转移酶处理的Dnmt1突变体ES细胞DNA还可以增加DNA甲基化信号的水平。

基因表达分析

在还其他实施方案中，本文提供的方法和设备可以提供细胞或组织的基因表达分析。本发明可以适合于来自包括RNA或mRNA的任何源的样品的基因表达分析。在一些情况下，本发明可以可特别地用于来自低丰度或限制源例如被微切割的肿瘤、植入前胚胎、胚泡、干细胞或胚胎干细胞的样品的基因表达分析。在一些情况下，基因表达分析可以通过以下来提供：使包括经标记的RNA(例如经标记的mRNA)的样品与本发明的设备接触，使RNA流过或推过包括探测区域的亚微米通道和探测经标记的RNA。在一些情况下，探测可以提供单分子分辨率。在一些情况下，RNA还可以与特异性地结合至RNA的特异性序列或鉴定RNA的特异性序列的第二标记或探针或其种群例如寡核苷酸探针或寡核苷酸探针种群接触。在一些情况下，探针可以包括第二标记。在一些情况下，经标记的RNA和经标记的探针的时间重合探测可以提供基因表达分析。在一些情况下，该时间重合探测可以提供高处理量基因表达分析、定量基因表达分析或单分子分辨率的基因表达分析中的一种或多种。

全基因组分析

除了确认哺乳动物DNA的甲基化可以以高的灵敏度和特异性来探测之外，值得注意的是，本发明还可以展示跨过基因组例如ES细胞基因组例如小鼠或人类ES细胞基因组存在的DNA甲基化的频率和密度。当前估计值表明哺乳动物基因组中60-80％的CpGs是甲基化的。但因为仅基因组的0.1％已经针对DNA甲基化状态被直接测试，所以携带甲基化的DNA片段的比例和甲基化每片段的密度是未知的。本发明可以展示以下信息：非常大量的经标记的DNA片段可以被探测且可以对每一个片段探测甲基化密度，其与每片段的猝发强度成正比。设备同时保留它们的功能达数星期。在比运行琼脂糖凝胶所花的时间更少的时间内，本发明提供了可靠取样和对表示全哺乳动物基因组的单个DNA片段成像。

DNA分级和DNA的标记

可以在本发明的设备上进行单分子DNA片段分级。例如，λDNA标记物可以用HindIII消化以形成具有在约600bp和27,000bp之间的已知长度的片段。片段可以用嵌入染料例如YOYO-1、TOTO-3、SyberGreen、溴化乙锭或任何其他合适的染料标记，并被电动地驱动通过它们被聚焦激光器单独探询的通道。分子可以高达1mm/s、2mm/s、5mm/s、10mm/s、20mm/s、40mm/s、50mm/s、75mm/s、100mm/s、250mm/s、500mm/s或更高的速率被均一地驱动，允许1,000；2,000；3,000；4,000；5,000；6,000；10,000；15,000；20,000；30,000；50,000；75,000；100,000或更多个分子每分钟的分析速率。因为分子用荧光嵌入染料来均一地染色，所以当每一个分子流过激光点时由每一个分子发射的光子的数量与其长度成比例。图5A和图5B示出从各种片段尺寸收集的光子(猝发尺寸)的数量以及在猝发尺寸和已知的片段尺寸之间的所测量的线性关系。还将使用该技术的片段分析与凝胶电泳进行比较，导致极好的一致性。

甲基化的DNA和未甲基化的DNA的分选

本发明的设备可以用于分选是未甲基化的或被使所有CpGs甲基化的SssI甲基化的DNA(例如，被HindIII消化的λDNA)的混合物。DNA可以用DNA特异性染料例如YOYO-1或TOTO-3和用甲基化的DNA特异性标记例如QD-抗-甲基-C标记。然后，DNA片段可以根据如由QD-抗-甲基-C报告的它们的甲基化状态来分选。以4,000片段每分钟的分选速率，可以在一分钟内分选七个λHindIII片段中的每一个的大约600拷贝。然后可以使用输入混合物、被分选的甲基化的DNA和被分选的未甲基化的DNA以及七个片段中的每一个的测序引物来进行亚硫酸氢盐测序。还可以对输入混合物、被分选的甲基化的DNA和被分选的未甲基化的DNA进行焦磷酸测序。

小鼠或人类DNA还可以通过使用约20,000bp片段尺寸作为输入来分选。输入DNA可以是来自携带Dnmt1突变的ES细胞的DNA和来自野生型或其他突变体ES细胞的DNA。Dnmt1突变体DNA具有它们的减少到在野生型细胞中看到的约15％的水平的总甲基化，然而，在高度重复的IAP元件(＞1,000拷贝，在小鼠基因组中)中，甲基化被降低至基本上不可检测的水平。被分选样品可以具有足够的材料来用于通过焦磷酸测序的亚硫酸氢盐分析。

小鼠或人类染色质还可以通过本发明的方法来分选。例如，识别各自结合于光谱不同的QD的H4K20me3和H3的抗体可以用于将染色质分选成两个种群，一个富含两种标记，且另一种缺乏H4K20me3标记。使用对感兴趣的基因组区域特异性的引物的实时PCR还可以用于测量相对于未被分选的输入材料的在两个被分选的种群中的感兴趣的该区域的含量。

ES染色质还可以使用两个单独的表观遗传标记例如诸如H3K4me3和H3K27me3的抗体来分选。这些是限制染色质在ES细胞中的二价体状态的标记，如通过ChIP-Chip和通过ChIP-Seq确定的。在确保至少1X基因组覆盖的分选之后，被分选的材料可以通过本领域已知的任何方法来测序，包括使用Solexa或454测序技术。因此，本文的设备和方法可以用于同时地分析来自低丰度源的材料和分析多个表观遗传标记。

解析树状大分子样DNA

双色单分子光谱学可以通过本发明的方法和设备来提供，本发明的方法和设备还被证明用于解析用荧光团量和颜色的不同组合标记的“树状大分子样DNA”。这些树状大分子是合成的支链DNA分子。这些数据证明在本发明的设备上进行DNA的定量的同时的多色分析的能力。具有两个不同的波长例如诸如488nm和568nm波长的重合激光器可以聚焦在亚微米流控通道上以进行重合的荧光团发射强度的测量，参见图7A和图7B。核酸设计的(NAE)标记主要由标记至每一个Y形DNA亚基的AlexaFluor488和BODIPY630/650组成(图7A和图7B)，然后Y形DNA亚基被组装成更大的树状大分子样网络。为了低的自身荧光背景，流控通道由熔融石英衬底构造。检查容积被均一地照亮，且分析物流用电动驱动器来控制，允许每一个分子被同等地激发。关于树状大分子样DNA的分辨率的更多内容在Stavis等人，Detectionandidentificationofnucleicacidengineeredfluorescentlabelsinsubmicrometrefluidicchannels(在亚微米流控通道中探测和鉴定核酸设计的荧光标记)，2005Nanotechnology16S314-S323中描述，其据此通过引用以其整体并入。

PCR产品的分析

以单分子水平的时间和颜色重合光谱学在PCR产品的研究中可以具有实际应用。这些实验证明了我们同时在我们的设备上使用DNA进行定量多色分析的能力。在该实验中，消除了通常在PCR反应之后进行的扩增子产物的纯化。引物分子可以各自用本领域已知的任何染料标记，例如用绿色(AlexaFluor488)或红色(AlexaFluor594)荧光团标记，而扩增子产品合并了两种颜色，如图8A所示的。在图8A中，被标记的引物用附属于引物的浅色或深色的阴影圈来表示。根据时间和颜色重合，单分子的分离和测量允许引物和扩增子被原位辨别。该探测证明了极限灵敏度、附接于单分子的单一荧光团和～1,000分子/min的计数速率。以该灵敏度水平探测荧光的能力表明表观遗传标记可以在具有低密度的那些标记的染色质片段上被探测。对来自PCR反应的在0次和40次循环之间的每四个循环的样品研究了重合。对每一个测量循环中的引物种群，比较了重合事件的频率，并用于再产生典型的PCR扩增曲线(图9)。该方法还可以应用到未被扩增的核酸样品。

实施例

实施例1.用于单分子分析的纳流控平台。

用于甲基化的DNA和染色质的单分子高处理量分析的一种策略可能需要结合至包含感兴趣的表观遗传标记的单个分子的荧光标记的时间分辨探测和光谱鉴定。我们使限制在纳流控通道内的溶液中的DNA和染色质流动并对其探测。这些通道减少荧光分析的光学激发容积，因此允许我们探询相对高的浓度的溶液中的单个分子。使用光刻蚀法和反应性离子蚀刻在熔融石英衬底中制造纳流控通道。图1C示出通过该工艺制造的单一纳流控通道，具有约250nm宽×500nm深的横截面尺寸。我们在100mm直径的晶片上形成27个单独的流控通道阵列，每一个具有16个平行通道。每一个阵列还具有入口端口，在通道的端部处具有储器，我们将其用于装载样品以及插入用于控制电动流动的电极。

为了分析流过通道的DNA和染色质的单个分子，我们将二氧化硅晶片安装在激光共焦显微镜上并用两个各自具有约1.3m直径的重叠高斯形激光剖面照射流过单个通道的样品(图17)。激光剖面大于通道宽度，使得用相同的照亮剖面来探询每个荧光分子。在通道内的所照射的检查容积是0.16fL。当每一个分子通过照亮剖面时，发射与不同的经标记的组分相关的荧光的猝发。用滤光器分离、且然后用雪崩光电二极管探测器探测构成分子的特征的颜色。以100kHz将红色和绿色荧光猝发的记录累积在个人计算机上，且然后用定制的Matlab算法分析以确定单分子探测(SMD)事件。

实施例2.天然染色质上的核小体探测。

该实验阐明染色质可以被定向为通过纳流控通道且保持完整，使核小体保持附接在DNA上。对于该测试，我们使用从带有表达H2B-GFP(绿色荧光的蛋白质)融合蛋白的转基因的HeLa细胞提取的染色质。合并到核小体中的H2B-GFP允许染色质发荧光。我们使用标准方法从细胞制备天然染色质，用微球菌的核酸酶(MNase)处理经分离的核且然后使用高盐缓冲液提取可溶的天然染色质。我们接着用TOTO-3标记在我们的染色质制剂内的DNA，TOTO-3是光谱上不同于GFP的红色核酸染色剂。出于两种原因，我们希望分析该双标记的染色质。第一，它允许我们确定染色质在纳流控电动流动期间是否保持完整，这对于将该方法成功应用于表观遗传分析来说是必不可少的。完整的染色质产生表示DNA和组蛋白结合的时间重合的TOTO-3和GFP荧光的SMD事件。第二，已证明以高速率进行染色质的同时多颜色探测。

图18阐明使用在5minMNase消化之后提取且然后以50V驱动通过纳流控通道的染色质的0.25sSCAN。顶板示出对应于标记DNA的TOTO-3的光子猝发，同时底板示出标记H2B的GFP荧光。为了确定所示出的单分子峰(图18)，相差小于200μs的连续光子到达时间被分组为猝发。该时间是分子通过检查容积所需要的时间的约三分之一。具有总计10个或更多个光子的猝发被标明为SMD事件。仅用缓冲液探测到的平均噪声是0.22光子/50μs。通过拟合TOTO-3SMD事件的持续时间的直方图(图21)，计算出2.2mm/s的速度。因为样品溶液被装载到连接于阴极的储器中，仅携带净负电荷的分子被驱动到通道中。在所使用的pH8.0缓冲液中，仅无组蛋白的DNA和完整的染色质携带净负电荷。在这一pH下每个都大于16.5的单个游离组蛋白的净正电荷(参见支持信息)致使它们保持在装载储器中。图18中示出的时间重合的SMD事件由跨越图表的阴影的竖直棒标记，其中的大部分是完整的染色质。通过使用实现多于20dB的绿色GFP猝发与红色TOTO-3猝发的光谱分离的滤光器来实现双标记的染色质的准确鉴定，在探测期间基本上消除了荧光谱串扰或渗透。

近似地，所鉴定的所有GFP分子中的93％与DNA分子重合，表示在我们的纳流控设备内在电动流动期间染色质保持完整。使用TOTO-3以1∶5的染料比碱基对的比率来得到该重合度，这提供了最高的荧光强度，同时不从染色质分离组蛋白。以1∶10和1∶15标记比率进行另外的测量(实施例15中的表2)，产生相似的重合水平，进一步阐明该标记不分离组蛋白。我们观察到，TOTO-3信号的约三分之一不与GFP重合。该分子种群应该起因于已知存在于基因组中的未消化的和无组蛋白的连接体DNA，且还起因于仅包含内源性的未标记的H2B的完整染色质；细胞中的H2B的半数由GFP融合转基因制成。

为了使用SCAN来进一步测试染色质探测的可靠性，我们从来自野生型HeLa细胞的核和具有H2B-GFP转基因的HeLa细胞的混合物制备染色质，对所有的混合物保持恒定细胞总量。我们预期，重合速率应随着增加野生型染色质的量而下降，产生较少的H2B-GFP的片段。然后，通过SCAN来探测来自每一种混合物的片段，以确定存在于每一种混合物中的双色标记的染色质的部分。我们使用时间重合直方图(TCH)来编译在15min的时间段内所有的重合的SMD事件观察的记录(图19a)。TCH包含在固定的时间窗内在所有的确定GFP事件和TOTO-3事件之间的时间偏移。在峰下方且在背景水平上方的面积，描述总的具有H2B-GFP的染色质片段，其随GFP-HeLa核的比例而增加。我们发现，对于5min和15min消化系列两者，具有H2B-GFP的染色质片段的比例表现出随GFP-HeLa比例线性增加(图19b)。在具有H2B-GFP的染色质片段和GFP-HeLa核的输入之间的直接比例证实染色质的可靠探测。注意，两个消化时间的斜率不同，且延长的消化产生较小的斜率。由于在较长的消化时间产生的单核小体片段和连接体DNA片段的增加，大体上减少了每DNA重合。该趋势还符合其他染色质制备，其中较长的片段表明较高的重合比例。

我们观察到不同的MNase消化批次期间所制备的染色质片段的尺寸的变化。例如，在5min的MNase消化之后提取但在分离的日期从不同的GFP-HeLa细胞批次制备的GFP-HeLa染色质产生不同的片段尺寸，如凝胶电泳所证明的(图7和图8)。我们将此归因于MNase活性的变化。结果，对于具有高于2kbp的中值片段尺寸的样品，纳流控SCAN探测到每GFP93％的重合(图23中的5min泳道)；同时，对于具有小于2kbp的中值片段尺寸的样品，观察到50％的每GFP重合(100％GFP，图24中的5min泳道)。具有被消化成小于1kbp的片段的染色质的进一步SCAN(100％GFP，图24中的15min泳道)证明了每GFP35％的重合。如果变化形式在发生时被缩短，则可以使用不同的荧光标记方法来减轻，将SCAN延伸到短核小体片段的研究。

为了评估我们的纳流控设备(表1)的处理量，我们利用100％GFP-HeLa核的5min和15min消化的SCAN测量。将DNA和H2B两者的SMD的速率在15min的分析内平均。我们通过对每一分钟的SCAN进行背景修正TCH分析来计算双标记的染色质的时间重合的分子的探测速率。对于来自5min消化的染色质，相比于15min消化，所有的分子类型的处理量始终较高，且暗示较高的样品浓度。我们通过用指数模型拟合在给定颜色的每一个SMD事件之间的时间的直方图以计算样品浓度来验证这一观察(图22)。使用凝胶电泳分离地估计平均片段尺寸(图7和图8)，且然后将其与DNA探测速率组合以导出分析处理量。

表1.100％GFP-HeLa样品的纳流控SCAN处理量

MNase处理(min)	5	15
			DNA浓度(pM)^b	588±8	248±2

双标记的染色质(分子/min)^a	1067±114	201±36
			H2B(分子/min)^a	2116±143	568±67
DNA(分子/min)^a	6238±611	2287±184
			凝胶估计的平均片段尺寸(bp)^c	1600	500
DNA处理量(Mbp/min)^d	10	1

(a)在50伏特的电动驱动下的15分钟SCAN的分析。

(b)基于在SMD事件之间的时间的原位测量的DNA浓度

(c)通过凝胶电泳估计的片段尺寸

(d)将DNA探测速率和估计的片段尺寸用于计算DNA处理量。

实施例3：DNA甲基化的探测。

将已经用于表观遗传分析的探针用于在我们纳流控平台上探测表观遗传标记。我们分析DNA甲基化并将MBD1用作我们的探针，已经显示出MBD1明确地结合甲基化的DNA。我们的测试材料是来自甲基化缺乏的宿主的经HindIII消化的λDNA，我们保留该测试材料未被甲基化，或者使用SssIDNA甲基转移酶来体外甲基化。SssI可以甲基化48.5kbp基因组中的所有3,113CpGs。我们通过用甲基化敏感的限制酶HpaI消化DNA来验证了甲基化反应的有效性(图25)。两种DNA样品都用TOTO-3染色，且用MBD1温育，我们用AlexaFluor488标记MBD1。AlexaFluor488色谱上类似于GFP。AlexaFluor488标记的MBD1保留其对于甲基化的DNA的特异性(图26)。为了促进到甲基化的DNA的最佳结合，我们将摩尔过量的MBD1添加到经染色的DNA。我们发现，将该混合物稀释到我们的1×基于TBE缓冲液，得到稳定的电动流动，如重合的SMD速率和在探针和纳流控结构之间的低水平的非特异性相互作用所表明。

图20a阐明与未甲基化的DNA(上图)或甲基化的DNA(下图)混合的MBD1的重合SMD事件的数量。在所应用的100V电势下分析每一种混合物，持续15min。未甲基化的DNA样品中的重合事件的背景水平是由于存在于混合物中的过量的探针。然而，甲基化的DNA样品中的中心高斯峰示出，探测到经结合的MBD-DNA络合物高于高的背景。在需要时，可以通过结合本领域中的已知方法来进行本本发明方法的精细调整，以减少来自游离荧光探针的背景信号。

类似于染色质分析，我们验证了这些探测事件的可靠性。我们制备甲基化的DNA和未甲基化的DNA的稀释系列。我们预期，借助于递减的甲基化的DNA的量，我们应该观察到递减的重合事件的频率。这与我们的观察结果(图20b)一致。存在MBD-DNA络合物的数量随增加的甲基化的DNA浓度线性增加，证实了借助于MBD1的信号探测的特异性，且阐明了纳流控SCAN用于探测单个分子上的表观遗传标记的效用。

我们已经使用已经用于分子生物学中的全表观遗传分析的相同的荧光标记的探针来描述使用纳流控平台来分析单个分子的SCAN的发展。使用纳流控通道的限制(confinement)允许在100-1000pM浓度范围内进行单分子分析，这对于维持染色质结构来说是必不可少的。我们通过多色SCAN验证了，芯组蛋白八聚物在电动流动期间在该纳流控环境内作为核小体保持结合。野生型HeLa和GFP-HeLa核的稀释被用于确认重合探测的可靠性。我们使用单一流控通道观察到具有约10Mbp每分钟的处理量的染色质片段，表示我们可以在少至八分钟内SCAN真菌模型组织的整个基因组。我们预想使用具有数十或数百个流控通道的平行阵列来扩大我们的当前处理量以进行更大的有机体的分析。例如，使用10个流控通道将允许在仅30分钟内就扫描3Gbp人类基因组的1×覆盖。

纳流控通道横截面的进一步减少将允许以较高浓度的SMD，且增加了单分子荧光的分析的信噪比。因为随机地探测重合事件的概率与检查容积中的样品浓度相关，可以通过减少通道横截面来设计该概率。借助于充分窄的通道，可以拉长流动的染色质或DNA分子，允许空间上分离和分辨多个荧光的标记。这可以允许具有足以识别单一核小体上的多个表观遗传标记或区分邻近核小体上的标记的空间分辨率的分子图谱。先前工作已经示出在λDNA的快速流动期间114nm的分子长度的光学分辨率，等效于约335bp。使用具有0.01μm²量级(小于这些实验中所使用的量的量级)的横截面积的纳流控通道，该空间分辨率是可能的。很可能，较小的通道将允许我们用多个经结合的探针识别分子，并分辨它们在染色质片段上的位置。

实施例4：组蛋白电荷的计算

将四个芯组蛋白中的每一个的氨基酸序列输入到可在http://www.scripps.edu/～cdputnam/protcalc.html获得的在线计算器。该求解器提供各种pH值下每一个芯组蛋白的电荷，且16.5是pH8.0下与游离组蛋白相关的最小的正电荷。

实施例5.HeLa细胞染色质的制备

将作为单体的结构上表达组蛋白H2B(H2B-GFP)上的绿色荧光蛋白质的HeLa细胞在用5％胎牛血清补充的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)中培养。如下所述从HeLa细胞制备天然染色质片段：

简要地，刮下来自两个15cm板的细胞并用1XRSB(10mMTrispH7.6、15mMNaCl、1.5mMMgCl₂)洗涤一次，再悬浮在具有1％Triton-X100的5mL1XRSB缓冲液中，且使用配备有松杵的Dounce匀化器使用八个冲程来匀化。通过离心分离来恢复核，将其再悬浮在1.5ml缓冲液A(15mMTrispH7.6、15mMNaCl、60mMKCl、0.34M蔗糖、0.5mM亚精胺、0.15mM精胺、0.25mMPMSF和0.1％β-巯基乙醇)中，我们向缓冲液A添加15μL0.1MCaCl2以及1.5μL的微球菌核酸酶(3单元/μL)，并且温育各种时间，使用5μL的0.5MEDTA以停止消化。离心消化液，抛弃上清液，且将核的每一个140μL等分试样再悬浮在450μL10mMEDTA、50μL5MNaCl中，以溶解染色质。通过离心分离将可溶的染色质与不可溶的碎屑分离。对于DNA的凝胶分析，我们取60μL的染色质，添加24μLH₂O、6μL10％SDS和24μL5MNaCl，然后用苯酚-氯仿的1∶1混合物提取DNA，且通过1.5％琼脂糖凝胶电泳分析10μL上清液。我们使用荧光计来测量完整的染色质的荧光，并使用分光光度计来测量从染色质提取的DNA的量。这用于校准荧光计读数，允许在随后的染色质分离制备期间直接估计样品浓度而不需要除去组蛋白。在制备之间，校准是具有重现性的。

探针选择和标记对SMD很重要。我们最初对探测染色质特征的尝试使用了抗体。因为它们具有两个抗原结合部位，单一抗体分子可以交联两个染色质片段。以允许经典的沉淀反应的抗原和抗体浓度形成可以堵塞纳流控通道的聚集体。这可以通过使用大量过量抗体、或用于表观遗传标记的单价探针(包括抗体、适配子的Fab片段)、或单价探针例如用来携带单一甲基结合域的MBD1蛋白质来避免。

实施例6.甲基结合域(MBD1)蛋白质合成和标记。

用于1xMBD(pET-1xMBD)的细菌表达的质粒由在TheWellcomeTrustCentreforCellBiology，UniversityofEdinburgh，UK的AdrianPBird提供。根据生产商的使用说明，加以一些修改，使用变性和柱上复性循环，从100mL诱发的在Ni-NTA琼脂糖(Qiagen)上的BL21(DE3)培养物纯化重组体His6示踪的MBD1。

来自MBD1的甲基化敏感的结合域(MBD)被克隆到pET-30b质粒，以产生在IPTG诱发下表达的His-tag融合蛋白。溶解IPTG诱发的大肠杆菌(E.coli)，且纯化并在镍柱上再折叠融合蛋白。在纯化之后，使用标记游离胺的Invitrogen的微刻度标记试剂盒(A30006)用Alexa488来标记融合蛋白。进行三次另外的树脂纯化循环以更好地将游离标记纯化掉。用Southwestern槽的印迹来测定所标记的MBD探针的完整性(图26)。通过表明1.5染料每MBD的标记的平均程度的吸光度测量，我们相信，三个子群保留在所标记的混合物内：染料标记的MBD、游离未结合的染料和不具有染料的MBD。如果三个子群存在于染料标记的MBD溶液内，则经结合的MBD-DNA络合物的数量将被低估。

实施例7.λDNA制备和体外甲基化。

用HindIII消化并用SssI甲基转移酶体外甲基化来自在甲基化缺乏的宿主(PromegaD1521)中生长的噬菌体的λDNA，SssI甲基转移酶可以甲基化48.5kbp基因组中的所有3,113CpGs。通过对甲基化敏感的酶HpaII的消化的抵抗性来评估甲基化反应的有效性。

实施例8.MBD-DNA亲和反应。

以50ng/μL悬浮在1xTris缓冲盐水(1xTBS，50mMTRIS-HCl和138mMNaCl和2.7mMKCl，pH8.0)中的甲基化的DNA和未甲基化的DNA的混合物中，我们使用TOTO-3来进行DNA染色。然后，将约1μg的经标记的DNA稀释到包含具有2％牛血清蛋白和0.1％TritonX-100(v/v)的1xTBS的20μL的缓冲液中。然后，将以280ng/μL储存的且用AlexaFluor488标记的1μLMBD1的容积添加到DNA以便在摩尔过量的条件下进行结合反应。结合反应在室温下发生2小时。

实施例9.DNA标记。

我们使用细胞不可渗透的嵌入剂TOTO-3(Invitrogen)。通过根据生产商所描述的方法混合经稀释的DNA或染色质和经稀释的染料来进行标记反应。除非另外指出，以1∶5的染料比碱基对的比率制备所有的样品。在标记反应之后，样品避光保存，且在4℃下储存过夜。TOTO-3在结合之后呈现出显著的荧光增强，这减轻了对在标记反应后纯化以除去未结合的染料的需要。

实施例10.纳流控通道的制造。

在熔融石英衬底中制造纳流控通道。将投影光刻法(GCAAutostep200)用于图案化具有500nm临界尺寸的流控通道。该方法允许在100mm直径晶片上27个流控通道阵列、总计432流控通道的迅速图案化。使用反应性离子蚀刻(Oxford80，OxfordInstruments)来将在所开发的光致抗蚀剂中所形成的图案转移约250nm到二氧化硅中。在随后的过晶片穿孔期间，使用集中喷射氧化铝磨料来在通道的端部形成入口端口，流控通道被保护有光致抗蚀剂。用热的Piranha溶液(3H₂SO₄∶1H₂O₂)和RCA标准清洁剂(5H₂O∶1NH₄OH∶1H₂O₂，加热到70℃)清洁晶片表面。

进行与170μm厚的盖玻片晶片的直接接触结合以盖住流控通道。随后高温退火到1050℃永久地将大量熔融石英镜片结合在一起。光学级的环氧树脂(NorlandProducts)用于将流体储器连接到晶片表面。

实施例11.纳流控中的电动流动。

将样品保持在它们相应的储存缓冲液中，直到DNA标记和/或MBD结合反应。在这些反应之后，连续地将样品稀释在1xTris-硼酸盐-EDTA(1xTBE，89mMTRIS硼酸盐和2mMEDTA，pH8.0)中，具有以(w/v)计量的0.5％聚乙烯比咯烷酮(PVP)和以(v/v)计量的0.1％TritonX-100(两者来自SigmaAldrich，St.Louis，MO)的添加剂。最终的稀释将样品悬浮在600pM的估计浓度，标称为对于染色质样品为1-2ng/μL，且对于甲基化的DNA样品为约0.25ng/μL。缓冲液中的聚合物添加剂用于限制电渗流并防止与流控通道壁的非特异性相互作用而不使得蛋白质变性。我们将50μL的样品溶液加载到流控通道阵列的输入储器中，且然后连接到阴极。输出储器仅包含缓冲液溶液，且连接到阳极。对于所有的染色质样品，在应用100V的偏置电压下，且对于所有的甲基化的DNA样品，在应用50V的偏置电压下，使得样品在20min的预流时间期间建立稳定的电动流动，以确保在数据收集之前已经实现稳态流条件。检查每一种样品达总计15min，总是使用阵列内的相同流控通道。在单分子探测之后，在加载下一个样品之前，反复冲洗流控通道阵列达总计30min，且然后检查以验证荧光标记的分子的消失。用于染色质实验的流体通道阵列不再用于DNA甲基化实验。

实施例12.激光诱发的荧光共焦显微术。

使用配备有侧部激光器端口的倒置显微镜(IX-71，Olympus)观察单分子荧光。以488nm的330μW的激光器照射(Sapphire，Coherent)和以635nm的1300μW的激光器照射(Cube，Coherent)在自由空间中重叠，入射在双频带分色镜(488/647rpc，ChromaTechnology)上，且然后使用60x、1.2孔径浸没的物镜(UPlanSAPO，Olympus)来聚焦到纳流控通道上，且用电子倍增CCD照相机(Cascade512B，Photometrics)来辅助。双频激光陷波滤波器(NF01-488/647，Semrock)使得散射激光衰减且使得单分子荧光通过。使用50μm直径的针孔(pin-hole)(901PH，Newport)来进行共焦空间滤波。然后使用第二分色镜(FF560-Di01，Semrock)来在颜色上分离双色荧光，且然后通过带通荧光过滤器(525/50M和680/40M，Chroma)来过滤。然后使用100μm直径芯多模光纤(OZOptics)来收集每一种荧光颜色。由雪崩光电二极管(APD)以单一光子计数模式(SPCM，Perkin-Elmer)探测光子，且使用高速相关器(correlator.com)和个人计算机以100kHz记录。

实施例13.统计学分析。

进行传播误差分析以便评估已结合的分子、染色质或MBD-DNA相对于总的DNA的比例。第一，我们在时间重合直方图中定义包含高斯分布的整个宽度的窗口区域。靠近窗口区域的是边带，边带用于表征不相关的分子的背景。基于边带中的不相关的分子每50μsbin计算窗口区域中的背景贡献，报告为均值和标准偏差，且然后用在窗口区域内的bin的数量来归一化。对在窗口区域内计数的总分子求和，且用Poisson计数误差来报告。然后，通过从窗口区域内的背景分子减去总分子并传播误差来计算经结合的分子的数量。第二，计数所观察的总计DNA分子的数量，且用Poisson计数误差来报告。然后，计算经结合的分子和总计DNA分子的比率，并传播每一个的误差。如果适用，我们对平均值和代表传播误差的误差棒作图。

进行拟合误差分析以测量在纳流控通道内所测量的分子的浓度。将事件间的时间分离作图为直方图，且然后使用Matlab的内置拟合例程拟合到单项指数衰减。以95％置信区间计算所拟合的平均事件间的时间。然后使用Poisson模型来评估均值和置信区间，以描述在检查容积内的分子占有率，以报告浓度值。

实施例14.猝发持续时间和分子速度的计算。

所施加的电压在纳流控通道内产生将所装载的分子运输通过检查容积的电场。猝发持续时间描述分子通过检查容积的渡越时间。在这里，我们检查以5minMNase消化从100％GFP-HeLa核制备且在50V下被驱动通过通道的染色质分子的猝发持续时间。该数据是图19中所示出且从图24中所示出的染色质制备的那些的子集。单独地检查每一种荧光染料颜色的猝发持续时间(t)，且然后用具有用于平均猝发持续时间的自由参数μ和对应于猝发持续时间的标准偏差的自由参数σ的高斯模型拟合。以95％置信区间在每一图上提供所拟合的平均猝发持续时间。所使用的高斯模型是：

f = \frac{e^{- {(\frac{t - μ}{σ \sqrt{2}})}^{2}}}{\sqrt{2 {πσ}^{2}}}

给定大致的1.3μm的激光束直径(x_激光)和对于DNA和H2B分子分别为585μs和495μs的平均猝发持续时间(t_猝发)，我们使用计算出2.2mm/s和2.6mm/s的平均速度。进一步参见图21。

实施例15.嵌入剂对核小体完整性的影响。

以不同的标记比率将红色DNA染料TOTO-3添加到GFP-HeLa染色质，以检查嵌入对核小体完整性的影响。用5minMNase消化制备的染色质(图23)被稀释为约1ng/μL，且在50V下被驱动通过纳流控通道。对于三种不同的标记比率，即1∶5、1∶10、和1∶15的染料比碱基对，我们使用SCAN来分析用TOTO-3标记的DNA分子的数量和用GFP标记的H2B分子的数量。结果在下面的表2中示出。

表2.DNA分子标记的SCAN分析

我们观察到对于1∶5标记比率的约93％的重合，这是由Invitrogen为适当的嵌入而推荐的。在1∶10和1∶15的标记比率，我们观察到由于减少的嵌入效率引起的轻微减少的重合水平。因为在相同的流控通道检查所有的样品，且首先检查TOTO-3标记的样品，我们观察到低水平的到通道的熔融石英表面的TOTO-3吸附。这种所吸收的染料随后被未染色的染色质收集，且得到5.2％的重合探测速率。

实施例16.猝发分离和原位样品浓度的计算。

对于这些实验中所使用的稀释样品浓度，我们能够跟踪猝发分离。猝发分离描述在猝发之间所消逝的时间，且与所分析的样品的浓度相关。在这里，我们检查用5minMNase消化从100％GFP-HeLa核制备且在50V下被驱动通过通道的染色质分子。该数据是图19中所示出且从图24中所示出的染色质制备的那些的子集。分离地检查每一种荧光染料颜色的猝发持续时间(t)，且然后使用具有自由参数β、λ的指数模型。以95％置信区间在每一图上提供所拟合的平均猝发持续时间。所使用的指数模型是：

f＝βe^-λt其中λ＝CAv

在图22中示出数据。在该模型中，β是比例因子。所拟合的参数λ与‘A’和‘v’相关以计算‘C’即分子的浓度，‘A’是通道的横截面积(0.125μm²)，且‘v’是分子的流速。使用图21中所述的方法来导出流速，这得到原位测量的浓度，对DNA来说是588±8pM，且对H2B来说是248±2pM，如表2中所给出。

实施例17.通过凝胶电泳的DNA片段分级。

从HeLa核提取染色质且使用MNase来消化。随着增加的MNase处理持续时间，我们观察到染色质片段尺寸的减少，如凝胶电泳所验证。归因于MNase活性的制备中的批与批之间的变化，对于相同的消化时间产生不同范围的片段尺寸。例如，我们观察5min消化(图23)以产生大大高于2,072bp标记物的片段长度。然而，在稍后日期进行的一系列消化(图24)产生更分散的片段范围，标称上以在1-2kbp之间为中心。

实施例18.使用HpaII的体外DNA甲基化测试。

保留从甲基化缺乏的宿主(PromegaD1521)中生长的噬菌体制备的λDNA未被甲基化或用SssI甲基转移酶体外甲基化。作为甲基化反应的效能的测试，然后，用HindIII或用HindIII和甲基化敏感的酶HpaII两者来消化DNA的等分部分。对于DNA甲基化，对HpaII的消化的抵抗性是明显的。在图25中示出HindIII片段的碱基对尺寸。

实施例19.MBD-1活性和甲基化特异性的Southwestern印迹分析。

使用槽印迹设备以不同的量将未甲基化的λDNA和体外甲基化的λDNA两者结合至硝酸纤维膜。然后，将Alexa488标记的MBD1蛋白质用于探查整个槽。在4℃下过夜温育之后，洗涤槽并用Typhoon成像器扫描，以探测AlexaFluor488标记。图26中示出结果。该图像阐明，MBD1探针以高的特异性结合到甲基化的DNA。

尽管在本文示出和描述了本发明的优选实施方案，但对本领域技术人员来说很明显，仅作为例子提供这样的实施方案。本领域技术人员现在将想到很多变更、变化和替换，而不偏离本发明。应理解，可在实践本发明时使用对本文所述的发明的实施方案的各种备选方案。预期下面的权利要求限定本发明的范围，且由此涵盖在这些权利要求及其等效形式的范围内的方法和结构。

Claims

1.一种用于进行通道中的单一天然染色质的表观遗传分析的方法，包括：

(a)使所述天然染色质流过所述通道，其中所述天然染色质被标记有多个标记，所述多个标记中的至少一个与所述天然染色质上的表观遗传标记物特异性络合，且至少另一个标记与所述天然染色质中的蛋白质络合；

(b)用激光照亮所述通道以产生多个探询容积，每一个探询容积由所述通道的壁和来自所述激光的光束限定，其中所述光束具有大于通道的宽度的直径，其中每一个所述探询容积小于0.5飞升；

(c)探测来自所述多个的相同或不同探询容积的所述至少一个标记和所述另一个标记，从而对于所述至少一个标记和所述至少另一个标记产生与时间相关的解析度；和

(d)分析所述与时间相关的解析度，由此进行所述表观遗传分析；

其中所述方法不是疾病的诊断方法。

2.一种用于获得关于通道内的单一天然染色质的实时表观遗传分析数据的方法，包括：

(a)使所述天然染色质流过被照亮的探询容积，所述探询容积由所述通道的壁和激光光束限定，其中所述天然染色质被标记有多个标记，所述多个标记中的至少一个与所述天然染色质上的表观遗传标记特异性络合，且至少另一个标记与所述天然染色质中的蛋白质络合，其中所述激光光束具有大于通道的宽度的直径，并且其中所述探询容积小于0.5飞升；

(b)实时探测在所述探询容积内的所述至少一个标记和所述至少另一个标记，由此产生所述实时表观遗传分析数据；和

(c)在显示设备上显示所述实时表观遗传分析数据，其中所述实时分析数据反映在所述至少一个标记和所述至少另一个标记上的信息；

其中所述方法不是疾病的诊断方法。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述通道具有小于1μm的宽度。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述多个标记包括至少三种或四种标记。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述至少另一个标记与组蛋白络合。

6.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述至少另一个标记与结合剂络合，所述结合剂与非组蛋白络合。

7.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述至少另一个标记与结合剂络合，所述结合剂与选自由以下组成的组的靶络合：转录因子、MBD1和RNAPolII。

8.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述探测步骤提供超过10微秒的时间依赖性解析度。

9.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述天然染色质包含核酸分子和组蛋白。

10.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述天然染色质在小于0.1秒被表征。

11.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述至少一个标记和所述另一个标记被同时或先后探测。

12.一种用于对单一天然染色质进行表观遗传分析的系统，包括：

(a)通道，其配置成保持所述天然染色质，所述通道具有小于1μm的宽度；

(b)一个或多个激光光源，其配置成照亮所述通道以产生一个或多个探询容积，所述一个或多个探询容积中的每一个由所述通道的壁和来自所述激光光源的光束限定，其中所述光束具有大于通道的宽度的直径，其中每一个所述探询容积小于0.5飞升；

(c)探测系统，其配置成探测表示来自所述一个或多个探询容积的所述天然染色质的两种不同的特性的至少两种类型的信号，所述至少两种类型的信号产生自多个标记，所述多个标记中的至少一个与所述天然染色质上的表观遗传标记物特异性络合，且至少另一个标记与所述天然染色质中的蛋白质络合；和

(d)处理器，其被编程成提供来自所述一个或多个探询容积的所述至少两种类型的信号的、实时的与时间相关的解析度，由此表征所述天然染色质。

13.根据权利要求12所述的系统，其中所述一个或多个探询容积小于0.2、0.1或0.05飞升。

14.根据权利要求12所述的系统，其中所述两种类型的信号被同时地探测或所述探测系统探测四种类型的信号。

15.根据权利要求12-14中任一项所述的系统，其中所述处理器的特征在于：(i)所述处理器被编程为提供来自多于一个探询容积的所述至少两种类型的信号的、与时间相关的解析度；或(ii)包括现场可编程门阵列，所述现场可编程门阵列被编程为提供所述至少两种类型的信号的实时的、与时间相关的解析度。

16.根据权利要求12-14中任一项所述的系统，其中所述探测系统测量大于2的信噪比。

17.根据权利要求12-14中任一项所述的系统，其中所述通道包括光学透明的壁。

18.根据权利要求12-14中任一项所述的系统，其中所述光源提供不同波长的多个光束。

19.根据权利要求12-14中任一项所述的系统，进一步包括：

(e)用户界面，其配置成接收来自所述处理器的数据和显示所述数据，其中所述数据包括关于来自所述一个或多个探询容积的所述至少两种类型的信号的信息。