CN102716148A - 咪唑丙烯酸铜、锌配合物/凹土基抗菌剂的制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种咪唑丙烯酸铜、锌配合物/凹土基抗菌剂的制备方法及其应用，包括以下步骤：Al氨基凹土的制备；A2咪唑丙烯酸/凹凸棒土的制备；A3咪唑丙烯酸Cu²⁺、Zn²⁺配合物/凹土抗菌剂的制备。咪唑丙烯酸配合物/凹凸棒土抑菌剂对大肠杆菌具有良好的抗菌作用，并且抗菌作用较为稳定。其质量浓度为3g/L时，咪唑丙烯酸锌配合物/凹凸棒土对大肠杆菌24h抑菌率达98％，铜配合物/凹凸棒土达87％。综合锌、铜离子对人体的影响及抑菌剂的抗菌能力，可以认为咪唑丙烯酸锌配合物/凹土是一种更具有开发前景的外用抑菌剂。

Description

咪唑丙烯酸铜、锌配合物/凹土基抗菌剂的制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及的是一种咪唑丙烯酸铜、锌配合物/凹土基抗菌剂的制备方法及其应用。

背景技术

咪唑丙烯酸(Urocanic acid，UA)，俗称尿刊酸，是哺乳动物表皮中的组氨酸经组氨酸酶作用后的产物，在哺乳动物表皮角质层中约占干重的20％，反式UA(trans-UA)在天然情况下存在，当受到一定波长的中波紫外线(UVB)照射后，部分异构为顺式UA(cis-UA)。科研工作者已对尿刊酸结构和药性方面进行了大量的研究，如蒋艺等发现皮肤中的尿刊酸辐射后发生异构，在紫外线引起的免疫抑制中发挥重要作用，Kammeyer等发现尿刊酸异构体的另一种生理作用，反式和顺式尿刊酸具有天然脱羟基功能，具有一种新的皮肤抗氧化剂功能。王伟等利用UA修饰壳聚糖，研究了此复合物载载基因性能，结果表明UA修饰壳聚糖可以很好地包裹pDNA制成了纳米复合物，适合进行细胞转染，能成为新型载基因纳米复合物。

凹凸棒土是一种具有层链状结构的含水富镁铝硅酸盐矿物，其晶体结构由Si-O-四面体和Mg-O-八面体组成，结构单元按方格形式交错排列，形成棒状、纤维状，具有很大的表面积，表面常有较多断键产生，和细菌可发生一定程度上的生物化学作用，对细菌的繁殖有一定程度的抑制作用，近年来，为开发凹土的使用价值，研究工作者把目光转向了抗菌性能的研究工作上。目前现有的市售抗菌剂可分为有机抗菌剂和无机抗菌剂，无机抗菌剂可分为银系和钛系抗菌剂。银系抗菌剂的抗菌性能较好，其缺点是银的光敏性很强，遇光照或长期保存时会变色，且价格昂贵。钛系中使用TiO₂作为光催化剂并将其应用于抗菌性能的研究，其主要缺点是量子效率低和可见光利用程度低。杨勇等利用凹凸棒土作为载体制备了Ag/AgBr/TiO₂/凹凸棒土抗菌剂。研究表明，抗菌剂质量浓度为3g/L时，对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的抑菌率可达到100％。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种咪唑丙烯酸铜、锌配合物/凹土基抗菌剂的制备方法及其应用。

本发明的技术方案如下：

1氨基凹土的制备：

凹凸棒土研磨过250～450目筛。浓盐酸浸泡24h后在400～800℃活化。活化后的凹土置于适量无水乙醇中形成悬浊液，往此悬浊液中加入3-氨基丙基三甲氧基硅烷(活化后的凹土与3-氨基丙基三甲氧基硅烷质量比约1∶0.5～1)。在-10～40℃温度范围内搅拌12h。得氨基凹土(产品A)

2咪唑丙烯酸/凹凸棒土的制备

产品A置于适量无水乙醇中形成悬浊液，往此悬浊液中加入咪唑丙烯酸乙醇溶液，咪唑丙烯酸与3-氨基丙基三甲氧基硅烷摩尔比约为1∶1，在一10～40℃温度范围内搅拌5h。得咪唑丙烯酸/凹凸棒土(产品B)

3咪唑丙烯酸Cu²⁺、Zn²⁺配合物/凹土抗菌剂的制备

产品B置于适量无水乙醇中形成悬浊液，往此悬浊液中加入醋酸铜或醋酸锌的乙醇溶液，醋酸铜或醋酸锌与咪唑丙烯酸摩尔比约为1∶1，在－10～40℃温度范围内搅拌5h。得咪唑丙烯酸Cu²⁺或Zn²⁺配合物/凹土抗菌剂(产品C或D)。

咪唑丙烯酸配合物/凹凸棒土抑菌剂对大肠杆菌具有良好的抗菌作用，并且抗菌作用较为稳定。其质量浓度为3g/L时，咪唑丙烯酸锌配合物/凹凸棒土对大肠杆菌24h抑菌率达98％，铜配合物/凹凸棒土达87％。综合锌、铜离子对人体的影响及抑菌剂的抗菌能力，可以认为咪唑丙烯酸锌配合物/凹土是一种更具有开发前景的外用抑菌剂。

附图说明

图1 KBr压片红外光谱图，A、B、C、D分别为氨基凹土、咪唑丙烯酸/凹凸棒土、Cu²⁺咪唑丙烯酸配合物/凹土抗菌剂、Zn²⁺咪唑丙烯酸配合物/凹土抗菌剂；

图2 X-射线衍射图，2-1：咪唑丙烯酸/凹凸棒土；2-2：Zn²⁺咪唑丙烯酸配合物/凹土抗菌剂；

图3咪唑丙烯酸铜(3-2)、锌(3-1)配合物/凹土基抗菌剂抑菌圈变化图，A：6h，B：12h，C：18h，D：24h；

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。

2.1主要实验仪器及试剂

马福炉(宜兴)，磁力搅拌器(姜堰分析仪器厂)，旋转蒸发器，分子筛(350目)，AVATAR360傅立叶红外光谱仪(Nicolet)，X-射线衍射仪(XRD)(Regaku)，SA3100Plus比表面孔径测定仪(美国贝克曼库尔特公司)；optima2000DV电感耦合等离子发射光谱仪(美国Perkin-Elme公司)。

咪唑丙烯酸(Urocanic acid，99％，Acros organics New Jersey，USA)，凹凸棒土，3-氨基丙基三甲氧基硅烷(3-Aminopropyl-trimethoxysilane，95％，Acros organics NewJersey，USA)，无水乙醇，甲苯，醋酸铜，醋酸锌。除凹凸棒土外，所用试剂均为分析纯。

2.2咪唑丙烯酸配合物/凹土抗菌剂的合成

2.2.1氨基凹土的制备

凹凸棒土经研磨，过350目筛子，加入浓盐酸浸泡24h，抽滤洗净后，在400～800℃焙烧活化。取培烧活化过的凹凸棒土200mg，加入30ml有机溶剂(乙醇或甲苯均可)搅拌，将含有0.46mmol即20ml的3-氨基丙基三甲氧基硅烷(3-Aminopropyl-trimethoxysilane)有机溶液滴加入上述混合物中，搅拌浸泡12h，用布氏漏斗抽滤，洗涤至不含3-氨基丙基三甲氧基硅烷，干燥。得产品氨基凹土(产品A)。

2.2.2 咪唑丙烯酸/凹凸棒土的制备

在产品A中加无水乙醇25ml，将20ml含有0.5mmol咪唑丙烯酸的乙醇溶液滴加入产品A的乙醇悬浊液中，搅拌5h，用布氏漏斗抽滤，产物用无水乙醇洗去残余的咪唑丙烯酸，干燥，得咪唑丙烯酸氨基凹土(产品B)。

2.2.3 咪唑丙烯酸Cu²⁺、Zn²⁺配合物/凹土抗菌剂的制备

产品B加适量(20ml左右)的无水乙醇、0.5mmol醋酸铜，搅拌5h。用布氏漏斗抽滤，用无水乙醇洗去残余的铜离子，干燥。得产品(产品C)。

产品B加适量(20ml左右)的无水乙醇、0.5mmol醋酸锌，搅拌5h。用布氏漏斗抽滤，用无水乙醇洗去残余的锌离子，干燥。得产品(产品D)。

2.3抗菌性能实验

2.3.1定性试验(琼脂扩散纸片法)

为测试固载化咪唑丙烯酸及其配合物的抗菌性，我们选择大肠杆菌作为实验对象。配制LB固体和液体培养基，并做灭菌处理。将大肠杆菌(E.Coli)菌种活化，并配制成浓度为10⁶cfu/mL的菌落悬液。将配置好的LB培养基和大肠杆菌菌落液混合，并搅拌均匀。用移液管移去适量的配制好的混合液于培养皿中，待用。

将得到的产品C和D分别置于20ml的去离子水中，分别配制成3g/L的C和3g/L的D的悬浊液。然后选择直径为5mm灭菌的滤纸片浸于该悬浊液，浸泡并轻微搅拌2h，使产品能够被滤纸吸附。然后等间距将滤纸排列在装有混合液的培养皿中，并放入37℃恒温箱中继续培养。在可见光的条件下，每6h观察它是否存在抑菌圈。用游标卡尺测量抑菌圈大小并记录抑菌圈的平均直径，判断各种药液对大肠杆菌的抑菌效。

2.3.2定量试验

配制LB固体和液体培养基，灭菌。将E.Coli菌种活化，配制浓度为10⁶cfu/mL的菌悬液。用移液枪分别移取适量的菌悬液接种于盛有LB液态培养基锥形瓶内，振荡、摇匀。用5～50μL移液枪分别吸取10μL不同浓度抗菌剂于LB液态培养基中，在氙灯下照射一段时间后，用涂布器将其均匀地涂布在LB固体培养基上，将涂布好的培养基放入37℃恒温培养箱，在可见光条件下培养24h。培养结束后，培养皿菌落计数，试样抗菌结果按下式计算：

$Y=\frac{M_b-M_c}{M_b}\×100\%$

式中：M_b为培养24h后空白培养基上的菌落数；M_c为培养24h后含抗菌剂试样的菌落数。

3结果与讨论

3.1红外光谱分析

图1中，图A光谱数据显示：原料凹土的红外谱图中3164.8cm^-1、3390.4cm^-1、3604.428cm^-1三处吸收峰消失，在3174.4cm^-1出现了新的吸收峰，表明-OH已被-NH₂取代，形成了氨基凹土。图B在900cm^-1～1400cm^-1处的红外吸收类似于咪唑丙烯酸的红外吸收谱图，与图A相比，3174.4cm^-1吸收峰位移至3160.9cm^-1，咪唑丙烯酸本身位于3087.6cm^-1的-OH吸收峰消失。表明UA与氨基凹土上氨基生成酰胺。与B比较可知，C及D谱中，3160.9cm^-1吸收峰消失，分别在3413.9cm^-1、3419.3cm^-1出现新的吸收峰，1629.6cm^-1处吸收位移至1620.8cm^-1处，表明咪唑环与金属离子进行了配位已形成咪唑丙烯酸Cu²⁺、Zn²⁺配合物/凹土抗菌剂。

3.2 XRD表征

图2为XRD图，图2-1与凹土原料相比XRD基本没有变化，图2-2在7.5Deg.、11Deg.、20Deg.、42.5Deg.多处产生了新的峰，表明金属离子Zn²⁺的成功地与咪唑丙烯酸/凹凸棒土进行了配位。

3.3 BET分析

表1凹凸棒土原料及Zn²⁺、Cu²⁺咪唑丙烯酸/凹凸棒土

由表1知：经3-氨基丙基三甲氧基硅烷、咪唑丙烯酸、Cu²⁺、Zn²⁺处理过的凹凸棒土比表面积明显减小，表明Cu²⁺、Zn²⁺咪唑丙烯酸配合物已成功负载在凹凸棒土上。对比不同金属的咪唑丙烯酸配合物凹凸棒土的比表面积可以发现，用Zn²⁺处理过的凹凸棒土比表面积更小。这可能是由于咪唑丙烯酸氨基凹土对不同金属的配位能力和金属离子大小不一样，导致Cu²⁺、Zn²⁺与咪唑丙烯酸形成配合物的多少不一致，故形成的金属咪唑丙烯酸/凹凸棒土比表面积不一样。

3.4 ICP分析

表2 Zn²⁺、Cu²⁺咪唑丙烯酸凹凸棒土ICP测试数据

分别称取产品C和D100.0mg，在600℃下焙烧8h，再将焙烧后的抗菌剂用少许浓盐酸浸泡24h，过滤，用蒸馏水洗出金属离子，将滤液合并配成250ml溶液进行ICP测试。数据列于表2。

由表2知，含C溶液中Zn²⁺浓度为3.459mg/L。表明咪唑丙烯酸锌配合物/凹土100.0mg负载Zn²⁺3.459mg。含D溶液中Cu²⁺浓度为2.408mg/L。则咪唑丙烯酸锌配合物/凹土100.0mg负载Cu²⁺的量为2.408mg。

显然单位质量咪唑丙烯酸/凹土基配位的Zn²⁺含量大于Cu²⁺的含量。BET测试结果表明，咪唑丙烯酸锌配合物/凹土的比表面积小于咪唑丙烯酸铜配合物/凹土的比表面积。可能的原因是由于咪唑丙烯酸中咪唑环上氮原子与Zn²⁺的配位能力强于Cu²⁺，使咪唑丙烯酸配位了较多的Zn²⁺。

4、抗菌性研究

由表3及图3知，咪唑丙烯酸锌、铜配合物/凹土对大肠杆菌的生长均有抑制作用。抑菌时间比较长。参照《抗菌药物药效试验判定标准》，以24h为检测时间标准：抑菌圈直径在10～18mm之间为中度敏感；抑菌圈直径大于18mm为高度敏感，则咪唑丙烯酸铜配合物/凹土为中敏感抑菌剂，咪唑丙烯酸锌配合物/凹土为高敏感抑菌剂。

表3 不同咪唑丙烯酸配合物/凹土基抑菌剂在不同时间段内抑菌圈的大小

表4 4种试样对大肠杆菌的抗菌性能比较

由表4可见，咪唑丙烯酸几乎没有抗菌效果，负载到凹土后，抗菌性能从5％变为20％，原因是咪唑丙烯酸在常温日光下难以吸收紫外线产活性咪唑丙烯酸来杀灭细菌。当咪唑丙烯酸负载到凹土后其灭菌性能增加，这个抗菌能力的提高应该主要来自凹土的吸附作用。当咪唑丙烯酸/凹土结合金属锌及铜离子后，其灭菌性能明显增加。且随着抗菌剂浓度的增加抗菌效果越强，当抑菌剂浓度达到为3g/L时，抗菌能力分别达到98％及87％。这可能是由于金属离子配位到咪唑环的氮原子后，改变了咪唑丙烯酸分子内部电子云的分布密度，使得咪唑丙烯酸分子易于转变为具有抗菌性能的顺式结构。表3及表4均反映出咪唑丙烯酸锌/凹土抑菌剂的抗菌能力强，这可能是由于(1)锌的配位能力强于铜的配位能力，使咪唑丙烯酸更易转化为具有抗菌作用的活化结构；(2)咪唑丙烯酸锌/凹土抑菌剂配位了较多的金属离子，因而含有较多的易活化咪唑丙烯酸分子。

咪唑丙烯酸配合物/凹凸棒土抑菌剂对大肠杆菌具有良好的抗菌作用，并且抗菌作用较为稳定。其质量浓度为3g/L时，咪唑丙烯酸锌配合物/凹凸棒土对大肠杆菌24h抑菌率达98％，铜配合物/凹凸棒土达87％。综合锌、铜离子对人体的影响及抑菌剂的抗菌能力，可以认为咪唑丙烯酸锌配合物/凹土是一种更具有开发前景的外用抑菌剂。

应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (2)

1.一种咪唑丙烯酸铜、锌配合物/凹土基抗菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：A1氨基凹土的制备：凹凸棒土研磨过250～450目筛，浓盐酸浸泡24h后在400～800℃活化，活化后的凹土置于适量无水乙醇中形成悬浊液，往此悬浊液中加入3-氨基丙基三甲氧基硅烷，活化后的凹土与3-氨基丙基三甲氧基硅烷质量比约1∶0.5～1；在-10～40℃温度范围内搅拌12h，得氨基凹土；

A2咪唑丙烯酸/凹凸棒土的制备

氨基凹土置于适量无水乙醇中形成悬浊液，往此悬浊液中加入咪唑丙烯酸的乙醇溶液，咪唑丙烯酸与3-氨基丙基三甲氧基硅烷摩尔比约为1∶1，在-10～40℃温度范围内搅拌5h，得咪唑丙烯酸/凹凸棒土；

A3咪唑丙烯酸Cu²⁺、Zn²⁺配合物/凹土抗菌剂的制备

咪唑丙烯酸/凹凸棒土置于适量无水乙醇中形成悬浊液，往此悬浊液中加入醋酸铜或醋酸锌的乙醇溶液，醋酸铜或醋酸锌与咪唑丙烯酸摩尔比约为1∶1，在-10～40℃温度范围内搅拌5h，得咪唑丙烯酸Cu²⁺或Zn²⁺配合物/凹土抗菌剂。

2.根据权利要求1所述的制备方法制备的咪唑丙烯酸铜、锌配合物/凹土基抗菌剂在抑制大肠杆菌中的应用。

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