CN102716106A - 他昔莫芬的新用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及他莫昔芬的新用途，具体是在制备治疗男性膀胱出口梗阻及其引起的下尿道综合征的药物中的应用。该药物能够快速有效的治疗雄性小鼠膀胱出口梗阻及其引起的下尿道综合征，更好的切合临床应用，为临床治疗提供理论基础，为治疗膀胱出口梗阻提供了一种新方法。

Description

他昔莫芬的新用途

技术领域

本发明涉及医药用途，具体他昔莫芬的新用途。

背景技术

随着人类寿命的延长，老年男性的下尿道（lower urinary tract，LUT）越来越多的受到社会和医学界的关注。

流行病学调查表明40-49岁的男性中有约26%的人具有中度和重度的下尿道综合症(lower urinary tract syndrome，LUTS)；在70岁的男性中有约46%出现LUTS。

我国的流行病调查表明，在上海市市区一般人群中抽取40岁以上男性居民1583名，通过国际前列腺症状评分（IPSS）和生活质量（QoL）评分等方法，调查该人群中LUTS的患病率及对生活质量的影响。结果在40-49岁、50-59岁、60-69岁和大于70岁年龄组中，中、重度LUTS（IPSS≥8）患病率分别为8.7%、19.4%、32.3%和40.2%，呈现随年龄增长患病率上升趋势；随着LUTS严重程度的增加，患者的QoL评分也显著上升(P<0.01)。我国男性LUTS患病率也不断接近欧美国家，严重影响男性的生理健康和生活质量。

男性的LUTS的主要病因是膀胱出口梗阻(bladder outlet obstruction,BOO)，尿道发炎，小便失禁和膀胱癌。

膀胱出口梗阻(BOO)是下尿道综合症(LUTS)中最常见的一种病(Groutz et al.2001)。BOO从尿动力学定义是指膀胱颈和近端尿道处各种原因导致的尿液流出阻力升高，泌尿困难，不能排尿以及不能排空膀胱中的储尿。而尿频、尿急、尿痛则为LUTS的典型症状。

BOO常导致膀胱逼尿肌功能异常，继而产生一系列严重的并发症，如尿流间断，泌尿困难，不能排尿以及不能排空膀胱中的储尿，严重的能引起肾积水，慢性肾功能不全，长期排尿困难导致腹压增高，还可引起腹股沟疝，内痔与脱肛，肾衰竭和猝死等。

因此研究BOO后逼尿肌功能的变化一直是泌尿外科研究中最活跃的领域。

逼尿肌和尿道括约肌在收缩过程中协同失调（DUSD），和/或在排尿过程中外括约肌舒张失败引起BOO。一直以来，DUSD被认为是由于神经系统疾病或上部脊髓损伤，而BOO在神经系统正常的成年男性发病率更高，且随着年龄的增长而加重。雄激素一直被认为是主要调控男性泌尿生殖系统的生长、分化并维持其正常的功能，大量的研究表明，雌激素也在许多方面调节着它们的功能。流行病学表明，随着年龄的增加，老年男性雌/雄激素比例失衡，雄激素水平，特别是具有生物活性的睾酮水平下降，与此同时，雌激素比例上升。临床研究表明雄激素水平与BOO有着非常密切的相关性。老年男性这种雌/雄激素比例的升高与老年男性BOO发病率的升高恰好平行。临床的研究表明，良性前列腺增生（BPH）和前列腺炎是引起BOO最常见的原因。现已确认，雌激素是诱导BPH、前列腺炎和前列腺癌的主要危险因子之一。

雌激素主要是通过两种雌激素的受体（ERα和β）行使其生物学功能。ERβ在人类尿道上皮和膀胱平滑肌细胞核中表达，同时在大鼠的膀胱颈、尿道括约肌、近尿道和前列腺的横纹肌中表达。在雄性小鼠和膀胱颈，后尿道周围区域有ERα的表达，在犬齿科和兔的前列腺部尿道也有表达，而在这些物种的膀胱体中没有发现ERα的表达。虽然ERα，β的功能尚未完全清楚，但是ERs在LUT的广泛分布也暗示了下尿道（LUS）是雌激素的一个直接的靶。

实验表明，用乙烯雌酚（DES）处理新生鼠引起尿频、尿少和膀胱下部梗阻。而且在尿道周围的基质中、膀胱颈和膀胱中ERs的表达水平上调。这种ERs的异常表达暗示着LUT中局部的雌激素的作用扰乱局部雌/雄激素比例的平衡，引起膀胱功能的异常。DES还能够降低雄性大鼠膀胱的收缩性，且睾酮和雌激素联合处理Nobel大鼠引起前列腺发炎和梗阻性排尿，雌激素是雄激素在芳香酶（细胞色素P450）作用生成的。因此芳香酶是调节雌/雄激素比例平衡的非常重要的调节者。大量的临床观察和实验表明，升高的雌激素水平，特别是睾酮/雌激素的比例失衡是BOO形成的重要病因。

BOO的影响因素及发病机制：

1、良性前列腺增生

良性前列腺增生（Benign Prostate Hyperplasia,BPH）是老年男性常见的疾病(Canales et al.2005;Dedhia and McVary 2008)。

临床研究表明，良性前列腺增生和前列腺炎是引起BOO最常见的原因(Gat et al.2008;Schwinn and Roehrborn 2008)。伴随着前列腺增生，邻近的泌尿系统也会发生一些变化，增生的腺体向尿道内突出，使前列腺段尿道弯曲、延长、变窄，膀胱底部抬高，尿道阻力增加，从而引起排尿困难，甚至尿潴留(Verhamme et al.2002)。

由于尿液排出受阻，膀胱逼尿肌必须过度收缩才能完成排尿；由于前列腺尿道部位的梗阻，尿液排泄不畅，膀胱逼尿肌会代偿性地肥大(Brent and Stephens 1975;Mattiasson and Uvelius 1982)，以克服尿道的阻力，肌肉壁要比正常增厚2cm，同时膀胱粘膜上会造成肌肉束状增生，输尿管和膀胱三角区也肥厚(Levin et al.1984;Gilpin et al.1985)。

随着梗阻的进一步发展，膀胱逼尿肌即使过度收缩也不能将尿液完全排空，出现残余尿。膀胱壁肌束增厚突出形成小梁，小梁之间形成憩室，极易出现泌尿系感染和膀胱结石；长期排尿困难导致腹压增高，可引起腹股沟疝、脱肛或内痔等。如果不积极治疗，可出现膀胱输尿管返流，导致肾积水，压迫肾实质使肾功能减退，甚至肾功能衰竭。

BPH是BOO的一个很重要的病因，但并不是唯一的原因。研究提示，随着前列腺体积的增大，前列腺挤压尿道导致的BOO程度也随之加重，但二者间的决定系数仅为0.08，说明前列腺增大并不必然导致严重的BOO(双卫兵，2004)。也有研究者认为BPH病人得BOO是由于随着年龄的增长，膀胱逼尿肌功能不全造成的。

2、神经因素

膀胱的神经为内脏神经，其中交感神经来自第11、12胸节和第1、2腰节，经盆丛随血管分布至膀胱壁，使膀胱平滑肌松弛，尿道内括约肌收缩而储尿。副交感神经为来自脊髓第2-4骶节的盆内脏神经，支配膀胱逼尿肌，抑制尿道括约肌，是与排尿有关的主要神经。交感神经末梢的兴奋,可通过释放肾上腺素和去甲肾上腺素而使平滑肌收缩,使得前列腺内和后尿道的压力增高。

α1肾上腺素受体（adrenoceptor，AR）介导交感神经反应，如平滑肌收缩和心肌变力。在去甲肾上腺素的激动下，α1AR主要与Gq蛋白偶联，激活磷脂酶C2β，将细胞膜上的磷酯酰肌醇-4,5二磷酸水解成三磷酸肌醇和二酰基甘油两种第二信使，然后通过细胞内钙的转运引起肌肉收缩并激活蛋白激酶C(Graham et al.1996)。α1AR在前列腺、尿道、脊髓和膀胱中表达(Walden et al.1997;Gosling et al.1999)，实验表明，在前列腺中的主要亚型是α1a AR和α1d AR，α1a AR的阻滞剂能够引起前列腺平滑肌的舒张，因此α1a AR阻滞剂能够改善BPH中前列腺平滑肌的收缩状态(Andersson 2000;Michel and Vrydag 2006)。到现在为止，在对人类尿道（包括膀胱颈和前列腺内尿道）的研究表明，α1aAR在尿道表达(G.1993)。通过对病人的研究发现，在膀胱逼尿肌中α1dAR优势表达(Schwinn and Roehrborn 2008)，人类逼尿肌中α1dAR占66%，α1aAR占34%，不表达α1b AR，而且无论在mRNA水平还是蛋白质水平，α1d AR的表达量均是α1a AR的两倍(Malloy et al.1998)。在BOO的大鼠中，α1d AR上调。在正常大鼠中α1AR的mRNA含量为：70%为α1a，5%为α1b，25%为α1d；而在BOO大鼠中23%为α1a，2%为α1b，75%为α1d(Hampel et al.2002)。Andersson提出，正常生理状态下逼尿肌对交感神经兴奋的主要反应是β2介导的舒张反应，而α1介导的收缩反应作用极小；但在良性前列腺梗阻(BPO，以前称作症状性BPH)、不稳定逼尿肌和神经源性膀胱引起的LUTS患者中，逼尿肌对交感神经兴奋的主要反应可能由β2介导的舒张反应转变为α1介导的收缩反应(Andersson2000)。通过动物和人类膀胱的实验，α1a AR阻滞剂虽然能够带来前列腺平滑肌的舒张和增加尿流量，改善BPH引起的梗阻症状，但是BPH带来的LUTS的评分没有改变。只有α1a AR和α1d AR阻滞剂联合使用，LUTS的评分才得以改变(Haynes et al.2003;Sigala et al.2004;Barendrecht et al.2008)。

α2AR，主要是α2a AR亚型，在膀胱，尿道和前列腺中均有表达，但表达很少。它介导神经递质释放的节前抑制，同时是一些物种尿道的微弱收缩剂（但不是人类）。它们在下尿道的节后中的作用至今还不太清楚。前列腺平滑肌松弛通过α21a受体介导，因此α21a受体拮抗剂在治疗良性前列腺增生中可以提高尿流率，但不能缓解刺激症状。(Haynes et al.2003;Michel and Vrydag 2006)。

人类的逼尿肌上有大量的βAR存在(Rohner et al.1978)。交感神经兴奋时，βAR介导膀胱逼尿肌舒张，完成储尿过程。以前认为人类逼尿肌上有β1、β2二种受体亚型，其中，β2AR是逼尿肌舒张的主要因素(Perlberg and Caine 1982;Tsujii et al.1992)。但是，现有研究发现，非选择性的β受体激动剂诱发的逼尿肌的舒张作用不能被β1和β2受体拮抗剂所抑制。由此提示人逼尿肌可能由第三种βAR亚型所调节。1994年，国际药理联合会受体命名与药物分会将βAR分为β1、β2和β3三种受体亚型。其中β3AR亚型(又称“非典型”βAR)具有内源性儿茶酚胺功能，可介导脂肪分解、抗肥胖以及抑制逼尿肌和胃肠道平滑肌收缩等。在人类逼尿肌中β3AR亚型占到97%(Igawa et al.1999;Takeda et al.1999)。人类逼尿肌的舒张功能主要由β3AR亚型所介导(Yamaguchi 2002;Haynes et al.2003;Michel and Vrydag 2006)。β3AR亚型的基因突变可以使β3AR的表达减少，从而导致逼尿肌的舒张功能减弱，这可能是发生逼尿肌不稳定的关键因素之一。βAR介导膀胱、尿道和前列腺平滑肌的舒张。因此β3激动剂可以作为膀胱过度活动症（overactive bladder）的候选药物(Gruneberger 1984;Lindholm and Lose 1986)。

3、激素

睾酮（雄激素）一直被认为是主要调控男性泌尿生殖系统的生长、分化并维持其正常的功能的激素。睾酮在5α还原酶的作用下转化为双氢睾酮(Dihydrotestosterone，DHT)刺激前列腺增生，前列腺增生是引起膀胱出口梗阻的主要病因之一。研究发现，老年男性血清中的睾酮并不高，但是前列腺局部组织中的DHT水平很高，且随着年龄的增长呈上升趋势，这是激发良性前列腺增生的罪魁祸首(Lagiou et al.1997;Feldman and Feldman 2001;Roberts et al.2004)。

过去认为，雌激素可以拮抗男性雄激素，因而减少睾酮向双氢睾酮的转化，使已增生的前列腺组织逐渐萎缩、变小。1936年，Zuckerman就指出雌激素是前列腺纤维基质生长刺激因子(Zuckerman 1936;Page et al.2006)，并指出前列腺的致病因子不在于器官中的雌激素水平，而在于雌、雄激素间的平衡。一些医生的科学实验也证实雌激素是前列腺纤维基质生长刺激因子。研究发现，血浆和前列腺中雌激素相对水平越高，前列腺体积越大(Roberts et al.2004)。由于老年男性血浆中雌激素水平保持稳定，而雄激素水平下降，就出现雌激素/雄激素比例增加的现象。随着年龄增加，男性的雌激素浓度较稳定或稍有增加，与青年男性相比，老年人的雌雄激素比例升高，有学者认为，这种雌雄激素平衡的改变可能是前列腺基质诱导活性而致前列腺增生发生的原因。有研究显示，前列腺增生组织中结合状态的雌激素能够激活细胞合成和分泌细胞外基质蛋白，在细胞周围形成一层致密的纤维结缔组织，进而参与前列腺增生的发生、发展。在最初的间质增生中，雌激素的作用是主要的；在前列腺增生的过程中，雌雄激素具有协同作用，因而有人称雌激素是前列腺基质生长的刺激剂。雌激素可增加前列腺的雄激素受体，应用雌激素后，前列腺内DHT增高，故可促使前列腺增生(Niu et al.2003;Ansari et al.2008)。

在目前现有的激素治疗(雄激素耗竭、抗雄激素、5α-还原酶抑制剂和芳香酶抑制剂)中，5α还原酶抑制剂是唯一在随机临床试验中显示良好有效性和可接受的安全性药物，它最常见的副作用是性功能不良，如射精减少、性欲下降和阳萎(Roehrborn et al.2002;Kaplan 2006;Roehrborn 2008)。

4、其它发病因素

糖尿病会导致支配膀胱的神经发生病理改变，引起BOO。糖尿病时形态学上可以发现脊髓及其神经根萎缩或呈橡皮样变，神经胶质纤维化伴空泡变性，前角细胞萎缩而代之以脂肪组织；自主神经元染色质溶解，胞浆空泡变性及核坏死、呈念珠状或梭状断裂；外周神经髓鞘水肿、变性、断裂而脱落；轴突变性、纤维化、运动终板肿胀(龚宇2002)。由于膀胱的传入及传出纤维损害，导致膀胱感觉受损和膀胱收缩功能障碍。进一步的研究显示，膀胱感觉受损与膀胱和腰骶背根神经节中神经生长因子水平降低，导致Aδ和C纤维传入通路功能障碍有关(Sasaki K2003)。膀胱收缩功能障碍的产生可能与胆碱能神经损害、胆碱乙酰转移酶活性下降、胆碱能M受体上调、G蛋白及信号传导异常等有关(Steers WD 1994)。

缺血再灌注也是引起BOO的因素之一。平滑肌细胞的缺血再灌注引起细胞内钙离子的释放，导致钙离子超负荷和氧自由基的释放。这些过程又将依次引起磷脂酶的活化(如PLA2)、蛋白酶的活化(如钙蛋白酶)、膜脂质的过氧化反应等，这些一系列的反应将对神经、细胞内膜、线粒体和内质网产生进行性的损伤。随着损伤不断加重，膀胱将失代偿，引起不可逆的代谢和收缩功能障碍。膀胱失代偿最终有两种后果：一种是低容量、低顺应性、极弱或无收缩功能的纤维化厚壁膀胱；另一种是大容量、扩张的、极弱或无收缩功能的纤维化薄壁膀胱(Masick JM2001;Levin RM 2002)。

膀胱部位的病变，例如膀胱癌、膀胱结石，尿结石等损害了正常的膀胱结构或阻碍了正常的排尿通路，均会造成不同程度的BOO。

目前的治疗手段主要有药物治疗、手术治疗，其中：

1、外科手术治疗

目前临床上可接受的介入性治疗主要是：经尿道前列腺切除术(TURP)、开放性前列腺切除术(OS)、经尿道前列腺电气化术(TUVP)、激光气化术(VLAP)、经尿道微波治疗术(TUMT)、经尿道穿刺消融术(TUNA)、间质激光凝固术(ILC)、尿道支架术。

临床上应根据病人的具体情况，选择最有利于病人的手术方式。标准的外科手术疗效明显，症状得长期改善且危险性小。但目前越来越倾向于微创治疗，在一定程度上症状得到改善，危险性(某些病例)也小于开放手术，但是目前缺乏有关持久性证据，尚未确定这些新技术在费用和疗效上是否比标准外科手术(如TURP)有更大的优势(杨勇2002)。

2、药物治疗

α1AR拮抗剂：在前列腺中的主要亚型是α1aAR和α1dAR，α1aAR拮抗剂能够改善BPH中前列腺平滑肌收缩状态(Andersson 2000;Michel and Vrydag 2006)，减轻前列腺对尿道的挤压，从而改善膀胱梗阻的症状。α1a AR阻滞剂虽然能够带来前列腺平滑肌的舒张和增加尿流量，改善BPH引起的梗阻症状，但是BPH带来的LUTS的评分没有改变。只有α1a AR和α1d AR阻滞剂联合使用，LUTS的评分才得以改变(Haynes et al.2003;Sigala et al.2004;Barendrecht et al.2008)。α1AR拮抗剂其有效性和安全性已在开放扩展临床试验中得到证实。但临床现有的所有α1AR拮抗剂均与头晕、乏力和立位性低血压的发生有关。

5α-还原酶抑制剂：睾酮在5α-还原酶的作用下转化为双氢睾酮刺激前列腺增生，前列腺增生是引起膀胱出口梗阻的主要病因之一。在目前现有的激素治疗中，5α-还原酶抑制剂非那雄胺是唯一在随机临床试验中显示良好有效性和可接受的安全性药物。非那雄胺最常见的副作用是性功能不良，如射精减少、性欲下降和阳萎。

目前已上市的药物皆是针对治疗前列腺病变引起的膀胱出口梗阻，尚未见到对雌/雄激素比例失调引起的膀胱出口梗阻的治疗。

他昔莫芬（tamoxifen），曾用名：三苯氧胺、诺瓦得士、Nolvadex、TAM，化学名称为：(Z)-2-[对-(1,2-二苯基-1-丁烯基)苯氧基]-N,N-二甲乙基胺。

他莫昔芬属于三苯乙烯非甾体抗雌激素类抗肿瘤药物，它通过与靶细胞质中的雌激素受体竞争性结合，阻断过高的雌激素作用于乳腺组织，减少雌激素对乳腺导管与间质的过度刺激，因此可用于乳腺癌的治疗，此外，该药物还具有抗氧、膜调节、抗多耐药性（Multi-drug Resistance，MDR）、心脏保护功能、抗病毒、抗念珠菌、对胰岛素生长因子有影响（能够显著降低血中IGF-1（Insulinlike GrowthFactor Ⅰ）的水平）等多种作用。

但是未见到他莫昔芬在膀胱出口梗阻相关用途方面的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种他莫昔芬的新用途。

本发明提供了他莫昔芬在制备治疗男性膀胱出口梗阻及其引起的下尿道综合征的药物中的应用。

上述应用中：

所述膀胱出口梗阻的症状是：尿频、尿急、排尿困难、淋漓不尽、排尿时间延长。

所述膀胱出口梗阻引起的下尿道综合征的症状，凡有尿频、尿急、尿痛的症状都属于下尿道综合征的典型症状。

所述膀胱出口梗阻及其引起的下尿道综合征是由雌/雄激素比例失调引起的；

本发明所述他莫昔芬为含有他莫昔芬的制剂，该制剂可市售获得，或与药学上可接受的载体或稀释剂组成制剂。

所述制剂为片剂、胶囊、颗粒剂、丸剂、口服液或注射剂，所述注射剂为注射液或冻干粉针。

所述药学上可接受的载体或稀释剂是指药学领域常规的药物载体，选自填充剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、助悬剂、润湿剂、溶剂、表面活性剂或矫味剂中的一种或几种。

所述填充剂选自淀粉、蔗糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、微晶纤维素或葡萄糖等；

所述粘合剂选自纤维素衍生物、藻酸盐、淀粉、糊精、明胶或聚乙烯吡咯烷酮等；

所述崩解剂选自微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、低取代羟丙基纤维素或交联羧甲基纤维素钠；

所述润滑剂选自硬脂酸、聚乙二醇、碳酸钙、碳酸氢钠、微粉硅胶、滑石粉或硬脂酸镁；

所述助悬剂选自微粉硅胶、蜂蜡、纤维素、固态聚乙二醇；

所述润湿剂选自甘油、吐温-80、乙氧基氢化蓖麻油或卵磷脂；

所述溶剂选自乙醇、液态聚乙二醇、异丙醇、吐温-80、甘油、丙二醇或植物油，所述植物油选自大豆油、蓖麻油、花生油、调和油等；

所述表面活性剂选自十二烷基苯磺酸钠、硬脂酸、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物、脂肪酸山梨坦或聚山梨酯（吐温）等；

所述矫味剂选自阿斯巴甜、蔗糖素、香精、柠檬酸或糖精钠。

所述他莫昔芬的用量为1-50mg/Kg/d，优选为5-25mg/Kg/d。

本发明的优点在于：

1、本发明提出了他莫昔芬的新用途，该药物能够快速有效的治疗雄性小鼠膀胱出口梗阻，为临床治疗提供理论基础，同时为治疗膀胱出口梗阻提供了一种新方法；

2、实验证实：用他莫昔芬来治疗膀胱出口梗阻及其导致的下尿道综合征，症状减轻明显，治疗率为100%。

附图说明

图1：芳香酶表达载体的结构示意图。

图2：PCR鉴定结果，6号为阳性，+为阳性对照。

图3：Southern Blot筛选结果，1为阳性对照，是回收的探针，6为southern blot阳性鼠。

图4：小鼠生殖泌尿系统表型的鉴定，左边两鼠：1为阳性转基因的尿潴留小鼠，2为阴性对照组的野生型小鼠，右边一鼠为图3Southern blot分析的含有转芳香酶基因的阳性鼠的解剖学分析为尿潴留引起的膀胱的形态学变化。

图5：膀胱组织HE染色及Van Gieson染色结果，A为HE染色结果，B为Van Gieson染色结果；其中，1为野生型小鼠，2为阳性转基因小鼠；a表示胶原纤维，b表示肌纤维。

图6：芳香化酶基因的半定量RT-RCR，A1、A2为芳香化酶转基因小鼠，WT1，WT2为野生型小鼠。

图7：芳香化酶Western Blot检测结果，A1，A2为阳性转基因小鼠，WT为野生型小鼠。

图8：他莫昔芬处理的转基因鼠和阳性对照鼠（左边为阳性对照组，右边为他莫昔芬组），疝气症状消失明显（疝气往往伴随着尿道梗阻）；

图9：他莫昔芬处理的转基因鼠和阳性对照鼠的尿潴留情况，解刨学分析，左边WT为野生小鼠，中间为阳性对照，右边为他莫昔芬组；

图10：括约肌的组织病理学分析，A：野生型鼠尿道口的括约肌；B：转基因鼠尿道口的括约肌；C：他莫昔芬处理的转基因鼠尿道口的括约肌。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1：小鼠模型的制备

参考文献：Molecular mechanisms of bladder outlet obstruction in transgenic malemice over expressing aromatase(Cyp 19a 1).Lin W，Rahman NA,Lin J,Zhang H,Gou K,Yu W，Zhu D,Li N,Huhtaniemi I,Li X.Am J Pathol.2011Mar;178(3):1233-44.PMID:21356374。

试验动物：C57BL/6小鼠购自中国人民解放军军事医学科学院动物中心。C57BL/6是国外引进的近交系，是B6F129和B6JEiF 78杂交，而后经过129代的同胞兄妹近交而生产的近交系，相关基因型是a/a。

试验试剂：pUB6/V5-HisA(Cat.No.V25020)，购自Invitrogen,Carlsbad,CA；pRC/CMV(Cat.No.10131027)，购自Invitrogen,Carlsbad,CA。

用C57BL/6小鼠构建膀胱出口梗阻动物模型，具体方法如下：

一、重组表达载体（或为芳香酶表达载体）的构建

1、Ubiquitin C基因的启动子及其外显子I和内含子I的获得

用限制性内切酶BglII和HindIII酶切pUB6/V5-HisA，回收Ubiquitin C基因的启动子及其外显子I和内含子I片段，其中Ubiquitin C基因的启动子及其外显子I和内含子I及该片段在载体pUB6/V5-HisA上两端的酶切位点的核苷酸序列如序列表中SEQUENCE 1所示；人工序列1自5′末端起第1-6位核苷酸为BglII的识别序列（A|GATCT），人工序列1自5′末端起第1218-1223位核苷酸为HindIII的识别序列（A|AGCTT）；人工序列1自5′末端起第7-1217位核苷酸为片段Ubiquitin C基因的启动子及其外显子I和内含子I的序列，其人工合成序列见序列表中的SEQUENCE 1所示。

2、人芳香酶编码基因的cDNA的获得：

两端带有酶切位点的人芳香酶编码基因的cDNA全长序列如序列表中人工序列2所示，其中序列2自5’末端第1-6位核苷酸为HindIII的识别序列（A|AGCTT），第2155-2160位核苷酸为XbalI的识别序列（T|CTAGA），第7-2154位核苷酸为人芳香酶编码基因的cDNA全长序列，其人工合成序列见序列表中的SEQUENCE 2所示。

3、牛生长激素基因的polyA信号序列：

在载体pRC/CMV上具有牛生长激素基因的polyA信号序列，其核苷酸序列见序列表中的SEQUENCE 3所示；

4、重组表达载体的构建

用限制性内切酶BglII和HindIII酶切载体pRC/CMV，回收大片段（即去除CMV启动子的载体片段），将其与步骤（1）中酶切获得的Ubiquitin C基因的启动子及其外显子I和内含子I片段连接，得到重组载体pRC/Ubiquitin C；

用限制性内切酶HindIII/XbaI酶切重组载体pRC/Ubiquitin C，回收大片段；用限制性内切酶HindIII/XbaI酶切人芳香酶编码基因的cDNA片段，连接，得到重组表达载体pRC/Ubiquitin C/cDNA（即芳香酶表达载体），其结构如图1所示，得到DNA片段“Ubiquitin C基因的启动子、外显子I和内含子I+人芳香酶编码基因的cDNA+bGH polyA”，其核苷酸序列见序列表中的SEQUENCE 4所示。

二、转基因小鼠的构建

将构建的芳香酶表达载体用Bgl II和Dra I进行双酶切，回收DNA片段，即Ubiquitin C基因的启动子、外显子I和内含子I+人芳香酶编码基因的cDNA+bGHpolyA，将上述DNA片段制成2ng/μL的悬液，显微原核注射入C57BL/6小鼠受精卵中；胚胎移植入待孕母体子宫中；生产转基因小鼠，得到的转基因小鼠计作F0代。具体的实验步骤如下：

（一）超数排卵(超排)与取卵

1、超数排卵：取4-6周龄的母鼠作超排卵供体，腹腔注射孕马血清(PMSG)和人绒毛膜促性腺激素(hCG)诱导母鼠排卵，二者注射时间间隔为45h，排卵发生在注射hCG后13h，注射剂量为每鼠8ul。注射hCG后每只母鼠置于一个单独饲养的正常公鼠笼内，次日晨检查阴道栓。

2、取卵：用颈椎脱臼法处死有阴道栓的雌鼠，把完整的输卵管带一小段子宫剪下，置于PBS平衡盐溶液中，在解剖镜下找出输卵管伞部，用带针头的注射器将受精卵冲出，用透明质酸酶去除包围着的颗粒细胞后立即将卵子换至新鲜培养液内洗涤4次即可用于显微注射。

（二）注射外源DNA：

显微注射需用显微操作仪，用来控制显微持卵针和显微注射针。取已制备好的受精卵细胞和外源DNA悬液，在倒置显微镜下做显微注射。注射时先用持卵针吸住受精卵，再用注射针吸取外源DNA悬液，然后推动注射针，使其刺入受精卵的雄原核，将1-2μL DNA注入（DNA浓度：2ng/μL）。注射完毕，慢慢抽出注射针，将受精卵放入新的培养液中，使其恢复。50-80%的受精卵在显微注射后仍保持健康。

（三）注射后受精卵(或胚胎)的移植：

将注射有外源DNA的受精卵在显微操作当天移植到交配后0.5d假孕雌鼠的输卵管内。外源DNA可直接导入原核内，导入的外源DNA在卵裂前与受体基因组整合。待假孕母鼠产出幼仔后，可用幼鼠尾巴提取基因组DNA进行检测。

本实验采用如下移植方法：用戊巴比妥钠麻醉受体鼠，从假孕鼠阴道向子宫颈管道插入外径10毫米的粗导管，然后将直径5毫米的细导管插入粗导管内侧，伸入到子宫体或一侧子宫角。将囊胚连同2毫升保存液一起通过细导管移植进去，具体是用干冰产生出来的二氧化碳经过导管将囊胚吹入到子宫内1-3分钟。

也可以采用如下移植方法：用戊巴比妥钠麻醉受体鼠，沿受体鼠背部中线最后一根肋骨水平切1cm左右切口，轻轻拨开切口，可见位于卵巢上方的白色脂肪垫.用小镊子夹住白色脂肪垫将其拉到体外，用小血管夹夹住，并靠其重力起固定作用，以防输卵管缩回体腔。用移卵管吸15-20个受精卵准备移植.将小鼠转到解剖镜下仔细寻找到输卵管。可见输卵管被一层呈半透明的囊膜所包绕，将囊膜撕破而暴露输卵管，将移卵管内受精卵移植到输卵管膨大部。将输卵管小心放回，缝合。实验设3次重复。

三、转基因小鼠的筛选

阳性小鼠的鉴定及繁育：运用PCR及Southern Blot方法筛选阳性转基因小鼠；

（一）PCR筛选方法：

模板DNA为假孕母鼠所产Founder幼鼠的鼠尾DNA，（假孕母鼠生产的转基因动物称为Founder）正向引物见序列表中的SEQUENCE 5，反向引物见序列表中的SEQUENCE 6，扩增572bp片段，不能扩增出该片段的为阴性，能扩增出该片段并通过测序正确的为阳性。结果如图2所示，6号为阳性，+为阳性对照，将PCR阳性的PCR产物进行测序，测得的序列如序列表中的SEQUENCE 4的自5′末端起第853-1424位核苷酸所示，表明PCR产物结果正确。

（二）Southern Blot筛选方法：

1、基因组DNA的制备：按常规鼠尾提取DNA的方法制备DNA；

2、基因组DNA的限制酶切：

在1.5ml离心管中依次加入20μg DNA(1μg/μl)，4.0μl 10×酶切buffer，5.0μlEcoR I(10U/μl)，加ddH₂O至500μl，37℃消化过夜。

3、基因组DNA消化产物的琼脂糖凝胶电泳

制备0.8%凝胶：一般用于Southern杂交的电泳胶取0.8%。电泳：电泳样品中加入10×Loading缓冲液，混匀后上样，留一或两泳道加DNAMarker。1-2V/cm，DNA从负极泳向正极。电泳至溴酚蓝指示剂接近凝胶另一端时，停止电泳。正常电泳图谱呈现一连续的涂抹带。

4、DNA从琼脂糖凝胶转移到固相支持物（毛细管法）

1）试剂准备：变性液：0.5M NaOH；1.5M NaCl；中和液：1M Tris-HCl(pH 7.4)；1.5M NaCl；转移液（20×SSC）：175.3g NaCl；82.2g柠檬酸三钠，NaOH调pH至7.0，加ddH₂O至1000ml。

2）操作步骤：

碱变性：室温下将凝胶浸入数倍体积的变性液中30分钟。

中和：将凝胶转移到中和液15分钟。

转移：按凝胶的大小剪裁带正电尼龙膜并剪去一角作为标记，水浸湿后，浸入转移液中5分钟。剪一张比膜稍宽的长条Whatman 3mm滤纸作为盐桥，再按凝胶的尺寸剪3-5张滤纸和大量的纸巾备用。转移过程一般需要8-24小时，每隔数小时换掉已经湿掉的纸巾。转移液用20×SSC。注意在膜与胶之间不能有气泡。整个操作过程中要防止膜上沾染其它污物。

转移结束后取出膜，浸入6×SSC溶液数分钟，洗去膜上沾染的凝胶颗粒，置于两张滤纸之间，80℃烘2小时，然后将NC膜夹在两层滤纸间，保存于干燥处。

5、探针标记：进行Southern杂交的探针一般用放射性物质标记

1）取25-50ng模板DNA(EcoRI酶切构建完成的质粒载体，回收2.7K片段)于0.5ml离心管中，100℃变性5分钟，立即置冰浴。

2）在另一个0.5ml离心管中加入：10μl Labeling 5×buffer（含有随机引物，随机引物是小的核苷酸序列），2μl dNTPmix(含dATP、dGTP、dTTP各0.5mM)，2μlBSA（小牛血清白蛋白），3μl[α-³²P]dCTP，5UKlenow酶。

3）将步骤1）中的变性模板DNA加入到步骤2）中的离心管中，加ddH₂O至50μl，混匀，室温内放置90分钟。

4）加50μl终止缓冲液终止反应。

6、杂交

预杂交：膜浸入2×SSC中5分钟，在杂交瓶中加入杂交液（8cm×8cm的膜加5ml即可），将膜的背面贴紧杂交瓶壁，正面朝向杂交液。放入42℃杂交炉中，使杂交体系升到42℃，得到预杂交的杂交液。

杂交：倒出预杂交的杂交液，换入等量新的已升温至42℃的杂交液。将探针100℃加热5分钟，使其变性，迅速加到杂交瓶中，42℃杂交过夜。

7、洗膜与检测：

取出膜，在2×SSC溶液中漂洗5分钟，然后按照下列条件洗膜：

2×SSC/0.1%SDS，42℃，10分钟；

1×SSC/0.1%SDS，42℃，10分钟；

0.5×SSC/0.1%SDS，42℃，10分钟；

0.2×SSC/0.1%SDS，56℃，10分钟；

0.1×SSC/0.1%SDS，56℃，10分钟。

在洗膜的过程中，不断振摇，不断用放射性检测仪探测膜上的放射强度。

实践证明，当放射强度指示数值较环境背景高1-2倍时，是洗膜的终止点。上述洗膜过程无论在哪一步达到终点，都必须停止洗膜。洗完的膜浸入2×SSC中2分钟，取出膜，用滤纸吸干膜表面的水份，并用保鲜膜包裹，注意保鲜膜与膜之间不能有气泡。将膜正面向上，放入磷板中，三天后扫描磷板，结果如图3（1为阳性对照，是回收的芳香酶基因的探针，6为southernblot分析的含有转芳香酶基因的阳性鼠，2-5分别是转基因小鼠产生的阴性后代。

以上结果表明，筛选得到的阳性转基因小鼠正确。

四、遗传稳定性检测

将步骤三筛选得到的阳性雌鼠与野生型C57BL/6公鼠配对，繁育得到F1代；对F1代小鼠进行筛选，方法同步骤三所述。以此类推，繁育F2代，F3代，F4代，每一代都进行阳性筛选，阳性转基因鼠中均能检测到该插入的基因。

五、阳性转基因鼠的表型鉴定及组织学分析和基因表达分析

将按照上述方法得到的F1代和F2代阳性转基因公鼠成年后进行生殖泌尿系统表型鉴定、组织病理学分析、基因表达分析。

（一）表型鉴定

结果：阳性转基因公鼠成年后生殖泌尿系统表型鉴定结果如图4所示，左边两鼠：1为阳性转基因的尿潴留小鼠，2为阴性对照组的野生型小鼠，右边一鼠为图3Southern blot分析的含有转芳香酶基因的阳性鼠的解剖学分析为尿潴留引起的膀胱的形态学变化。

（二）组织学分析

解剖获取所述转基因小鼠的膀胱及尿道，放入到4%的多聚甲醛溶液中固定48小时，水洗4小时后进行组织包埋，HE染色及胶原Van Giesan染色，具体步骤如下：

1、将固定好的组织用PBS洗涤2次，每次10分钟。然后进行脱水和浸蜡，方法如下：70%乙醇（1小时），80%乙醇（1小时），90%乙醇（1小时），95%乙醇（1小时），无水乙醇（1小时×2），二甲苯（15分钟一次，5分钟一次），石蜡一（30分钟），石蜡二（30分钟），石蜡三（30分钟）；

2、将处理过的组织放在包埋盒底部中央，倒入融化的蜡，室温中冷却；

3、切片：

1）将已固定和修好的石蜡块装在切片机的夹物台上；

2）将护刀盖推至打开位置；

3）摇动快速进退手轮，使石蜡块与刀口贴近，但不超过刀口；

4）调整石蜡块与刀口之间的角度与位置，刀片与石蜡切片约成15-30度；

5）调整厚度调节器到所需的切片厚度，一般5μm；

6）一切调整好后就可以切片，此时右手摇动大手轮，左手持毛笔将蜡带提起，摇转速度以每分钟40-50转为宜。

7）切成的蜡带到20-30厘米时，右手用另一支毛笔将蜡带挑起，平放在蜡带盘上（注意：靠刀面的一面较光滑朝下）。

4、贴片：切好的蜡带置于捞片机温水中（注意蜡片光面向下），待其完全展开后，取一清洁的以粘片剂处理的载玻片捞取至片上中间部位。并作好标记。

5、烤片：把玻片标本置于片架上，37℃温度烤片24小时。

6、HE染色：

1）组织芯片置于二甲苯中浸泡15分钟；

2）更换二甲苯后再浸泡7分钟；

3）无水乙醇I中浸泡5分钟；

4）无水乙醇II中浸泡5分钟；

5）95%乙醇中浸泡5分钟；

6）90%乙醇中浸泡5分钟；

7）80%乙醇中浸泡5分钟；

8）70%乙醇中浸泡5分钟；

9）苏木精中浸泡15分钟；

10）水洗2分钟；

11）盐酸酒精分化10秒；

12）80%乙醇中2分钟；

13）70%乙醇中2分钟；

14）伊红中79秒；

15）90%乙醇中浸泡3分钟；

16）95%乙醇中浸泡3分钟；

17）无水乙醇II中浸泡3分钟；

18）无水乙醇I中浸泡5分钟；

19）二甲苯II中3分钟；

20）二甲苯I中3分钟；

21）中性树胶封片，镜检。

7、Van Gieson染色：

1）试剂的配制：

Weigert氏苏木素：A液：1g苏木素（haematoxylin），100ml无水酒精；B液：4ml 30%三氯化铁（ferric chloride），95ml蒸馏水，1ml盐酸。

Van Gieson氏液：A液：1g酸性品红（acid fuchsin），100ml蒸馏水。B液：1.22%苦味酸饱和水溶液（picric acid）。

Weigert氏苏木素临用前取A液和B液等份混合，几个小时内用完，最长不得超过一天。

苏木素配后经二十多天才能成熟，必须提前配制。该液能抵抗弱酸性染液，对已着染的细胞核在酸性染液的作用，不易被脱去颜色，如果不特别深染，则无须分化。

Van Gieson氏液取B液9ml，加入A液1ml，即可使用。

2）操作方法：

切片脱蜡至水；

用Weigert氏苏木素染20min；水洗；必要时可分化；流水冲洗10min；染VanGieson氏液1min；用95%酒精快速分化；无水酒精脱水，二甲苯透明，封固。

染色结果如图5所示（A表示HE染色结果，B表示胶原纤维染色（Van Gieson染色）结果，其中，1表示野生型小鼠，2表示阳性转基因小鼠；粉红的部分a表示胶原纤维（在黑白图片为黑色线丝状物），橙色的部分b表示肌纤维，（在黑白图片为浅灰色部分）结果表明，阳性转基因小鼠膀胱尿潴留，膀胱中固有层增厚，逼尿肌排列紊乱，逼尿肌层萎缩，尿道括约肌萎缩。Van Gieson染色显示胶原增多。

（三）基因表达分析：

快速解剖获取转基因小鼠的膀胱于液氮中速冻，-80℃保存，留待提取RNA和蛋白质，通过RT-PCR和Western Blot方法做基因表达检测，具体方法如下：

1、RT-PCR：

1）总RNA的提取及检测

A迅速从液氮中取出膀胱，剪取50mg左右，剪碎放入匀浆杯中，加入1mlTrizol，用匀浆器匀浆1-2min，将组织匀浆液转入1.5ml离心管中，室温放置5min。

B加入200μl体积比为1:24的异戊醇/氯仿，充分混匀，务必成乳白色，冰中放置10min。

C 4℃，以12000转/min离心10min。

D取上清，加入等体积异丙醇(预冷)混匀。

E-20℃放置1h后，4℃，10000转/min离心10min。

F弃上清，沉淀溶于800μl 75%的乙醇，室温放置10min，4℃，10000转/min离心10min。

G重复步骤6）一次。

H小心弃上清，在恒温箱中65℃烘干；核酸分析仪测定总RNA的OD₂₆₀/OD₂₈₀，根据A₂₆₀值计算RNA样品浓度：RNA样品浓度（ng/μl）=A₂₆₀×DNA稀释倍数×50。

痕量DNA的消化：

A向RNA水溶液中加入10μl的10xDNase-1缓冲液，0.5μlRnsin(40-200U/μl)，2.0μl DNase-1(5U/μl)，4.0μl0.1MDTT，用DEPC水调至100ml，37℃保温15min。

B加入等体积的酚:氯仿(1:1)混匀。

C 4℃，12000r/min离心10min。

D取上清，加入1/10体积的3mol/l的NaAc和2.5倍体积的预冷的乙醇混匀。

E-20℃沉淀30min以上，10000r/min，4℃离心15min。

F沉淀用乙醇淋洗两次，烘干，溶于无核酸酶水中，存于-70℃备用。

G紫外分光光度计检测所提RNA的含量。

2）反转录合成cDNA第一条链

A反转录体系如表1所示

表1：反转录体系

反应组分	反应体积μl
		M-MLV 5xbuffer	4.0μl
dNTPs(10mM)	1.0μl
		RNasin(40-200U/μl)	0.5μl
Oligo dT(20uM)	4.0μl
		RNA	1.0μg
DEPC水	补足至20μL

B反转录操作程序：

①将以上成分混匀后，短暂离心，在PCR仪上75℃温育5min。

②立即放置冰上5min。

③加入M-MLV(200U/μl)1.0μl混匀，短暂离心。

④在PCR仪上进行如下程序：37℃1h，95℃5min，反转录产物于-20℃备用。

3）半定量PCR检测相关基因的表达情况，以芳香酶基因（Cyp19a1）为例，方法如下：

PCR反应体系：2μL 10xbuffer，1.6μL dNTPs(2.5uM each)，0.4μL primerF(10uM)，0.4μLprimerR(10uM)，1μL cDNA，0.3μLTaq酶(10U/μL)，ddH₂O补足至20μL。

反应程序如下：

芳香酶基因的引物F见序列表中的SEQUENCE 7，R见序列表中的SEQUENCE 8。

结果如图6所示（A1、A2为芳香酶转基因小鼠，WT1，WT2为野生型小鼠），图6显示芳香酶转基因小鼠表达转芳香酶的基因表达水平，而野生小鼠没有该基因的表达。

2、Western Bloting

1）蛋白质样品的制备：

按实验要求将膀胱从动物体内取出（样品不宜反复冻融），取少量（1-2g左右）放入玻璃匀桨器中用RIPA buffer研磨成匀浆，冰浴半小时后让细胞充分裂解，4℃，12000rpm/min离心10min，取上清液。加入1/4体积左右的上样Buffer，然后放在沸水浴中加热3-4min使蛋白变性，方可作为样品点样。

2）SDS-聚丙烯酸胺凝胶电泳（SDS-PAGE）

①根据要求配制好SDS-聚丙烯酸胺凝胶（一般采用10%的SDS-PAGE）。

②将已配制好的凝胶装入电泳仪中。

③设计加样顺序，作好实验记录，按预定顺序加样。一般裂解液按10-20ul/道点样。

④把电泳装置与电源连接好，将电压调至100V电泳10-20min，待溴酚蓝迁移出积层胶位置再换用200V，30-40min后关闭电源。

⑤从电泳装置上卸下凝胶玻璃板，用水冲洗干净，准备转膜。

3）转膜（湿转）

①将凝胶玻璃板置于盛有电泳转移缓冲液的容器中，浸泡几分钟。

②带上手套，准备好滤纸和NC膜（83mm×75mm），尽量避免污染滤纸和膜，将裁减好的滤纸和膜浸泡与电泳转移缓冲液中，驱除留于膜上的气泡。

③打开转移盒并放置浅盘中，用转移缓冲液将海绵垫完全浸透后将其放在转移盒壁上，海绵上再放置一张浸湿的滤纸。

④按“海绵-滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸-海绵”的顺序装置好（注意不能有气泡且装置电极槽不能放反）

⑤将冰盒装入缓冲液槽，注满4℃预冷的转移缓冲液。

⑥将整个装置放在冰浴中用磁力搅拌器搅拌，连接好转移电极恒流100mA转移3小时。电转完毕后，将PVDF膜作好记号置于含2%的脱脂奶粉（TBST配制）和适当浓度（1：500-1：1000）的一抗中孵育1小时。弃去一抗，膜条仍置于加样槽，每个槽中的膜用TBST在摇床洗涤洗涤15分钟一次，5分钟一次。

4）加二抗与一抗的结合

①根据实验需要和设计选择合适的酶标二抗和稀释浓度（TBST稀释，1：2000），每个加样槽中加入二抗20mL左右室温下于摇床孵育1h，注意保证膜的所有部分同溶液接触。

②弃去二抗，膜条仍置于加样槽，每个槽加TBST在摇床洗涤洗涤5分钟左右，换液反复4-5次。

一抗为芳香酶（sc-14244,Santa Cruz Biotechnology，INC）；二抗为辣根酶标记兔抗山羊IgG（ZB-2306，中杉金桥）。

5）显色反应

底物发光法：将两种显色底物1：1等体积混合后将其覆盖在膜表面使其均匀，用玻璃胶片把膜包起来，马上在暗室中将X光片覆盖在膜的上面（时间根据光的亮度来衡量），显影、定影。结果如图7所示（A1和A2为阳性转基因小鼠，WT为野生型小鼠），图7显示芳香酶转基因小鼠表达转芳香酶的蛋白表达水平，而野生小鼠没有该蛋白的表达。

以上证明，本发明得到的转基因小鼠正确，可以作为膀胱出口梗阻动物模型。

构建转基因小鼠及其筛选和鉴定的实验重复3次，每次以30只小鼠为实验对象，共得到20只阳性转基因小鼠。所有阳性转基因小鼠在2个月大时出现腹股沟疝，20只中有18只8个月大时有尿潴留，膀胱出口梗阻，表明本发明动物模型的发病率高，可达90%。

判断发病的标准：小鼠在两个月大时出现腹股沟疝，行动相对迟缓，抓起小鼠时，野生型鼠会应激排尿，而该转基因鼠不会或很少应激排尿，人为地挤压腹部也只能少量地排除些尿。由此可以判定其已经发病。

实施例2：他莫昔芬对膀胱出口梗阻动物模型的影响

1、模型的制备方法：参考实施例1的方法构建模型，阳性小鼠模型的筛选：将出生后15天的新生小鼠剪尾，提取基因组DNA，PCR筛选出阳性的芳香化酶超表达鼠；

2、药物：

他莫昔芬与玉米油均购自sigma公司。

3、试验方法：

1）将2月龄腹股沟疝气及膀胱出口梗阻小鼠模型随机分为阳性对照组和他莫昔芬组。

2）药物注射：

将他莫昔芬粉末用进行震荡悬浮使其均匀溶解玉米油中，按照2.5mg/Kg/d背部注射给药，每隔24小时注射0.1ml，连续用药30天。

阳性对照组：小鼠背部注射玉米油，每隔24小时注射0.1ml，连续用药30天；

4、试验:

将药物他莫昔芬和玉米油处理过的小鼠，进行组织病理学分析、蛋白组学分析、基因表达变化分析等方法研究他莫昔芬对腹股沟疝气及尿道膀胱出口的治疗作用。

5、试验结果：

1）疝气症状：结果见图8：左边WT为野生小鼠，中间为阳性对照，右边为他莫昔芬组，与阳性对照组比较，他莫昔芬处理的小鼠疝气症状消失明显（疝气往往伴随着尿道梗阻）。

2）解剖学学分析：见图9。左边WT为野生小鼠，中间为阳性对照，右边为他莫昔芬组，与阳性对照组比较，他莫昔芬处理的小鼠没有尿潴留，尿潴留是膀胱出口梗阻的严重症（图9B中白色箭头所示膀胱的尿潴留）。

3）组织病理学分析：

图10所示：

A：野生型鼠尿道口的括约肌；

B：转基因鼠尿道口的括约肌；

C：他莫昔芬处理的转基因鼠尿道口的括约肌；

与阳性对照组比较，他莫昔芬处理的转基因鼠尿道口的括约肌恢复到对照鼠的宽度。（黑的线条表示尿道口的括约肌的横切面宽度）。

结果表明：他莫昔芬可治疗膀胱出口梗阻小鼠。

6、结论：用他莫昔芬来治疗膀胱出口梗阻及膀胱出口梗阻引起的下尿道综合征，症状减轻明显，治疗率为100%。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (8)

1.他莫昔芬在制备治疗男性膀胱出口梗阻及其引起的下尿道综合征的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述男性膀胱出口梗阻的症状是：尿频、尿急、排尿困难、淋漓不尽、排尿时间延长。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述膀胱出口梗阻引起的下尿道综合征的症状是：尿频、尿急、尿痛。

4.根据权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于，所述膀胱出口梗阻及其引起的下尿道综合征是由雌/雄激素比例失调引起的。

5.根据权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于，所述他莫昔芬为含他莫昔芬的制剂，由他莫昔芬与药学上可接受的载体或稀释剂组成。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述制剂为片剂、胶囊、颗粒剂、丸剂、口服液或注射剂。

7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述他莫昔芬的用量为1-50mg/Kg/d。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述他莫昔芬的用量为5-25mg/Kg/d。

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