CN102706787B - 菁染料的新用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供菁染料新用途，具体而言本发明涉及结肠癌检测试剂盒和系统，所述试剂盒包括式I的化合物和pH值6～8的缓冲液，所述系统包括式I的化合物和pH值6～8的缓冲液以及流式细胞仪，式I本发明的诊断系统灵敏度是传统单分子探针的100倍以上，准确率约97～99％，操作简单，检测时间短并且结果为量化数值，无需描述，无需经验，更加客观准确。
Description
技术领域
本发明属于医药领域，具体而言涉及一种可用于诊断结肠癌的超分子探针。
背景技术
结肠癌是指结肠粘膜上皮在环境或遗传等多种致癌因素作用下发生的恶性病变。是常见的恶性肿瘤之一，以40岁～50岁年龄组发病率最高，全球每年新发病例约800万人，占所有恶性肿瘤的10％～15％。
结肠癌在我国的发病率有增高的趋势。发病原因与遗传、结肠腺瘤、息肉病、慢性炎症性病变、少纤维、高脂肪饮食习惯等有一定关系。结肠癌起病隐匿，早期常无明显的临床表现，病情发展较慢，出现明显的症状时大多已到了中晚期，死亡率仅次于肺癌和肝癌，占我国恶性肿瘤第三位。结肠癌就是这样一个严重危害人们健康的可怕杀手。
结肠癌的早期症状多不为病人注意，就医时也常以“痢疾”、“肠炎”等病处理，一旦出现中毒症状或梗阻症状以及触及腹块时已非早期，主要的诊断方法有X线检查，内镜检查，血清癌胚抗原(CEA)检查，B型超声扫描，粪便检查等。但这些方法多数都需要较好的操作技巧以及丰富的临床经验，是比较主观的判断方法。取样简单的方法如血清和粪便检测操作略复杂，准确率不够好，且有一定的假阳性率。
菁染料是一种常用染料，具有独特的光敏感性质，几个世纪以来，伴随着其独特理化、光学性质被发现，逐渐被用作显影剂，光影剂，非线性光学材料等。
本发明人通过大量的研究，出乎意料地发现，菁染料与结肠癌组织能够特异性地结合，从而能够用于结肠癌的检测。
发明内容
本发明的一个方面是提供一种菁染料对结肠组织进行早期诊断的系统，所述系统包括试剂盒和流式细胞仪。
根据本发明的系统，其中所述试剂盒包括试剂I和试剂II，其中试剂I为pH值为6～8的缓冲液，试剂II为下式I所示的化合物：
式I
其中：其中：R1为C1-C6的烷基、苯基、烷基取代的苯基；R2、R3、R4和R5独立地选自H或C1-C6的烷基，或者R2和R3与它们所连接的碳原子一起形成5元至7元的环结构，或者R4和R5与它们所连接的碳原子一起形成5元至7元的环结构；R6和R7为C1-C6烷基或者磺酸基取代的C1-C6烷基；Y为反离子，根据R6和R7所带电荷的不同而不同，若R6和R7为烷基，则Y为卤素阴离子；若R6和R7只有一个带有磺酸根，则无需Y作为反离子；若R6和R7均带有磺酸根，则Y为三乙胺阳离子；；X1，X2独立地选自碳(C)、氧(O)、硫(S)、硒(Se)或碲(Te)。
根据本发明的系统，其中对于式I的化合物而言，其制备方法可以参考Leslie G.S.，Brooker and Frank L.W.，JACS，1935，547-551中记载的合成路线，也可以使用本领域熟知的其他方法来制备。
根据本发明的系统，其中试剂I优选为pH6～8的含有一价金属离子的缓冲液，优选含有钾离子或钠离子的缓冲液，包括但不限于磷酸钠-磷酸氢钠缓冲液、磷酸钾-磷酸氢钾缓冲液、巴比妥钠-盐酸缓冲液或柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。
根据本发明的系统，其中C1-C6的烷基为碳原子数为1-6的直链或支链的烷基，包括但不限于，甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、正己基或异己基等。
根据本发明的系统，其中R1选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、正己基、异己基、苯基、甲基苯基或二甲基苯基。
根据本发明的方法，其中R2、R3、R4和R5独立地选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、正己基或异己基。
根据本发明的系统，其中R2和R3与它们所连接的碳原子可以形成5元至7元的饱和环结构或不饱和环结构，所述环结构可以含或不含有氮(N)或硫(S)原子。
根据本发明的系统，其中R4和R5与它们所连接的碳原子可以形成5元至7元的饱和环结构或不饱和环结构，所述环结构可以含有或不含有N或S原子。
根据本发明的系统，其中Y优选为氟、氯、溴、碘阴离子或三乙胺阳离子。
本发明的一个方面提供一种诊断结肠癌的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)取得受试者的结肠病灶组织样品，并用pH值为6～8的缓冲液制备浓度为104～109个细胞/mL的单细胞悬液；
(2)向步骤(1)中获得的单细胞悬液中加入适量的式I的化合物以使单细胞悬液中式I的化合物浓度为0.5μM至200μM，并将获得的单细胞悬液先在25-40℃下孵育10分钟至8小时，然后在2-8℃下孵育10分钟至8小时；
(3)收集孵育后的细胞，用pH值为6～8的缓冲液洗涤，并重新悬浮，得到浓度为103～106个细胞/ml的单细胞悬液；
用流式细胞仪在515nm～650nm或670nm以上波长范围内对步骤(3)中获得的细胞悬液的荧光进行检测，计算有荧光信号产生的细胞占细胞总数的比例，即细胞的染色率；
通过大量的实验，本发明人发现，当受试者的结肠细胞的染色率大于40％，优选大于60％，更优选大于80％时，可认定受试者患有结肠癌。
根据本发明的方法，其中所述式I的化合物如前文所定义。
根据本发明的方法，其中所述缓冲液为含有一价金属离子的缓冲液，优选为含有钾离子或钠离子的缓冲液，包括但不限于磷酸钠-磷酸氢钠缓冲液、磷酸钾-磷酸氢钾缓冲液、巴比妥钠-盐酸缓冲液、巴比妥钾-盐酸缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液或柠檬酸-柠檬酸钾缓冲液。
与现有技术相比，本发明提供的用于诊断结肠癌的试剂盒及其方法以及诊断系统的优点在于：
高灵敏度，创新性的采用超分子荧光探针，灵敏度是传统单分子探针的100倍以上；
高特异性，正常细胞和癌细胞染色率差别很大，准确率约97～99％。
仅需一步染色反应，无需制作切片等，操作简单，检测时间短；
结果为量化数值，无需描述，无需经验，更加客观准确。
附图说明
图1是表示根据本发明一个实施例得到的受试样品的流式检测染色率统计图；
图2是表示根据本发明另一个实施例得到的受试样品的流式检测染色率统计图。
具体实施方式
下面将参照附图以具体实施例的方式来更详细地描述本发明，但是应当理解，本发明可以以不同的方式实施，提供这些实施例仅是为了使本说明书充分和完整，以使本领域技术人员能够实施本发明，本发明的范围不应当限定为本文所列的具体实施例。
实施例1
饲养50只裸鼠，20只作为空白对照，30只接种结肠癌细胞(GEO)于裸鼠体内，待肿瘤长成后，接种GEO的裸鼠取肿瘤组织，空白对照组直接取结肠组织细胞，制成单细胞悬液，用pH6的磷酸钠-磷酸氢钠缓冲液洗涤、悬浮，得到20份正常细胞悬液样品和30份肿瘤细胞悬液样品，各细胞悬液样品的浓度在104～109个细胞/mL的范围。
向每份样品中加入下式的化合物，以使该化合物在各样品中的终浓度为6μM
每份样品在37℃培养箱中孵育0.5小时，然后在4℃冰箱中继续孵育0.5小时。
孵育结束后将样品离心，去除染料溶液，用pH6的磷酸钠-磷酸氢钠缓冲液洗涤细胞，并制备103～106个细胞/ml的单细胞悬液。
用流式细胞仪检测各样品在564-606nm处的荧光信号，获得染色阳性细胞占细胞总数的比例，即染色率。
对通过以上方式获得的50份细胞样品的染色率进行统计分析，结果如图1所示。
参照图1，可以清楚地看出所有结肠癌样品染色率大于85％，所有对照样品的染色率均小于40％，因此，采用本实施例的诊断方式可以很容易地将正常细胞和结肠癌诱导的肿瘤细胞分开。
实施例2
采用与实施例1相同的步骤对以上50只裸鼠的肿瘤细胞和正常细胞进行检测，区别在于，所使用化合物为：
该化合物在各样品中的终浓度为2μM，孵育温度和时间为37℃下4小时，4℃下4小时，用流式细胞仪检测各样品670nm以上的荧光信号，获得各样品的染色率。
检测结果：所有结肠癌样品染色率大于75％，所有对照样品的染色率均小于35％，因此，采用本实施例的诊断方式可以很容易地将正常细胞和结肠癌诱导的肿瘤细胞分开。
实施例3
采用与实施例1相同的步骤对以上50只裸鼠的肿瘤细胞和正常细胞进行检测，区别在于，所使用的化合物为：
该化合物在各样品中的终浓度为：50μM，孵育温度和时间为37℃下10分钟，用流式细胞仪检测各样品670nm以上的荧光信号，获得各样品的染色率。
检测结果：所有结肠癌样品染色率大于90％，所有对照样品的染色率均小于40％，因此，采用本实施例的诊断方式可以很容易地将正常细胞和结肠癌诱导的肿瘤细胞分开。
实施例4
采用与实施例1相同的步骤对以上50只裸鼠的肿瘤细胞和正常细胞进行检测，区别在于，所使用的化合物为：
该化合物在各样品中的终浓度为：10μM，孵育温度和时间为37℃下2小时，4℃下2小时，用流式细胞仪检测各样品在564-606nm范围内的荧光信号，获得各样品的染色率。
检测结果：所有结肠癌样品染色率大于55％，所有对照样品的染色率均小于20％，因此，采用本实施例的诊断方式可以很容易地将正常细胞和结肠癌诱导的肿瘤细胞分开。
实施例5
采用与实施例1相同的步骤对以上50只裸鼠的肿瘤细胞和正常细胞进行检测，区别在于，所使用化合物为：
该化合物在各样品中的终浓度为100μM，孵育温度和时间为37℃下15分钟，4℃下15分钟，用流式细胞仪检测各样品670nm以上的荧光信号。
检测结果：所有结肠癌样品染色率大于85％，所有对照样品的染色率均小于40％，因此，采用本实施例的诊断方式可以很容易地将正常细胞和结肠癌诱导的肿瘤细胞分开。
实施例6
培养结肠癌细胞(GEO)。
培养正常细胞系，包括仓鼠卵巢细胞(CHO)，鼠胚胎成纤维细胞(NIH3T3)，人肺成纤维细胞(HLF)，人血管平滑肌细胞(HUMC)，人皮肤细胞(HaCaT)，将肿瘤细胞株和正常细胞系制成单细胞悬液，用pH8的柠檬酸-柠檬酸钾缓冲液洗涤、悬浮，得到正常细胞悬液样品和肿瘤细胞悬液样品，各细胞悬液样品的浓度在104～109个细胞/mL的范围。
向每份样品中加入下式的化合物，以使该化合物在各样品中的终浓度为1μM
每份样品在37℃培养箱中孵育1小时，然后在4℃冰箱中继续孵育1小时。
孵育结束后将各样品离心，去除染料溶液，分别用pH8的柠檬酸-柠檬酸钾缓冲液洗涤细胞，并重新悬浮，得到103～106个细胞/ml的单细胞悬液。
用流式细胞仪检测各单细胞悬液在564-606nm处的荧光信号，获得染色阳性细胞占各样品细胞总数的比例，即染色率。
对通过以上方式重复30次获得的30份体外培养细胞的染色率进行统计分析，结果如图2所示。
参照图2，可以清楚地看出所有结肠癌细胞样品染色率大于40％，所有正常肺细胞样品的染色率均小于25％，因此，采用本实施例的诊断方式可以很容易地将正常肺细胞和肺肿瘤细胞分开。
实施例7
采用与实施例6相同的步骤对结肠癌细胞和正常细胞株进行检测，区别在于，所使用化合物为：
该化合物在各样品中的终浓度为0.5μM，孵育温度和时间为37℃下4小时，4℃下4小时，用流式细胞仪检测各样品670nm以上的荧光信号，获得各样品的染色率。
检测结果：所有结肠癌细胞样品染色率大于45％，所有正常肺细胞样品的染色率均小于25％，因此，采用本实施例的诊断方式可以很容易地将正常肺细胞和肺肿瘤细胞分开。
实施例8
采用与实施例6相同的步骤对结肠癌细胞和正常细胞株进行检测，区别在于，所使用化合物为：
该化合物在各样品中的终浓度为200μM，孵育温度和时间为37℃下15分钟，4℃下15分钟，用流式细胞仪检测各样品在564-606nm范围的荧光信号，获得各样品的染色率。
检测结果：所有结肠癌细胞样品染色率大于90％，所有正常肺细胞样品的染色率均小于35％，因此，采用本实施例的诊断方式可以很容易地将正常肺细胞和肺肿瘤细胞分开。
需要说明的是，本发明实施例中所使用的流式细胞仪为Becton，Dickinson andCompany(BD公司)生产的FACSCalibur型号的流式细胞仪，其荧光激发波长为488nm和688nm，但是在本发明中对流式细胞仪的型号并不做任何限定，只要能够实施本发明的方法即可；在本发明的方法中对所各细胞悬液样品的浓度并不做特别的限定，只要能够满足流式细胞仪的检测要求即可，本领域技术人员可以根据需要来确定细胞悬液的浓度。
虽然已经以具体实施例的方式描述了本发明，但是对于本领域技术人员来说明显的是，在不脱离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围的情况下，可以对本发明进行各种变化和修改，这些变化和修改同样包括在本发明的范围内。
Claims (5)
1.下式化合物在制备用于检测结肠癌的试剂盒中的用途，其中所述试剂盒包括所述化合物和pH值为6～8的缓冲液
其中所述化合物在样品中的终浓度为100μM。
2.下式化合物在制备用于检测结肠癌的系统中的用途，其中所述系统包括所述化合物、pH值为6～8的缓冲液以及流式细胞仪，
其中所述化合物在样品中的终浓度为100μM。
3.如权利要求1或2所述的用途，其中所述缓冲液为含有一价金属离子的缓冲液。
4.如权利要求3所述的用途，其中所述缓冲液为含有钾离子或钠离子的缓冲液。
5.如权利要求3所述的用途，其中所述缓冲液选自磷酸钠-磷酸氢钠缓冲液、磷酸钾-磷酸氢钾缓冲液、巴比妥钠-盐酸缓冲液、巴比妥钾-盐酸缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液或柠檬酸-柠檬酸钾缓冲液。
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