CN102697731A - 5-氨基酮戊酸纳米粒及其制备方法和装置 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种涉及5-氨基酮戊酸纳米粒及其制备方法和和装置。所述5-氨基酮戊酸纳米粒，包括治疗有效量的5-氨基酮戊酸、离子络合剂和可生物降解聚合物。本发明的5-氨基酮戊酸纳米粒性质稳定，靶向选择性高，细胞吸收率高，“光漂白”现象减弱，光动力反应得到加强，可结合注射或微针给药提高组织渗透深度，具有较高的应用价值。

Description

5-氨基酮戊酸纳米粒及其制备方法和装置

技术领域

本发明涉及一种5-氨基酮戊酸的纳米粒制剂及其制备方法和装置。

技术背景

5-氨基酮戊酸，又名5-氨基左旋糖酸、5-氨基果糖酸、5-氨基乙酰丙酸，是一种水溶性的小分子氨基酸，是人体内合成原卟啉IX的前体化合物。当大量的外源性5-氨基酮戊酸进入到人体后，优先被非正常细胞吸收，合成过量的原卟啉IX。原卟啉IX作为一种光敏性物质，局部光照后产生单态氧、氧自由基等氧活性物质，对非正常细胞起到杀伤作用。基于有这样的作用机理，DUSA公司成功地将5-氨基酮戊酸开发成用于光动力治疗的光敏剂药物

随后国内复旦张江结合国情也推出自己的产品艾拉5-氨基酮戊酸光动力治疗已经成功地应用于治疗各种肿瘤、尖锐湿疣、痤疮等疾病，由于对正常组织无损伤、创伤性小、肿瘤靶向性好、可重复多次治疗等优点，成为目前国内外的研究热点。由于5-氨基酮戊酸分子量小，相对容易透过角质层，是目前唯一可用于局部外敷给药的光敏剂；此外，5-氨基酮戊酸凭借良好的光敏特性，较高的单态氧产出率，成为目前应用最为广泛的光敏剂，并且，无可替代。但是5-氨基酮戊酸仍然存在着一些不足限制了5-氨基酮戊酸光动力治疗的疗效。

①5-氨基酮戊酸稳定性差，进入体内后容易被水解、酶解。

②病变细胞对5-氨基酮戊酸吸收率有待提高。首先，5-氨基酮戊酸的亲水性影响其透过细胞膜的效率。其次，5-氨基酮戊酸对病变细胞的靶向选择性还有待进一步提高；

③“光漂白”现象影响5-氨基酮戊酸光动力治疗作用效果。5-氨基酮戊酸受到光照后，发生光敏反应生成单态氧，氧自由基，这些活性氧在氧化杀伤病变细胞的同时也会氧化5-氨基酮戊酸，使5-氨基酮戊酸结构发生变化，此外光敏剂光照后发生光敏反应的同时还发生光分解、光电离、光氧化还原等反应，使5-氨基酮戊酸失去光敏性。这种光照后活性光敏剂不断被消耗的现象，被称为“光漂白”现象。临床上由于“光漂白”现象的存在，使5-氨基酮戊酸光动力治疗作用减弱；

④5-氨基酮戊酸的渗透深度有限。虽然5-氨基酮戊酸作为一种内源性的小分子氨基酸，但由于亲水性强，较难通过完整的皮肤屏障，特别是对于体积大、侵袭深的皮肤鳞癌效果差。

针对5-氨基酮戊酸光动力治疗的上述不足，目前临床上并没有有效的解决方案，大多只是一味地提高5-氨基酮戊酸的敷药浓度以求更好的治疗效果，但是随之而来的是高浓度5-氨基酮戊酸对正常组织的连带损伤，引起疼痛、红斑、水肿、糜烂、甚至溃疡、疤痕。

欧洲专利（EP-2-236-129-A2）描述了一种5-氨基酮戊酸的脂质体制剂，对5-氨基酮戊酸的不足有一定的改善作用。但是脂质体在人体内并不稳定，容易过早地被破坏，所以并不能有效地起到保护5-氨基酮戊酸的作用，纳米级的5-氨基酮戊酸脂质体也无法发挥出纳米粒载体应有的优势。

此外，5-氨基酮戊酸是一种水溶性药物。目前，制备水溶性药物的聚合物纳米粒一般多采用复乳法。其过程描述为：取药物溶于内水相，聚合物材料溶于有机相，将内水相加入到有机相，采用物理机械方式（超声、搅拌、高压均质等）将其制备为油包水乳液，再将乳液倾入到含表面活性剂的外水相中，同样采用物理机械方式（超声、超声、搅拌、高压均质等）制备为水包油包水的复乳，然后分散于大量外水相中固化形成纳米粒。此法制得的水溶性药物

聚合物纳米粒，部分药物位于纳米粒表层，未能被包裹于聚合物纳米粒内部形成完整的核壳结构，能耗较高，制备过程中的机械力作用、热力作用容易破坏药物，制得的水溶性药物聚合物纳米粒包封率低，纳米粒粒径过大，大小不够均一；有机溶剂挥发、纳米粒固化所需的外水相体积大，使得制得的纳米粒胶体液中纳米粒浓度低，在冷冻干燥前对纳米粒胶体液进行浓缩时，操作困难容易损失纳米粒。

发明内容

本发明的目的是提供一种5-氨基酮戊酸纳米粒及其制备方法和装置，以克服现有技术的不足。

所述的5-氨基酮戊酸纳米粒，包括治疗有效量的5-氨基酮戊酸、离子络合剂和可生物降解聚合物；

优选的，5-氨基酮戊酸的重量含量，0.1-2%，离子络合剂的重量含量为0.1-20%，可生物降解聚合物的重量含量为78-99.8%，百分比之和为100%；

所说的可生物降解聚合物选自聚丙交酯、聚乙交酯、乙交酯-丙交酯共聚物、聚己内酯或聚乙二醇-乙交酯-丙交酯共聚物中的一种以上；

优选的，乙交酯-丙交酯共聚物，单体的摩尔比例的范围为50∶50-25∶75，可生物降解聚合物的重均分子量为5,000-180,000道尔顿，20,000-15,000道尔顿较为合适；

所述的离子络合剂选自磺基丁二酸钠二辛酯或硫酸葡聚糖钠，优选磺基丁二酸钠二辛酯；

制得纳米粒的平均直径10nm-200nm，优选的，50nm-100nm。

一种用于制备所述的5-氨基酮戊酸纳米粒的装置，包括密闭绝缘保护壳、高压电发生器、双通道喷管、接收杯和真空泵；

所述密闭绝缘保护壳罩在双通道喷管外，优选的，所采用的材料透明可视；

所述双通道喷管包括水相管道和油相管道，所述油相管道套在水相管道外，所述水相管道的上端穿过所述密闭绝缘保护壳与水相传输泵相连通，油相管道的上端穿过所述密闭绝缘保护壳与油相传输泵相连通，所述双通道喷管的下端向下延伸至所述密闭绝缘保护壳的下部；

所述真空泵与所述密闭绝缘保护壳的真空口相连通；

所述高压电发生器的一个电极连接与所述的双通道喷管通过导线相连接，另一个电极与所述的接收杯相连接；

所述高压电发生器为变压器；

所述的双通道喷管和接收杯的材料为导电的金属材料；

所述的接收杯设置在所述双通道喷管的下部的密闭绝缘保护壳的底部；

采用上述的装置，制备本发明的5-氨基酮戊酸纳米粒的方法，包括如下步骤：

（1）打开真空泵，使密闭绝缘保护壳内形成真空，压强小于一个标准大气压，以压强范围在“1333Pa-0.133Pa”较为合适；

打开高压电发生器，使双通道喷管的上方与接收杯之间形成6～8，优选7千伏的高压电场，电流为0.1-20mA；

（2）将内水相溶液通过水相传输泵送入水相管道，将油相溶液通过油相传输泵油相管道，在双层喷嘴出口处汇合形成油包水乳液，在高压电场的作用下，油包水乳液崩碎成极小的液滴，由于真空状态的存在，裂解更为充分，形成的液滴更小，由双层喷嘴处喷出，进入接收杯；

所述的内水相溶液为含有5-氨基酮戊酸和离子络合剂的磷酸盐缓冲液，pH为3～5；

5-氨基酮戊酸的重量含量为1-5%，以2-3%较为合适；

离子络合剂为5-氨基酮戊酸重量的1-10倍，以1-3倍较为合适；

所述的油相溶液为含有可生物降解聚合物的有机溶剂，可生物降解聚合物的重量含量5-20%，以7-12%较为合适；

所述有机溶剂选自二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、四氢呋喃、甲醇、乙腈、丙酮、乙醇、N，N-二甲基吡咯烷酮、苯甲醇、碳酸丙烯、N,N-二甲基酰胺或二甲基亚砜等；

内水相溶液与油相溶液的重量比为：内水相溶液∶油相溶液＝1：0.54～1：18.75；

双层喷嘴汇合处，内水相溶液的容积速度为0.1—10.0ml/h，油相溶液的容积速度为0.5-20ml/h；

（3）所述接收杯中装有外水相溶液，进入接收杯的油包水的纳米粒初乳，形成水包油包水的纳米粒复乳，搅拌器搅拌1～3小时，挥去有机溶剂，获得固化的纳米粒。然后水洗、离心去除多余物质，并浓缩纳米粒胶体液。最后，收集浓缩固化后的纳米粒胶体液，-20℃～-30℃冷冻减压干燥，即得5-氨基酮戊酸纳米粒，为一种5-氨基酮戊酸纳米粒冻干粉；

所述的外水相溶液为溶解有聚乙烯醇的磷酸盐缓冲液，pH为3～5，聚乙烯醇重量含量为0.05-5%。

动物试验证明，本发明获得的5-氨基酮戊酸纳米粒，可以用于治疗日光性角化、基底细胞癌、鳞状细胞癌、食管癌、恶性胶质瘤、膀胱癌等各种肿瘤及癌前期病变，痤疮、尖锐湿疣、头癣等各种细菌真菌病毒感染以及抗光老化等各种衰老性疾病中的应用。

本发明是利用生物可降解的聚合物材料乙交酯-丙交酯共聚物、其单体聚合物、或改性材料，来包裹5-氨基酮戊酸，形成纳米粒或纳米胶束，克服原有药物5-氨基酮戊酸的不足。高压电喷雾法制备聚合物纳米粒是利用液流在高压电场中易形成泰勒锥后崩碎形成极细的小液滴，制备成复乳纳米粒。该法制备的纳米粒可将药物包裹于聚合物内部，形成完整的核壳结构，且能耗相对较低，制备条件温和，不易破坏药物，可克服传统机械法制备复乳，导致药物包封率低、纳米粒表层含药物较多的缺点。在此基础上，再将真空减压技术和高压电喷雾法相结合，用于制备纳米粒，相比单用高压电喷雾法，制得的纳米粒颗粒更小，大小更均一，有机溶剂挥发、纳米粒固化所需的时间和外水相体积更少。制备时间减少，有利于降低对原料药的破坏，提高包封率。外水相体积减少，有利于提高纳米粒胶体液中纳米粒浓度，利于后期冷冻干燥前纳米粒胶体液的浓缩，降低制备过程中纳米粒的损失。本发明解决了诸多纳米粒制备的难题，适用于原料药、辅料易溶于上述有机溶剂或水中的各种纳米粒的制备。

本发明的5-氨基酮戊酸纳米粒性质稳定，包封率高，靶向选择性高，细胞吸收率高，“光漂白”现象减弱，光动力反应得到加强，对人体没有毒副作用，可结合注射或微针给药提高组织渗透深度，具有较高的应用价值。

附图说明

图1为高压电喷雾纳米粒制备仪结构示意图。

图2，3，4，5为5-氨基酮戊酸纳米粒的体外释放曲线。

图6，7，8，9为5-氨基酮戊酸纳米粒与5-氨基酮戊酸对人鳞癌A431细胞的体外光动力治疗结果。

具体实施方式

参见图1，用于制备所述的5-氨基酮戊酸纳米粒的装置，包括密闭绝缘保护壳3、高压电发生器4、双通道喷管5、接收杯7和真空泵9；

所述密闭绝缘保护壳3罩在双通道喷管5外；

所述双通道喷管5包括水相管道1和油相管道2，所述油相管道2套在水相管道1外，所述水相管道1的上端穿过所述密闭绝缘保护壳3与水相传输泵11相连通，油相管道2的上端穿过所述密闭绝缘保护壳3与油相传输泵21相连通，所述双通道喷管5的下端向下延伸至所述密闭绝缘保护壳3的下部；

所述真空泵9与所述密闭绝缘保护壳3的真空口31相连通；

所述高压电发生器4的一个电极连接与所述的双通道喷管5通过导线相连接，另一个电极与所述的接收杯7相连接；

所述高压电发生器4为变压器；

所述的接收杯7设置在所述双通道喷管5的下部的密闭绝缘保护壳3的底部；

所述的双通道喷管5和接收杯7的材料为导电的金属材料；

优选的，所述的双通道喷管5的下部设有双层喷嘴6；

优选的，所述的接收杯7中设有搅拌器8。

实施例1

处方1：

5-氨基酮戊酸：4mg；

磺基丁二酸钠二辛酯：4mg；

乙交酯-丙交酯共聚物3992mg；

乙交酯-丙交酯共聚物，单体的摩尔比例为50∶50，重均分子量为5,000道尔顿；

采用图1的装置制备所述的5-氨基酮戊酸纳米粒。

工艺参数如下：

密闭绝缘保护壳3内，压强为1333Pa；

双通道喷管5的上方与接收杯7之间形成7千伏的高压电场，电流为20mA；

所述的内水相溶液为含有5-氨基酮戊酸和离子络合剂磺基丁二酸钠二辛酯的磷酸盐缓冲液，pH为5；

5-氨基酮戊酸的重量含量为1%；

离子络合剂为5-氨基酮戊酸重量的1倍；

离子络合剂为磺基丁二酸钠二辛酯；

油相溶液为含有可生物降解聚合物－乙交酯-丙交酯共聚物的有机溶剂，乙交酯-丙交酯共聚物的重量含量20％；有机溶剂为二氯甲烷；

内水相溶液与油相溶液的重量比为：水相溶液∶油相溶液＝1∶18.75；

双层喷嘴6汇合处，内水相溶液与油相溶液的容积速度分别为：0.1ml/h和0.5ml/h；

搅拌器8搅拌3小时以获得固化的纳米粒。然后，离心、水洗以去除多余物质，并浓缩纳米粒胶体液。最后，收集浓缩固化后的纳米粒胶体液，-30℃冷冻减压干燥，即得5-氨基酮戊酸纳米粒，为一种5-氨基酮戊酸纳米粒冻干粉；

外水相溶液为溶解有聚乙烯醇的磷酸盐缓冲液，pH为5，聚乙烯醇重量含量为5%。

实施例2

处方2：

5-氨基酮戊酸：1g；硫酸葡聚糖：10g；乙交酯-丙交酯共聚物：39g，单体的摩尔比例为25∶75，重均分子量为180,000道尔顿；

采用图1的装置制备所述的5-氨基酮戊酸纳米粒。

工艺参数如下：

密闭绝缘保护壳3内，压强为0.133Pa；

双通道喷管5的上方与接收杯7之间形成7千伏的高压电场，电流为0.1mA；

所述的内水相溶液为含有5-氨基酮戊酸和离子络合剂硫酸葡聚糖的磷酸盐缓冲液，pH为3；

5-氨基酮戊酸的重量含量为5%；

离子络合剂为5-氨基酮戊酸重量的10倍；

离子络合剂为硫酸葡聚糖钠；

油相溶液为含有可生物降解聚合物－乙交酯-丙交酯共聚物的有机溶剂，乙交酯-丙交酯共聚物的重量含量5％；

有机溶剂为丙酮；

内水相溶液与油相溶液的重量比为：水相溶液∶油相溶液＝1∶0.54；

双层喷嘴6汇合处，水相溶液与油相溶液的容积速度分别为：10ml/h，20ml/h;

搅拌器8搅拌3小时以获得固化的纳米粒。然后，离心、水洗以去除多余物质，并浓缩纳米粒胶体液。最后，收集浓缩固化后的纳米粒胶体液，-20℃冷冻减压干燥，即得5-氨基酮戊酸纳米粒，为一种5-氨基酮戊酸纳米粒冻干粉；

外水相溶液为溶解有聚乙烯醇的磷酸盐缓冲液，pH为3，聚乙烯醇重量含量为0.05%。

实施例3

处方3：

5-氨基酮戊酸：1g；磺基丁二酸钠二辛酯：2g；聚乙二醇-乙交酯-丙交酯共聚物47g，乙交酯-丙交酯单体的摩尔比例为25∶75，重均分子量为65,000道尔顿；

采用图1的装置制备所述的5-氨基酮戊酸纳米粒。

工艺参数如下：

密闭绝缘保护壳3内，压强为13Pa；

双通道喷管5的上方与接收杯7之间形成7千伏的高压电场，电流为10mA；

所述的内水相溶液为含有5-氨基酮戊酸和离子络合剂磺基丁二酸钠二辛酯的磷酸盐缓冲液，pH为4；

5-氨基酮戊酸的重量含量为2.5%；

离子络合剂为5-氨基酮戊酸重量的2倍；

所述的油相溶液为含有可生物降解聚合物－聚乙二醇-乙交酯-丙交酯共聚物的有机溶剂，聚乙二醇-乙交酯-丙交酯共聚物的重量含量9.1%；

有机溶剂为二氯甲烷和丙酮（1：0.1，体积）的混合溶剂；

内水相溶液与油相溶液的重量比为：水相溶液∶油相溶液＝1∶3.5；

双层喷嘴6汇合处，水相溶液与油相溶液的容积速度分别为：2ml/h，20ml/h;

搅拌器8搅拌2小时以获得固化的纳米粒。然后，离心、水洗以去除多余物质，并浓缩纳米粒胶体液。最后，收集浓缩固化后的纳米粒胶体液，-28℃冷冻减压干燥，即得5-氨基酮戊酸纳米粒，为一种5-氨基酮戊酸纳米粒冻干粉；

外水相溶液为溶解有聚乙烯醇的磷酸盐缓冲液，pH为4，聚乙烯醇重量含量为0.5%。

实施例4

处方4：

5-氨基酮戊酸：1g；硫酸葡聚糖：3g；聚乙二醇-乙交酯-丙交酯共聚物：96g，乙交酯-丙交酯单体的摩尔比例为25∶75，重均分子量为85,000道尔顿；

采用图1的装置制备所述的5-氨基酮戊酸纳米粒。

工艺参数如下：

密闭绝缘保护壳3内，压强为130Pa；

双通道喷管5的上方与接收杯7之间形成7千伏的高压电场，电流为8mA；

所述的内水相溶液为含有5-氨基酮戊酸和离子络合剂硫酸葡聚糖的磷酸盐缓冲液，pH为4；

5-氨基酮戊酸的重量含量为3%；

离子络合剂为5-氨基酮戊酸重量的3倍；

所述的油相溶液为含有可生物降解聚合物－聚乙二醇-乙交酯-丙交酯共聚物的有机溶剂，聚乙二醇-乙交酯-丙交酯共聚物的重量含量9.1%；

有机溶剂为二氯甲烷和丙酮（1：0.1，体积）的混合溶剂；

内水相溶液与油相溶液的重量比为：水相溶液∶油相溶液＝1∶6.7；

双层喷嘴6汇合处，水相溶液与油相溶液的容积速度分别为：3.6ml/h，20ml/h;

搅拌器8搅拌2小时以获得固化的纳米粒。然后，离心、水洗以去除多余物质，并浓缩纳米粒胶体液。最后，收集浓缩固化后的纳米粒胶体液，-26℃冷冻减压干燥，即得5-氨基酮戊酸纳米粒，为一种5-氨基酮戊酸纳米粒冻干粉；

外水相溶液为溶解有聚乙烯醇的磷酸盐缓冲液，pH为4，聚乙烯醇重量含量为0.5%。

实施例5

纳米粒包封率的测定方法：

精密称取实施例1的5-氨基酮戊酸纳米粒冻干粉溶解于磷酸缓冲液（pH5）中，离心后纳米粒沉淀，再分别测定沉淀纳米粒中的5-氨基酮戊酸即包裹药物量，以及磷酸缓冲液（pH5）中5-氨基酮戊酸及游离药物量，以确定纳米粒的包封率。

5-氨基酮戊酸分析方法：

采用柱前衍生化高效液相-荧光法测定，以荧光胺为荧光衍生化试剂，采用C₁₈柱（4.6mm×250mm，5μm)，乙腈-水（0.1%三氟乙酸）（30：70）为流动相，流速1.5ml·min^-1，激发波长/发射波长为398/480nm。

包封率=包裹药物量/（游离药物量+包裹药物量）×100%。

测得实施例1的5-氨基酮戊酸包封率为76%。

采用相同的方法，测得实施例2的5-氨基酮戊酸包封率为68%；测得实施例3的5-氨基酮戊酸包封率为75%；测得实施例4的5-氨基酮戊酸包封率为72%。

实施例6

纳米粒缓释的测定方法：

取实施例1的5-氨基酮戊酸纳米粒冻干粉适量置于具塞管中，加入生理等渗磷酸盐缓冲液(取磷酸二氢钠1.84g、磷酸氢二钠19.1g、叠氮化钠0.2g、吐温-801g、氯化钠4.32g，加水至1000ml，调节pH为5形成胶体液，使5-氨基酮戊酸为1mg/ml，取其中1.5ml置于透析袋中，排气后，扎紧端口，放于10ml磷酸盐缓冲液的具塞锥形瓶中。将锥形瓶置于37℃恒温水浴震荡箱中，定时取样，每次取样后更换全部释放介质，得到的样品与荧光胺进行衍生化反应，采用柱前衍生化高效液相-荧光法测定5-氨基酮戊酸的含量，计算5-氨基酮戊酸纳米粒的累积释放量。结果见图2，可见5-氨基酮戊酸纳米粒的释药速度快，释药时间6h左右，符合临床光动力治疗的要求。

采用相同的方法，对实施例2，3，4的实施例进行检测，结果分别见图3，4，5。

实施例7

红外光谱仪检测

采用溴化钾压片法红外光谱仪测定5-氨基酮戊酸、乙交酯-丙交酯共聚物和实施例1中的5-氨基酮戊酸乙交酯-丙交酯共聚物纳米粒的红外光谱。在25℃，相对湿度50%的条件下，分别取5-氨基酮戊酸、乙交酯-丙交酯共聚物和5-氨基酮戊酸乙交酯-丙交酯共聚物纳米粒适量，在玛瑙研钵中研磨变细，再加入适量溴化钾，再次研细研匀。随后将研细的粉末进行压片，得到均匀的透明薄片，干燥后采用Perkin Elmer Spectrum oneFT-IR Spectrometer光谱仪进行光谱测定。观察5-氨基酮戊酸乙交酯-丙交酯共聚物纳米粒中5-氨基酮戊酸与乙交酯-丙交酯共聚物的结构是否发生变化。

结果红外光谱仪扫描波谱显示实施例1中的5-氨基酮戊酸乙交酯-丙交酯共聚物纳米粒中5-氨基酮戊酸的结构无变化，证实5-氨基酮戊酸存在于乙交酯-丙交酯共聚物纳米粒中，且未与辅料乙交酯-丙交酯共聚物发生反应，保持了药物活性。

采用相同的方法，对实施例2，3，4的5-氨基酮戊酸纳米粒冻干粉进行检测，结果也证实5-氨基酮戊酸纳米粒中5-氨基酮戊酸的结构也无变化。

实施例8

差示扫描量热法检测

分别取少量5-氨基酮戊酸、乙交酯-丙交酯共聚物纳米粒和实施例1的5-氨基酮戊酸乙交酯-丙交酯共聚物纳米粒冻干粉，采用差示扫描量热仪专用制样器，制成上机样品后，按差示扫描量热仪操作规范进行检测，每分钟升温10℃，根据检测到的吸热峰，判断5-氨基酮戊酸在乙交酯-丙交酯共聚物纳米粒中是否生成新的物相。

结果5-氨基酮戊酸在158℃附近出现熔融吸热峰，5-氨基酮戊酸与乙交酯-丙交酯共聚物纳米粒的物理混合物在157℃处也有此熔融吸热峰，但稍有较弱。而5-氨基酮戊酸乙交酯-丙交酯共聚物则无此熔融吸热峰。说明5-氨基酮戊酸在乙交酯-丙交酯共聚物纳米粒中形成了新的物相，以无定形存在。

采用相同的方法，对实施例2，3，4的处方进行检测，结果也证实5-氨基酮戊酸纳米粒中也形成了新的物相，以无定形存在。

实施例9

5-氨基酮戊酸纳米粒及其细胞吸收的形态学观察

取实施例1的冻干粉1mg，复溶于10ml蒸馏水中得到纳米胶体液。吸管吸取少许胶体液，滴于硅片上，自然晾干，喷金后在扫描电子显微镜下观察粒子的表面形态。

结果显示：实施例1的5-氨基酮戊酸纳米粒在扫描电镜下呈典型的球形，圆润饱满，大小均匀，表面光滑，分散性好，无溶解、粘连，平均粒径大小为65nm左右。

将鳞癌A431细胞（3×105/cm2，2ml）接种到两块培养皿中，分别加入新鲜配制的含5-氨基酮戊酸终浓度为0.1mmol/l的5-氨基酮戊酸纳米粒和5-氨基酮戊酸培养基2ml，37.0℃、5％C02条件下锡箔纸包裹避光培养4h。4h后吸去含药培养液，PBS漂洗二次，加入5ml 2%戊二醛PBS固定液固定2小时，4℃保存过夜，次日送电镜室，刮下固定好的细胞，PBS漂洗二次进行后固定，4℃下1%锇酸PBS固定液固定2小时，送电镜室制样，采用PHILIP(荷兰菲利浦公司)CM-120透射电镜进行观察。

结果电镜可见，5-氨基酮戊酸纳米粒与鳞癌A431细胞共孵育后5-氨基酮戊酸纳米粒大量的被鳞癌细胞吸收，以完整的球形形态，密集分布于细胞质内，每个细胞可见吸收200-20000个左右的5-氨基酮戊酸纳米粒。

采用相同的方法，对实施例2，3，4的处方进行检测，结果显示：实施例2，3，4的5-氨基酮戊酸纳米粒在扫描电镜下也呈典型的球形，圆润饱满，大小均匀，表面光滑，分散性好，无溶解、粘连，平均粒径大小为60-70nm左右。实施例2，3，4的5-氨基酮戊酸纳米粒与鳞癌A431细胞共孵育后5-氨基酮戊酸纳米粒大量的被鳞癌细胞吸收，以完整的球形形态，密集分布于细胞质内，每个细胞可见吸收200-20000个左右的5-氨基酮戊酸纳米粒。说明5-氨基酮戊酸纳米粒对肿瘤细胞的靶向选择性高。

实施例10

稳定性考察

实施例1制得的5-氨基酮戊酸纳米粒置于-20℃、4℃、室温三种不同条件下保存，3个月，6个月，12个月后分别采用激光粒度测定仪检测其粒径变化，扫描电镜检测其表面形态，按“实施例2”方法检测包封率、和载药量。以明确5-氨基酮戊酸纳米粒在三种温度下的稳定性。

结果-20℃条件下12个月后粒径大小、表面形态、包封率、载药量均无明显变化；4℃条件下，6个月后粒径大小、表面形态、包封率均无明显变化，12个月后粒径略有变小，部分纳米粒形态由球形变橄榄状，包封率载药量稍有下降；室温下3个月后粒径变小，纳米粒形态由球形变橄榄状，包封率载药量下降。说明本5-氨基酮戊酸纳米粒在-20℃状态下保存，稳定性好不易降解、破裂，药物载药量无变化。

采用相同的方法，对实施例2，3，4的处方进行考察，结果两种处方制得的5-氨基酮戊酸纳米粒在稳定性上没有明显的差别。

实施例11

细胞学研究：

采用人鳞癌细胞A431作为研究对象，对比实施例1制得的5-氨基酮戊酸纳米粒和5-氨基酮戊酸对细胞的杀伤作用。取2×10⁵/ml细胞培养在96孔板上，分为a、b、c三组，每组6孔，培养24h后，更换培养液，a组培养液中加入5-氨基酮戊酸含量为0.1mol/l的5-氨基酮戊酸纳米粒，b组培养液中加入与a组相同含量5-氨基酮戊酸的5-氨基酮戊酸，c组培养液中不加入5-氨基酮戊酸。避光培养24小时后，先用磷酸缓冲液漂洗3次再加入新鲜的无血清培养基，给予635nm半导体激光照射，光能量密度为10J/cm²，光功率密度为60mW/cm²再培养24小时后用MTT法计算细胞生存率。

结果如图6所示，5-氨基酮戊酸纳米粒组对人鳞癌细胞的杀伤作用强于5-氨基酮戊酸组，差异有统计学意义（P<0.01）。

采用相同的方法，对实施例2，3，4制得的5-氨基酮戊酸纳米粒进行考察，结果如图7，8，9所示，5-氨基酮戊酸纳米粒组对人鳞癌细胞的杀伤作用也强于5-氨基酮戊酸组，两组差异有统计学意义（P<0.01）。说明5-氨基酮戊酸纳米粒加强了光动力反应。

Claims (10)

1.5-氨基酮戊酸纳米粒，其特征在于，所述的5-氨基酮戊酸纳米粒，包括治疗有效量的5-氨基酮戊酸、离子络合剂和可生物降解聚合物。

2.根据权利要求1所述的5-氨基酮戊酸纳米粒，其特征在于，5-氨基酮戊酸的重量含量为0.1-2%，离子络合剂的重量含量为0.1-20%，可生物降解聚合物的重量含量为78-99.8%，总量为100%。

3.根据权利要求1所述的5-氨基酮戊酸纳米粒，其特征在于，所说的可生物降解聚合物选自聚丙交酯、聚乙交酯、乙交酯-丙交酯共聚物、聚己内酯或聚乙二醇-乙交酯-丙交酯共聚物中的一种以上。

4.根据权利要求2所述的5-氨基酮戊酸纳米粒，其特征在于，所说的可生物降解聚合物选自聚丙交酯、聚乙交酯、乙交酯-丙交酯共聚物、聚己内酯或聚乙二醇-乙交酯-丙交酯共聚物中的一种以上。

5.根据权利要求1～4任一项所述的5-氨基酮戊酸纳米粒，其特征在于，乙交酯-丙交酯共聚物，单体的摩尔比例的范围为50∶50-25∶75，生物可降解聚合物的重均分子量为5,000-180,000道尔顿。

6.根据权利要求1～4任一项所述的5-氨基酮戊酸纳米粒，其特征在于，所述的离子络合剂选自磺基丁二酸钠二辛酯或硫酸葡聚糖钠。

7.根据权利要求5所述的5-氨基酮戊酸纳米粒，其特征在于，所述的离子络合剂选自磺基丁二酸钠二辛酯或硫酸葡聚糖钠。

8.用于制备权利要求1～7任一项所述的5-氨基酮戊酸纳米粒的装置，其特征在于，包括密闭绝缘保护壳（3）、高压电发生器（4）、双通道喷管（5）、接收杯（7）和真空泵（9）；

所述密闭绝缘保护壳（3）罩在双通道喷管（5）外；

所述双通道喷管（5）包括水相管道（1）和油相管道（2），所述油相管道（2）套在水相管道（1）外，所述水相管道（1）的上端穿过所述密闭绝缘保护壳（3）与水相传输泵（11）相连通，油相管道（2）的上端穿过所述密闭绝缘保护壳（3）与油相传输泵（21）相连通，所述双通道喷管（5）的下端向下延伸至所述密闭绝缘保护壳（3）的下部；

所述真空泵（9）与所述密闭绝缘保护壳（3）的真空口(31)相连通；

所述高压电发生器(4)的一个电极连接与所述的双通道喷管(5)通过导线相连接，另一个电极与所述的接收杯(7)相连接；

所述的接收杯(7)设置在所述双通道喷管（5）的下部的密闭绝缘保护壳（3）的底部；

所述的双通道喷管（5）和接收杯（7）的材料为导电的金属材料。

9.根据权利要求8所述的装置，其特征在于，所述的双通道喷管（5）的下部设有双层喷嘴（6），所述的接收杯（7）中设有搅拌器（8）。

10.采用权利要求8或9所述的装置，制备本发明的5-氨基酮戊酸纳米粒的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）打开真空泵，使透明密闭绝缘保护壳内形成真空，压强为1333Pa-0.133Pa；

打开高压电发生器，使双通道喷管的上方与接收杯之间形成6～8千伏的电场，电流为0.1-20mA；

（2）将内水相溶液通过水相传输泵送入水相管道，将油相溶液通过油相传输泵油相管道，在双层喷嘴出口处汇合形成油包水乳液，由双层喷嘴处喷出，进入接收杯；

所述的内水相溶液为含有5-氨基酮戊酸和离子络合剂的磷酸盐缓冲液，pH为3～5；

5-氨基酮戊酸的重量含量为1-5%；

离子络合剂为5-氨基酮戊酸重量的1-10倍；

所述的油相溶液为含有生物可降解聚合物的有机溶剂，生物可降解聚合物的重量含量为5-20%；

所述有机溶剂选自二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、四氢呋喃、甲醇、乙腈、丙酮、乙醇、N，N-二甲基吡咯烷酮、苯甲醇、碳酸丙烯、N,N-二甲基酰胺或二甲基亚砜等；

内水相溶液与油相溶液的重量比为：内水相溶液∶油相溶液＝1：0.54～1：18.75；

双层喷嘴汇合处，内水相溶液的容积速度为0.1—10.0ml/h，油相溶液的容积速度为0.5-20ml/h；

（3）所述接收杯装有外水相溶液，进入接收杯的产物形成水包油包水的纳米粒复乳，搅拌器搅拌1～3小时，挥去有机溶剂，获得固化的纳米粒，然后水洗、离心，收集固化的纳米粒，-20℃～-30℃冷冻减压干燥，即得5-氨基酮戊酸纳米粒，为一种5-氨基酮戊酸纳米粒冻干粉；

所述的外水相溶液为溶解有聚乙烯醇的磷酸盐缓冲液，pH为3～5，聚乙烯醇重量含量为0.05-5%。

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