CN102696863A - 一种混菌固态发酵制备羽毛粉添加剂的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种混菌固态发酵制备羽毛粉添加剂的方法，采用菌种为地衣芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌。保藏编号分别为：CGMCC No.1699、CGMCC No.5313、CGMCC No.1398，本发明中采用固态发酵，将打碎后的羽毛经处理制成固态发酵培养基，三种菌按一定比例进行混合，以适宜接种量接入发酵培养基中。本发明可有效提高羽毛的水解效率，提高了发酵产物中氨基酸和可溶性蛋白的含量，氨基酸含量可达到170.98mg/g，可溶性蛋白含量可达到9.42mg/g，从而为饲料行业提供了高营养的饲料添加剂，并从一定程度有效的避免资源浪费和环境污染。
Description
技术领域：
本发明属于微生物应用领域，涉及一种羽毛粉角蛋白生物降解方法，尤其是一种混菌固态发酵制备羽毛粉添加剂的方法。
背景技术：
近年来，随着我国禽畜类行业的不断发展，产生了大量的禽畜废弃物，其中以羽毛废弃物最多。羽毛的主要成分以角蛋白为主，其粗蛋白含量占羽毛含量的80%以上，氨基酸含量也占70%左右，同时含有大量的常量元素、微量元素、维生素以及一些未知生长因子，是一种良好的、可替代或部分替代鱼粉的饲料蛋白来源。目前羽毛角蛋白的处理方法主要有传统水解法和生物技术法。传统的高温蒸煮或化学处理方法虽可以改进角蛋白的消化率，使其能够为禽畜所吸收，但存在能耗大、产品的营养组成易被破坏、三废不易处理等问题。因此近年来利用生物技术途径开发羽毛角蛋白资源,已成为国内外研究热点,主要技术途径包括微生物降解和酶降解两种。
目前国内外对羽毛微生物水解的研究主要集中在液态深层发酵对羽毛的分解作用，但其主要针对对环境废弃物的处理，对分解产物回收利用率低，浪费了大量的氨基酸和可溶性蛋白。用作禽畜饲料还需要大量的步骤，耗能耗时，且产生大量的废液，会对环境会产生一定的污染。另外，国内外对羽毛水解的研究重点更多集中于单一菌种对羽毛的分解作用，单一菌种主要以分泌角蛋白酶对以角蛋白为主的羽毛进行分解，其产酶量少，酶活偏低，不能高效快捷的水解角蛋白。
发明内容
本发明针对现有技术的不足之处，提供一种羽毛分解效率高、工艺简单、实用性强、能直接用于饲料添加剂的混菌固态发酵制备羽毛粉添加剂的方法。
本发明实现目的的技术方案如下：
一种混菌固态发酵制备羽毛粉添加剂的方法，其特征在于：包括将羽毛破碎的步骤、制备发酵培养基的步骤、加入混菌发酵的步骤、发酵后处理步骤，最终获得羽毛粉添加剂；所述混菌包括地衣芽孢杆菌CGMCC No.1699、嗜碱芽孢杆菌CGMCC No.5313、枯草芽孢杆菌CGMCC No.1398。
而且，所述地衣芽孢杆菌终浓度CGMCC No.16992.51×1010CFU/g、嗜碱芽孢杆菌CGMCC No.53132.48×1010CFU/g、枯草芽孢杆菌CGMCC No.13981.30×1010CFU/g，其中g为羽毛重量。
而且，所述发酵培养基为g/L：羽毛1-10、K2HPO4 1-5、KH2PO4 0.4-5、NaCl 0.4-5、麦芽糖1-5、NH4Cl 1.5-5。
而且，所述加入混菌发酵的条件为：相对湿度80-90%、温度维持在30-40℃，初始pH值自然，发酵时间为40-80h。
而且，所述发酵后处理步骤为调节发酵产物pH至7.0-7.2，烘干灭菌，打碎，得到羽毛粉添加剂。
本发明的优点及积极效果是：
1、本发明将羽毛直接打碎，采用固态发酵与混菌发酵相结合的方法，有效提高羽毛的水解效率，使水解后的羽毛产品所含氨基酸量达到170.98mg/g，可溶性蛋白含量可达到9.42mg/g，为饲料行业提供了高营养的饲料添加剂，避免羽毛资源浪费和对环境的污染。
2、本发明采用预先将羽毛打碎，浸泡于培养液中的方法，可以在菌株生长的初始阶段提供使其更容易吸收利用的碳氮源和无机离子，能够使菌体量快速增长，提高其分解羽毛的效率，减少固态发酵所需的时间，同时打碎羽毛可增加固态发酵培养基之间的孔隙度，使水分和氧气能够进入羽毛间隙，为这三种好氧型细菌提供必要的水分和氧气，提高菌种的繁殖速度，提高发酵效率。
3、本发明采用混合菌种固态发酵制备羽毛饲料的方法，可以有效减少废液的产生，减少的生产饲料的工序，降低能源消耗，同时将大量废弃羽毛重新利用，变废为宝，将其生产为高蛋白、高氨基酸的饲料，使羽毛中的营养成分被充分利用，为有效解决蛋白饲料不足对禽畜业发展的制约，缓解饲养业对粮食的消耗提供了有效的途径，同时也可以有效的减轻环境污染和资源浪费。
4、本发明采用混菌发酵的方法，能够发挥地衣芽孢杆菌CGMCC No.1699、嗜碱芽孢杆菌CGMCC No.5313、枯草芽孢杆菌CGMCC No.1398的协同作用，有效提高水解羽毛的效率，减少单一菌株发酵所耗费的时间，提高氨基酸和可溶性蛋白的产生量，为禽畜类饲料提供更有营养的添加剂。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
本发明采用预先将羽毛打碎，浸泡于特制的发酵培养液中的方法，可以在菌株生长的初始阶段提供使其更容易吸收利用的碳氮源和无机离子，增加固态发酵培养基的含水量，从而提供微生物生长所必需的水分，以提高其分解羽毛的效率，减少固态发酵所需的时间，打碎羽毛可增加固态发酵培养基之间的孔隙，使水分均匀分布并有利于溶氧，获得羽毛粉添加剂可作为氨基酸饲料添加剂。
一种混菌固态发酵制备羽毛粉添加剂的方法，具体步骤如下：
⑴羽毛粉的制备：羽毛用洗洁精洗涤，放入1mol/L NaOH溶液中浸泡30min，用水冲净后，放入沸水中煮沸15min，烘干后用球型粉碎机打碎备用。
固态发酵培养基：步骤⑴处理过的羽毛浸泡于配制好的培养液中（羽毛为1g），培养液的组成(g/L)：K2HPO4 1,KH2PO4 0.4，NaCl 0.4，麦芽糖1，NH4Cl 1.5，浸泡后称取总重，将初始料液比（g/mL）调整为1:9（其中羽毛粉用量为1g/250mL三角瓶，培养液用量为9mL）。
因为粉碎后羽毛不同于其他碳氮源底物，其吸水性很强，经过优化后也说明初始料液比1:9为产总氨基酸和可溶性蛋白的最适料液比。初始料液比达到1:9之后，发酵培养基中只有少量游离水存在，从培养基外观及成分上看仍然是固体培养基。
⑵保藏/活化培养基（g/L）：蛋白胨10，酵母浸粉5，NaCl 10，琼脂20，pH7.5。
⑶地衣芽孢杆菌CGMCC NO.1699种子培养基（g/L）：胰蛋白胨10，酵母浸粉5，NaCl10。
嗜碱芽孢杆菌CGMCC No.5313种子培养基（g/L）酵母浸粉5，胰蛋白胨5，葡萄糖10，K2HPO4 18（单消），pH自然。采用250mL挡板摇瓶，装液量为50mL。
枯草芽孢杆菌CGMCC No.1398种子培养基（g/L）：酵母浸粉5，胰蛋白胨5，葡萄糖10，KH2PO4 0.5，Na2HPO4 4，pH7.0-7.2，采用500mL摇瓶，装液量50mL。
⑷菌株：本发明使用的菌种为地衣芽孢杆菌CGMCC No.1699，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。嗜碱芽孢杆菌Bacillus alcalophilus，保藏编号为：CGMCC No.5313，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。枯草芽孢杆菌CGMCC No.1398，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。三株菌均从中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心购买得到。
⑸种子的培养：分别从经过二次活化的三种菌株平板上挑取一环较大的单菌落接入各自种子培养液中，具体如下：
地衣芽孢杆菌CGMCC No.1699接入50mL种子培养基/250mL三角瓶，130r/min，50℃培养8h。
嗜碱芽孢杆菌CGMCC No.5313接入50mL种子培养基/250mL挡板三角瓶，170r/min，34℃培养9h。
枯草芽孢杆菌1398接入50mL种子培养基/500mL三角瓶，200r/min，32℃培养12h。
⑹发酵过程：
①取经种子培养后三种菌株的种子液按5mL、5mL、3mL（地衣芽孢杆菌CGMCC No.16995.03x109CFU/mL、嗜碱芽孢杆菌CGMCC No.53134.95×109CFU/mL、枯草芽孢杆菌CGMCCNo.13982.6×109CFU/mL），接入于经过处理的固态羽毛培养基中。保持初始发酵总料液比（g/mL）为1:22
②将接种后的发酵体系放入恒温加湿培养箱中进行发酵培养，保持湿度87%，通风量：1∶0.5～1∶1.5。pH自然，温度维持在37℃，发酵时间为60h。
③将所获得的产物用1mol/L HCl调节pH至7.0-7.2，烘干灭菌，打碎，得到产品羽毛粉添加剂。
⑺发酵产品氨基酸含量测定方法
①氨基酸吸光度-质量浓度标准曲线的绘制
称取0.1g氨基酸溶解后定容100mL，取出4.00mL定容至100mL得到40μg/mL氨基酸标准液，待用；称取茚三酮0.5g，果糖0.3g，Na2HPO4.12H2O 12.4g，KH2PO4 6.0g，定容100mL制成茚三酮显色液。
分别取氨基酸标准液0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00各加入茚三酮显色剂1mL，40%乙醇定容至10mL，混匀100℃水浴15min，放置冷却后于570nm波长处测定吸光度，绘制标准曲线。所得标准曲线方程：
y=0.0502x-0.042 其中R2=0.9902
②氨基酸含量测定：
将发酵处理后的产品（由1g打碎羽毛发酵而成）溶解于100mL0.9%NaCl中，搅拌放置30min，使可溶物充分溶解，取其溶液3ml，加入2mL10%三氯乙酸析出可溶性蛋白，然后经12000r/min离心去上清液待用。
取上清液1mL，加1mL方法①所配制的茚三酮溶液，用40%乙醇定容至10mL，混匀100℃水浴15min，放置冷却后于570nm波长处测定吸光度。
对照：不加菌株进行发酵后碎羽毛产物经方法②处理后的溶液。
⑻发酵产品可溶性蛋白含量测定方法：
①完全溶解蛋白标准品，取10μl稀释至100μl，使终浓度为0.5mg/ml。蛋白样品在什么溶液中，标准品也宜用什么溶液稀释。但是为了简便起见，也可以用0.9%NaCl或PBS稀释标准品。
②将标准品按0,1,2,4,8,12,16,20μl加到96孔板的标准品孔中，加标准品稀释液补足到20μl。
③加适当体积样品到96孔板的样品孔中，加标准品稀释液到20μl。
④各孔加入200μl G250染色液，室温放置3-5分钟。
⑤用酶标仪测定A595，或560-610nm之间的其它波长的吸光度。
⑥根据标准曲线计算出样品中的蛋白浓度。
本发明采用的具体方法如下：
①完全溶解蛋白标准品，取10μL稀释至100μL，使终浓度为0.5mg/ml。蛋白样品在什么溶液中，标准品也宜用什么溶液稀释。用0.9%NaCl稀释标准品。
②将标准品按0,1,2,4,8,12,16,20μl加到96孔板的标准品孔中，加标准品稀释液补足到20μl。
③加适当体积样品到96孔板的样品孔中，加标准品稀释液到20μL。
④各孔加入200μl G250染色液，室温放置3-5分钟。
⑤用酶标仪测定A595nm下波长的吸光度。绘制标准曲线。所得标准曲线方程：
y=1.0369x+0.0152 其中R2=0.9981
⑥将发酵处理后的产品（由1g打碎羽毛发酵而成）溶解于100mL0.9%NaCl中，搅拌放置30min，使可溶物充分溶解。取20μL样品于96孔板的样品孔中，加入200μl G250染色液，室温放置3-5分钟，用酶标仪测定A595nm下波长的吸光度。根据标准曲线计算出样品中的蛋白浓度。
结果：本发明制备的羽毛粉所含氨基酸量达到170.98mg/g，可溶性蛋白含量可达到9.42mg/g。
Claims (5)
1.一种混菌固态发酵制备羽毛粉添加剂的方法，其特征在于：包括将羽毛破碎的步骤、制备发酵培养基的步骤、加入混菌发酵的步骤、发酵后处理步骤，最终获得羽毛粉添加剂；所述混菌包括地衣芽孢杆菌CGMCC No.1699、嗜碱芽孢杆菌CGMCC No.5313、枯草芽孢杆菌CGMCC No.1398。
2.根据权利要求1所述的混菌固态发酵制备羽毛粉添加剂的方法，其特征在于：所述地衣芽孢杆菌终浓度CGMCC No.16992.51×1010CFU/g、嗜碱芽孢杆菌CGMCC No.53132.48×1010CFU/g、枯草芽孢杆菌CGMCC No.13981.30×1010CFU/g，其中g为羽毛重量。
3.根据权利要求1所述的混菌固态发酵制备羽毛粉添加剂的方法，其特征在于：所述发酵培养基为g/L：羽毛1-10、K2HPO4 1-5、KH2PO4 0.4-5、NaCl 0.4-5、麦芽糖1-5、NH4Cl1.5-5。
4.根据权利要求1所述的混菌固态发酵制备羽毛粉添加剂的方法，其特征在于：所述加入混菌发酵的条件为：相对湿度80-90%、温度维持在30-40℃，初始pH值自然，发酵时间为40-80h。
5.根据权利要求1所述的混菌固态发酵制备羽毛粉添加剂的方法，其特征在于：所述发酵后处理步骤为调节发酵产物pH至7.0-7.2，烘干灭菌，打碎，得到羽毛粉添加剂。
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