CN102693541A - 应用图像识别对Elispot斑点分析的精确定位方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种应用图像识别对Elispot斑点分析的精确定位方法，主要包括如下步骤：首先对原始微孔板单孔彩色图像进行灰度值转化、再对灰度图进行边缘检测、然后对边缘检测图进行孔底圆查找、最后对原来的整幅图进行孔底裁剪。本发明的方法结合Elispot斑点分析仪的图像特点，基于边缘检测后图像进行微孔板孔底圆周搜索，解决了微孔板孔底图像的精确裁剪问题。降低了对机电定位和微孔板制造精度的要求。本发明的方法可以用在Elispot斑点阅读仪图像分析中，也可用在类似基于微孔板图像分析的目标区域定位。
Description
技术领域
本发明涉及体外诊断仪器领域，特别涉及一种斑点阅读仪中微孔板孔底图像精确定位方法。
背景技术
ELISPOT技术即酶联免疫斑点检测技术，它是一种免疫学检测技术。该技术结合了细胞培养技术与酶联免疫吸附技术（即ELISA技术）的长处，具备一系列的优点：灵敏度极高，能够在单细胞水平检测细胞因子的分泌情况，能检测活生生的免疫细胞的功能与状态，而且操作简单经济，可进行高通量筛选等。它是当今唯一能够检测到百万分之一阳性细胞率的检测技术，灵敏度比普通ELISA技术、流式细胞技术（细胞内细胞因子染色）和Tetramer技术至少高了1-2个数量级。这些独特优点使其成为抗原特异性T-细胞免疫学研究的主流技术。
ELISPOT检测的最终数据是细胞频率，即在细胞群体中，受某种特异性抗原刺激而分泌某种细胞因子的阳性细胞比例。细胞总数在试验开始已经计数，需要统计的是阳性细胞（也称斑点形成细胞数目）。根据以前的技术研究，每一个ELISPOT斑点对应唯一一个阳性细胞，所以ELSPOT数据处理最重要的工作就是进行斑点计数。
事实上到目前为止，以目视法判读少量细胞族群的特性如激活T细胞之激素分泌，仍被视为是免疫学技术上的一大挑战。ELISPOT结果的判读常需要专聘的、有经验的技术员才可以；有时就算有专职技师判读，使用传统的显微镜计算斑点数仍不免会偶有主观意见，而有所偏颇。科学实证的本质，在于如何使实验结果能尽可能客观、精确、同时有高重现性，传统的人工计算法显然无法达到此要求。
ELISPOT斑点阅读仪在分析ELISPOT实验数据的过程中，先拍摄微孔板中孔底载体上（如膜）呈色影像，而后储存成各种数据格式的图像文件，包括未处理与处理过的膜表面影像；这些影像可以进一步使用手动、或是自动方式计算斑点数目，如果采取自动分析功能，则利用仪器的内嵌分析软件，可以先设定条件，然后同时分析斑点的大小，以推估激素分泌的多寡。ELISPOT斑点分析仪能自动进行图像扫描并分析，将可克服传统显微镜判读方法耗费人力、及人为客观性等缺点，彻底解除ELISPOT分析技术的瓶颈问题，进一步推广该技术的新颖应用。
但是，对微孔板的每个孔来说，所拍摄的图像不仅包含了分析所需要的孔底信息，还包括了孔底之外的图像。因此首先要做的是找到孔底圆，把圆之外的图像部分减去，然后在裁剪之后的图像上继续进行图像分析。常见的思路是通过机电结构，例如步进电机、丝杆或者同步带，精确控制每个孔运动到固定位置，这样拍摄的时候就可以认为每个孔的位置是固定的，同是也认为孔底圆的大小是不变的，从而以固定位置的、固定大小的圆去裁剪所拍摄的图片。但实际上，由于机电结构的精度、制造误差以及微孔板本身的制造误差、板条装配较松等原因，以图像中固定位置圆裁剪所拍摄图片，所得结果和真实孔底位置有较大的偏差，偏差方向没有规律。另外一个问题是，由于制造公差等原因，每孔的孔底圆的大小实际上不一样的，所以成像后对应的圆的大小也是不一样的，用固定大小的圆裁剪，会导致：或者裁掉有用的孔底图像，或者包含了多余的孔外干扰图像。总之，用固定大小、固定位置的裁剪圆不能精确定位微孔板的孔底，导致裁剪到图像不仅丢失了所需要的真实孔底信息，还包含进了孔底之外的很多干扰信息，从而导致了后续图像分析失去真实性基础，分析结果没有意义。对于传统加工制造业中的图像分析来说，由于光照控制容易、背景及目标对比度可以非常强，工况也相对固定，所以实现起来容易。但Elispot的微孔板图像是生化反应后的图像，图像的深浅不定、均匀性的规律也很差，是一种类似自然场景的图像，要进行图像分析是相对复杂的一个问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种斑点阅读仪中微孔板孔底图像精确定位方法，能保证Elispot斑点阅读仪进行图像分析时能对微孔板孔底进行精确裁剪，克服了传统技术中的不足，从而实现本发明的目的。
本发明所解决的技术问题可以采用以下技术方案来实现：
应用图像识别对Elispot斑点分析的自动精确定位方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
1）拍摄原始微孔板的原始图像；
2）对原始图像进行灰度化处理，得到灰度图像；
3）对灰度图像进行二值化处理和边缘检测，获取边缘线条的二值图像；
4）对二值图像进行进行孔底圆查找，得到所有目标圆的半径及圆心；
5）按照得到的目标圆的半径及圆心对原始图像进行裁剪，即得到去掉无关信息的目标图像。
在本发明的一个实施例中，所述步骤2）中灰度化的方法为采用以下公式把原始图像转换为灰度图像：
Y=0.299*R+0.587*G+0.114*B；
其中，Y为转化后的灰度值，R、G、B分别为彩色图像中同一像素点的红色、绿色、蓝色分量。
在本发明的一个实施例中，所述步骤3）采用边缘检测算子对二值图像进行边缘检测。
进一步，所述边缘检测算子包括Sobel算子、Priwitt算子、Robberts算子、LoG算子、Canny算子和Zero crossings算子。
在本发明的一个实施例中，所述步骤4）的具体方法如下：
a.设定图像的大小为W*H，要查找的圆的半径Rs，圆心的像素坐标是[X，Y]；
其中，W、H、R的单位都是像素；Rs的范围是在区间[R1,R2]里，单位是像素，R1和R2预先设定，保证区间包含R；X是圆心的行坐标，Y是圆心的列坐标，像素坐标系的圆心在图像的左上角。
b.以图像的第一行第一列像素为圆心，然后计算步骤三的图像里的每个边缘点到圆心的距离，把像素距离值等于R1的边缘点个数统计下来，记作N（1，1，R1）；
c.以图像的第一行第二列的像素为圆心，然后计算步骤三的图像里的每个边缘点到圆心的距离，把像素距离值等于R1的边缘点个数统计下来，记作N（1，2，R1）；
d.同理，计算图像里每个位置的N，第r行、第c列的像素对应的值为N（r，c，R1）；
e.同理，对于半径R1+1，可以计算所有的N（r，c，R1+1）；
f.同理，对与区间[R1,R2]里的所有半径Ri，计算出所有的N（r，c，Ri）
g.在N（r，c，Ri）中寻找最大值，对应的半径和圆心就是要找的孔底圆的半径R和圆心[X,Y]。
进一步，如果所述最大值有若干个，那么把对应的半径和圆心取出来根据以下原则处理：
a）如果圆心比较接近，取平均值作为最终的半径和圆心；
b）如果圆心差值很大，排除明显不可能的圆心位置。
本发明的有益效果在于：结合Elispot斑点分析的图像特点，基于边缘检测后图像进行微孔板孔底圆周搜索，解决了微孔板孔底图像的精确裁剪问题。降低了对机电定位和微孔板制造精度的要求。本发明的方法可以用在Elispot斑点阅读仪图像分析中，也可用在类似基于微孔板图像分析的目标区域定位上。
附图说明
图1为本发明所述的自动精确定位方法的简要流程图。
图2为本发明所述的原始图像。
图3为本发明所述的灰度图像。
图4为本发明所述的二值图像。
图5为本发明所述的定位图像。
图6为本发明所述的目标图像。
具体实施方式
为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。
如图1所示，本发明所述的应用图像识别对Elispot斑点分析的自动精确定位方法，主要包括如下步骤：
1）获取原始微孔板的灰度图像
参见图2和图3，所拍摄的图像一般是彩色图像，在进行Elispot斑点分析的时候，并不需要这些颜色信息，主要是利用图像中包含的亮度信息，所以这一步就是把彩色图像转化为灰度图像；对于直接用黑白摄像机获取的灰度图像，则不需要进行这一步。可采用以下公式把彩色图像转换为灰度图像：
Y=0.299*R+0.587*G+0.114*B；
其中，Y为转化后的灰度值，R、G、B分别为彩色图像中同一像素点的红色、绿色、蓝色分量。
2）对灰度图像进行边缘检测
对灰度图像进行二值化处理和边缘检测，获取边缘线条的二值图像。经过这一步处理后，微孔板孔底的圆周包含在边缘图像里。当然边缘图像中还包括了很多无关的边缘点，后续处理步骤将进一步寻找其中的圆周。
边缘检测算子可以选择Sobel算子、Priwitt算子、Robberts算子、LoG算子、Canny算子、Zero crossings算子的一种。根据实际情况确定最佳效果的算子。参见图4，在本实施例中，选用的是LoG算子。
在对大量的微孔板微孔图像研究的基础上，发现几个特点：
a.图像中不仅有孔底的圆周，而且孔内壁反光形成很多模糊的同心圆；相比来说，孔底圆的对比度较大，边缘细节丰富。
b.很多小的斑点也有着类似圆的外观；这些斑点虽然也细节丰富，但是其边缘点的数目应该远小于孔底圆的边缘点数目，同时半径悬殊较大。
基于以上两个特点，采用边缘检测的方法做以处理，孔底圆可以形成较多的边缘点，并且对应的半径较大，这样就利于将其从众多的干扰圆中检测出来。
3）对二值图像进行孔底圆查找
1.设定图像的大小为W*H，要查找的圆的半径Rs，圆心的像素坐标是[X.Y]。其中：W、H、R的单位都是像素；Rs的范围是在区间[R1,R2]里（单位是像素），R1和R2可以预先设定，只要保证区间能包含R即可;X是圆心的行坐标，Y是圆心的列坐标，像素坐标系的圆心在图像的左上角。
2.以图像的第一行第一列像素为圆心，然后计算步骤三的图像里的每个边缘点到圆心的距离，把像素距离值（经过圆整）等于R1的边缘点个数统计下来，记作N（1，1，R1）；
3.以图像的第一行第二列的像素为圆心，然后计算步骤三的图像里的每个边缘点到圆心的距离，把像素距离值（经过圆整）等于R1的边缘点个数统计下来，记作N（1，2，R1）；
4.同理，可以计算图像里每个位置的N，第r行、第c列的像素对应的值为N（r，c，R1）；
5.同理，对于半径R1+1，可以计算所有的N（r，c，R1+1）；
6.同理，对与区间[R1,R2]里的所有半径Ri，计算出所有的N（r，c，Ri）
7.在N（r，c，Ri）中寻找最大值，对应的半径和圆心就是要找的孔底圆的半径R和圆心[X,Y]。
8.如果第7步同时有几个最大值，那么把对应的半径和圆心取出来根据以下原则处理：
a）如果圆心比较接近，取平均值作为最终的半径和圆心；
b）如果圆心差值很大，用先验条件（比如，圆心只可能在图像中心的某个小区域里）排除明显不可能的圆心位置；实际上这些先验条件在计算N（r，c，Ri）时就可以加进去，可以大大减少不必要的计算，其结果参见图5。
最后按照得到的圆半径及圆心对原始图像进行裁剪，即得到去掉板孔外无关信息的图像（图6），可用于后续分析。
本发明的方法结合Elispot斑点分析的图像特点，基于边缘检测后图像进行微孔板孔底圆周搜索，解决了微孔板孔底图像的精确裁剪问题。降低了对机电定位和微孔板制造精度的要求。本发明的方法可以用在Elispot斑点阅读仪图像分析中，也可用在类似基于微孔板图像分析的目标区域定位上。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (6)
1.应用图像识别对Elispot斑点分析的精确定位方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
1）拍摄原始微孔板的原始图像；
2）对原始图像进行灰度化处理，得到灰度图像；
3）对灰度图像进行二值化处理和边缘检测，获取边缘线条的二值图像；
4）对二值图像进行进行孔底圆查找，得到所有目标圆的半径及圆心；
5）按照得到的目标圆的半径及圆心对原始图像进行裁剪，即得到去掉无关信息的目标图像。
2.根据权利要求1所述的应用图像识别对Elispot斑点分析的精确定位方法，其特征在于，所述步骤2）中灰度化的方法为采用以下公式把原始图像转换为灰度图像：
Y=0.299*R+0.587*G+0.114*B；
其中，Y为转化后的灰度值，R、G、B分别为彩色图像中同一像素点的红色、绿色、蓝色分量。
3.根据权利要求1所述的应用图像识别对Elispot斑点分析的精确定位方法，其特征在于，所述步骤3）采用边缘检测算子对二值图像进行边缘检测。
4.根据权利要求3所述的应用图像识别对Elispot斑点分析的精确定位方法，其特征在于，所述边缘检测算子包括Sobel算子、Priwitt算子、Robberts算子、LoG算子、Canny算子和Zero crossings算子。
5.根据权利要求1所述的应用图像识别对Elispot斑点分析的精确定位方法，其特征在于，所述步骤4）的具体方法如下：
a.设定图像的大小为W*H，要查找的圆的半径Rs，圆心的像素坐标是[X，Y]；
其中，W、H、R的单位都是像素；Rs的范围是在区间[R1,R2]里，单位是像素，R1和R2预先设定，保证区间包含R；X是圆心的行坐标，Y是圆心的列坐标，像素坐标系的圆心在图像的左上角。
b.以图像的第一行第一列像素为圆心，然后计算步骤三的图像里的每个边缘点到圆心的距离，把像素距离值等于R1的边缘点个数统计下来，记作N（1，1，R1）；
c.以图像的第一行第二列的像素为圆心，然后计算步骤三的图像里的每个边缘点到圆心的距离，把像素距离值等于R1的边缘点个数统计下来，记作N（1，2，R1）；
d.同理，计算图像里每个位置的N，第r行、第c列的像素对应的值为N（r，c，R1）；
e.同理，对于半径R1+1，可以计算所有的N（r，c，R1+1）；
f.同理，对与区间[R1,R2]里的所有半径Ri，计算出所有的N（r，c，Ri）
g.在N（r，c，Ri）中寻找最大值，对应的半径和圆心就是要找的孔底圆的半径R和圆心[X,Y]。
6.根据权利要求5所述的应用图像识别对Elispot斑点分析的精确定位方法，其特征在于，如果所述最大值有若干个，那么把对应的半径和圆心取出来根据以下原则处理：
a）如果圆心比较接近，取平均值作为最终的半径和圆心；
b）如果圆心差值很大，排除明显不可能的圆心位置。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20120926 |