CN102690798A - 一种提取扩增用taq酶的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种提取扩增用TAQ酶的方法，该方法包括以下步骤：将TAQ酶菌体利用TEBG缓冲溶液进行悬浮，再进行压力破碎去除核酸，得到蛋白液，控制水浴温度为70℃，将蛋白液在缓冲溶液中反应1h，去除杂蛋白，最后将蛋白液通过层析即可以得到高纯活性蛋白TAQ酶。与现有技术相比，本发明生产工艺合理简单，因活性蛋白容易变性失活因而纯化都是要求在低温条件(4℃)下进行，避免了常规纯化中反复通过离子交换，亲和层析进行纯化，使得收率减少和少许杂蛋白很难完全去除的因素，最大限度保证了产品产量和纯度，后期的基因扩增效果良好。
Description
技术领域
本发明涉及一种活性蛋白酶的提取方法，尤其是涉及一种提取扩增用TAQ酶的方法。
背景技术
目前，因活性蛋白容易变性失活因而纯化都是要求在低温条件(4℃)下进行，常规纯化TAQ酶方法采用低温破解，反复通过离子交换，亲和层析进行纯化，有少许杂蛋白很难完全去除，纯化过程中每根层析柱都要有20％左右的损失，产品的纯度也只能达到85％以上，产量也会有所下降。因其纯度问题也就影响了后期产品用来做基因扩增的效果。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种合理简单、基因扩增效果良好的提取扩增用TAQ酶的方法。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
一种提取扩增用TAQ酶的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：将TAQ酶菌体利用TEBG缓冲溶液进行悬浮，再进行压力破碎去除核酸，得到蛋白液，控制水浴温度为70℃，将蛋白液在缓冲溶液中反应1h，去除杂蛋白，最后将蛋白液通过层析即可以得到高纯活性蛋白TAQ酶。
所述的TEBG缓冲溶液含有维持蛋白空间构象的稳定剂及防止蛋白不饱和键被氧化的保护剂。
所述的稳定剂为丙三醇，所述的保护剂为β-巯基乙醇(BSA)，稳定剂终浓度10％(V/V)，保护剂终浓度为0.1％(G/V)。
所述的压力破碎步骤的压力控制为8000psi。
所述的杂蛋白包括膜蛋白、脂蛋白或有色蛋白。
所述的高纯活性蛋白通过SDS蛋白胶电泳观察为单一条带。
与现有技术相比，本发明的高热法提取扩增用TAQ酶的生产工艺合理简单，因活性蛋白容易变性失活因而纯化都是要求在低温条件(4℃)下进行，避免了常规纯化中反复通过离子交换，亲和层析进行纯化，使得收率减少和少许杂蛋白很难完全去除的因素，最大限度保证了产品产量和纯度，后期的基因扩增效果良好。
附图说明
图1为实施例1中提取扩增用TAQ酶的生产工艺图；
图2为实施例1得到的高纯活性蛋白电泳纯度图；
图3为传统方法得到的高纯活性蛋白电泳纯度图。
图中1为TAQ酶菌体、2为TEBG缓冲液、3为破碎装置、4为水浴装置、5为层析柱、6为高纯活性蛋白。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1
TAQ酶提取
试验组：如图1所示，将发酵好的TAQ酶菌体1溶于TEBG缓冲液2中，然后利用压力破碎装置3，控制压力为8000psi进行压力破碎，从而去除核酸，控制水浴装置4的温度为70℃，利用该蛋白在TEBG缓冲液中的热稳定性，将去除核酸的蛋白液在缓冲溶液中反应1h，TEBG缓冲溶液含有终浓度10％(V/V)，维持蛋白空间构象的稳定剂丙三醇及终浓度为0.1％(G/V)，防止蛋白不饱和键被氧化的保护剂β-巯基乙醇(BSA)。杂蛋白变性后的蛋白液通过层析柱5层析去除膜蛋白、脂蛋白或有色蛋白等杂蛋白，最终得到高纯活性蛋白6。
对照组：将菌体溶于常规Tris缓冲液后，破碎去除核酸后，反复通过柱层析的到纯化的活性蛋白TAQ酶。
产品纯度试验
将纯化好的活性TAQ酶，通过标记法或扩增法测定其活性单位，分别将实验组和对照组各点5U，10U，15U，20U，30U通过SDS蛋白凝胶上点样，上交15mA电泳，下胶25mA电泳，然后通过考马斯亮兰染色，观察蛋白条带情况。试验组蛋白为单一条带，如图2所示，对照组有肉眼可见的杂蛋白，如图3所示。
实施例2
一种高热法提取扩增用TAQ酶的生产工艺，该生产工艺包括以下步骤：将发酵好的TAQ酶菌体用TEBG缓冲液悬浮，TEBG缓冲溶液含有终浓度10％(V/V)，维持蛋白空间构象的稳定剂丙三醇及终浓度为0.1％(G/V)，防止蛋白不饱和键被氧化的保护剂β-巯基乙醇(BSA)。然后控制压力装置的压力为8000psi进行压力破碎，去除核酸后的蛋白液，利用其该蛋白在该缓冲液中的热稳定性，控制反应温度为70℃高热作用1h，去除绝大部分杂蛋白，然后通过一根层析柱即可得到所需高纯活性蛋白。与现有技术相比，本发明的高热法提取扩增用TAQ酶的生产工艺理简单，传统工艺需要四到五根层析柱，而现在只需一根即可，缩短了生产周期，同时原来难以除去的结合蛋白也随着热变性而去除，大大提高了产品的纯度、生产批量和生产效率，为基因扩增试验提供了强有力的保障。
Claims (6)
1.一种提取扩增用TAQ酶的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：将TAQ酶菌体利用TEBG缓冲溶液进行悬浮，再进行压力破碎去除核酸，得到蛋白液，控制水浴温度为70℃，将蛋白液在缓冲溶液中反应1h，去除杂蛋白，最后将蛋白液通过层析即可以得到高纯活性蛋白TAQ酶。
2.根据权利要求1所述的一种提取扩增用TAQ酶的方法，其特征在于，所述的TEBG缓冲溶液含有维持蛋白空间构象的稳定剂及防止蛋白不饱和键被氧化的保护剂。
3.根据权利要求2所述的一种提取扩增用TAQ酶的方法，其特征在于，所述的稳定剂为丙三醇，所述的保护剂为β-巯基乙醇(BSA)，稳定剂终浓度10％(V/V)，保护剂终浓度为0.1％(G/V)。
4.根据权利要求1所述的一种提取扩增用TAQ酶的方法，其特征在于，所述的压力破碎步骤的压力控制为8000psi。
5.根据权利要求1所述的一种提取扩增用TAQ酶的方法，其特征在于，所述的杂蛋白包括膜蛋白、脂蛋白或有色蛋白。
6.根据权利要求1所述的一种提取扩增用TAQ酶的方法，其特征在于，所述的高纯活性蛋白通过SDS蛋白胶电泳观察为单一条带。
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| CN (1) | CN102690798A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111621484A (zh) * | 2020-06-17 | 2020-09-04 | 济南国益生物科技有限公司 | 一种改性热启动酶及其制备方法 |
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| US5108892A (en) * | 1989-08-03 | 1992-04-28 | Promega Corporation | Method of using a taq dna polymerase without 5'-3'-exonuclease activity |
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2011
- 2011-03-24 CN CN2011100726819A patent/CN102690798A/zh active Pending
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