CN102675506B

CN102675506B - 一种6-糠氨基腺嘌呤分子印迹聚合物及其应用

Info

Publication number: CN102675506B
Application number: CN2012101906565A
Authority: CN
Inventors: 张兰; 卢巧梅; 范良彪; 陈国南
Original assignee: Fuzhou University
Current assignee: Fuzhou University
Priority date: 2012-06-12
Filing date: 2012-06-12
Publication date: 2013-12-11
Anticipated expiration: 2032-06-12
Also published as: CN102675506A

Abstract

本发明属于分析化学领域，更具体涉及一种6-糠氨基腺嘌呤分子印迹聚合物及其在固相萃取柱填料或固相微萃取纤维涂层中的应用。本发明以6-糠氨基腺嘌呤（KT）为模板分子，甲基丙烯酸为功能单体，无水乙醇为致孔剂，三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯为交联剂，偶氮二异丁腈为引发剂，采用本体聚合法合成了一种新的分子印迹聚合物（MIP）。此KT-MIP制备简单、性质稳定、分子识别能力强、能反复使用。将制得的MIP作为SPME的涂层和SPE填料，均可选择性萃取和富集结构类似的2种目标物。结合液相色谱检测平台，可实现对细胞分裂素的有效分离和高灵敏检测，并用于植物样品、环境样品等基质分析。

Description

一种6-糠氨基腺嘌呤分子印迹聚合物及其应用

技术领域

本发明属于分析化学领域，更具体涉及一种6-糠氨基腺嘌呤分子印迹聚合物及其在固相萃取柱填料或固相微萃取纤维涂层中的应用。

背景技术

通常，一类试样在分析前都要经过繁琐的样品前处理，其目的是将待测组分从复杂的样品基质中分离。因此，选择一种简单、高效、具富集能力的预处理方法常成为关键因素。在各种前处理方法中，液液萃取（LLE）发展最早，但因消耗大量有机溶剂、易乳化、费时而逐渐被固相萃取（SPE）取代。实际上，SPE是一个柱色谱的分离过程，通过SPE柱中的吸附剂使液体样品中分析物与干扰物分离，故吸附剂材料是建立SPE法的首要考虑因素。常用的吸附剂有C₈、C₁₈、离子型交换树脂等，然而它们存在选择性差、成本较高等缺点。因此，寻求低成本、高选择性、萃取性能更佳的填料已成为SPE研究的一个方向。

固相微萃取（SPME）于1990年由Pawliszy等首次提出。基于微型化SPE原理，SPME集浓缩、解吸和进样于一体，具有操作简便、样品用量少、无需有机溶剂等优势。当前，SPME已实现与多种分析仪器联用，越来越多地应用于食品、药物、环境等领域中各种样品的分析。然而，在实际分析中，商用SPME萃取头（如聚丙烯酸酯、聚二甲基硅氧烷等）仍存在价格昂贵、选择性不强、使用寿命较短等不足。因此，如何提高SPME方法的选择性和萃取性能也是亟待解决的问题。

基于分子识别理论，分子印迹技术是通过制备对某一种或一类分子在空间结构和结合位点上完全匹配的分子印迹聚合物（MIP）来实现的。特异的分子识别能力是MIP的重要特性，同时，MIP具有特异性高、稳定性好、制备简单、能反复使用等优点。近年来，MIP在色谱分离、传感器制备、样品前处理等领域都有广泛应用。将SPE、SPME、MIP技术的优势有机结合，分别形成了分子印迹固相萃取法（MISPE）和分子印迹固相微萃取法（MISPME），也受到众多分析测试者的青眯。

细胞分裂素（CTKs）是一类促进细胞分裂的植物激素，能调控胚胎发育、分生组织生长、光信号转导等生理过程。在实际农业生产中，应用最广的是人工合成的6-糠氨基腺嘌呤（KT）和6-苄氨基腺嘌呤（BA），多用于诱导细胞分化、增加果实结实率、切花保鲜等。迄今为止，CTKs的前处理多用LLE（以正丁醇为萃取溶剂）和SPE法（以C₁₈柱最为常见）。预处理技术如MIP和SPME用于CTKs纯化处理的研究仍开展不多。鉴于CTKs结构中具有-NH等活性位点，能与常用酸性功能单体发生作用，为制备MIP提供了可能。

发明内容

本发明的目的在于提供一种6-糠氨基腺嘌呤分子印迹聚合物及其在固相萃取柱填料或固相微萃取纤维涂层中的应用。该制备方法简单，制备的分子印迹聚合物性质稳定、分子识别能力强。

本发明首先提供了一种6-糠氨基腺嘌呤分子印迹聚合物，其制备方法为：往致孔剂中加入模板分子和功能单体，充分混匀后再加入交联剂和引发剂，混溶后经超声脱气、通氮除氧，得到预聚合溶液；将预聚合溶液于60-70 ℃反应8 h以上，得到固态聚合物；上述固态聚合物以乙醇-乙酸溶液脱除模板分子，干燥得到6-糠氨基腺嘌呤分子印迹聚合物；所述致孔剂为无水乙醇，所述模板分子为6-糠氨基腺嘌呤，所述功能单体为甲基丙烯酸，所述交联剂为三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯，所述引发剂为偶氮二异丁腈。

其中模板分子、功能单体、交联剂、引发剂的摩尔比为2：20：2：5。

根据权利要求1所述的6-糠氨基腺嘌呤分子印迹聚合物，其特征在于：所述乙醇-乙酸溶液中乙醇：乙酸体积比为90：10。

将所述分子印迹聚合物用于SPE柱填料或SPME纤维涂层中。

本发明还提供了一种MISPE柱的制备方法，所述制备方法步骤包括：a. 预聚合溶液的配制：往致孔剂中加入模板分子和功能单体，混匀后再加入交联剂和引发剂，经超声脱气、通氮除氧后，得到预聚合溶液；所述致孔剂为无水乙醇，所述模板分子为6-糠氨基腺嘌呤，所述功能单体为甲基丙烯酸，所述交联剂为三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯，所述引发剂为偶氮二异丁腈；b. 聚合反应：将上述预聚合溶液于60-70 ℃反应8 h以上，得到固态聚合物；c. 洗脱模板分子：将固态聚合物研磨成粉末，以乙醇-乙酸溶液为提取溶液，采用索式提取，脱除模板分子，干燥得到6-糠氨基腺嘌呤分子印迹聚合物；d. MISPE柱制备：取全新的注射器针筒，将聚四氟乙烯筛板装填于针筒底部，将得到的6-糠氨基腺嘌呤分子印迹聚合物粉末均匀填入针筒中，再放置另一块聚四氟乙烯筛板并压实，制备MISPE柱。

本发明另外提供了一种MISPME涂层的制备方法，所述制备方法步骤包括： A. 石英纤维的预处理及硅烷化；B. 往致孔剂中加入模板分子和功能单体，混匀后再加入交联剂和引发剂，经超声脱气、氮吹除氧后，得预聚合溶液，所述致孔剂为无水乙醇，所述模板分子为6-糠氨基腺嘌呤，所述功能单体为甲基丙烯酸，所述交联剂为三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯，所述引发剂为偶氮二异丁腈；C. 将上述预聚合溶液中转入衍生化小瓶中，插入硅烷化后的石英纤维，于60-70 ℃反应8 h以上，再将聚合后的石英纤维拔出，老化；D. 配置新鲜预聚合溶液，重复步骤C在同一根石英纤维上多次涂渍制得涂层；E. 用乙醇-乙酸溶液洗脱除去石英纤维涂层上的模板分子。

所述的硅烷化采用硅烷化试剂进行活化处理；所述硅烷化试剂为γ-MAPs和丙酮按体积比1：9混合配制而成；活化处理时间为2 h。

老化的条件为60 ℃放置3 h。

本发明中，以6-糠氨基腺嘌呤为模板分子，甲基丙烯酸为功能单体，无水乙醇为致孔剂，三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯为交联剂，偶氮二异丁腈为引发剂，采用本体聚合法合成了一种6-糠氨基腺嘌呤分子印迹聚合物，简称为KT-MIP。该聚合物制备简单、性质稳定、分子识别能力强、能反复使用。

本发明的目的是将制得的KT-MIP作为SPE填料和SPME涂层，制备KT-MISPE柱和KT-MISPME涂层，均可选择性萃取和富集结构类似的2种目标物。结合液相色谱分析平台，可实现对细胞分裂素的有效分离和高灵敏检测，并用于植物样品、环境样品等基质分析。

本发明的显著优点是：

1. 首次合成了KT-MIP，能实现对细胞分裂素类物质的特征识别；

2. KT-MIP制备过程简单，能耐多种有机溶剂、耐热性能好、能反复使用萃取性能未降低，非常适合与各种色谱技术（气相色谱、液相色谱）在线联用；

3. KT-MISPE由于使用较多的聚合物，对目标物能有更大的萃取容量，并较好的避免了模板渗漏现象。同时，KT-MISPE采用普通的注射器针筒，小柱可反复使用，大大降低了实际成本；

4. 发展的KT-MISPME法，集富集、净化、进样于一体，有机溶剂用量少，是一种环境友好的样品前处理技术；采用多次涂渍法，能制备一定厚度的MISPME涂层，过程易控，且能更有效地实现目标物的萃取与富集；

5. KT-MISPE和KT-MISPME两种前处理方法与常规SPME或SPE方法比较，选择性大大提升的同时，富集率也得到提高；

6. 方法的灵敏度显著提高，以KT-MISPME法为例，经过富集后，方法的检测限比直接进样时降低了两个数量级；

7. 建立的KT-MISPE和KT-MISPME两种方法均能适用于多种样品基质预处理，应用范围广泛。

附图说明

图1是KT-MISPME涂层的表面形貌，放大倍数：(a): ×500; (b): ×1000; (c): ×2500。

图2是KT-MISPME和NISPME涂层对三种物质（0.1 mg/L）的选择性比较。

图3是萃取前后两种待测物的色谱对比图，其中，（A）直接进样10 mg/L KT和BA；（B）MISPME及NISPME涂层萃取0.1 mg/L KT和BA，均固定进样10 μL。

图4是空白和加标环境水样的萃取色谱图，加标浓度为0.05 mg/L。

图5是空白和加标萝卜基质的萃取色谱图，加标浓度为0.05 mg/L。

具体实施方式

按本发明的内容分别制备KT-MIP、KT-MISPE柱和KT-MISPME涂层，并进行萃取。

（1）KT-MIP制备：将模板分子6-糠氨基腺嘌呤、功能单体甲基丙烯酸、交联剂三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、引发剂偶氮二异丁腈按一定比例加入到适量致孔剂中，形成预聚合溶液，60-70 ℃反应8 h以上，随后洗脱除去模板分子，得到具有识别空穴的聚合物，干燥得KT-MIP粉末。

（2）KT-MIPSPE柱处理方法：采用全新的带有刻度线的5 mL注射器针筒，此刻度线可为装填过程提供参考。将制备好的KT-MIP粉末250 mg 移入注射器针筒中，两端分别用筛板堵住，制备KT-MISPE柱。2 mL甲醇作为活化溶剂，1 mL不同浓度标准混合液（KT、BA、IAA）溶解在乙腈中上样，淋洗剂为2 mL正己烷，洗脱溶液为2 mL甲醇-氨水（85:15 v/v）混合溶剂。非印迹固相萃取（NISPE）柱制备：除不加模板分子外，按上述方法制备NISPE柱。

（3）MISPME法萃取过程：取长约20 cm石英纤维，一端浸于丙酮中5 min，剥去外层的聚酰亚氨涂层，依次用二次水、1.0 mol/L NaOH、二次水、1 mol/L HCl 浸泡、洗净，晾干后将石英纤维放入10%（v/v）γ-MAPS丙酮溶液中硅烷化处理2 h，取出后用甲醇冲洗，氮气吹干。将预聚合溶液转移至2.0 mL衍生小瓶中，插入硅烷化的纤维，于60 ℃烘箱中反应8 h。按相同步骤和聚合方法，反复多次在同一根纤维上共聚涂渍，制得一定厚度的MISPME涂层。除不加模板分子KT外，同时制备NISPME涂层作为参照。涂层制备完成后，用无水乙醇-乙酸（90:10，v/v）洗脱去除模板分子，直至洗脱液中检测不到模板分子为止。将制备好的KT-MISPME纤维预先插入微萃取手柄中，制成固相微萃取纤维针，取20 mL正己烷溶液（含一定浓度的待测组分）于血清瓶中，以400 rpm转速、60 ℃萃取30 min，将萃取头与液相色谱HPLC联用，在SPME接口用15 μL无水乙醇-乙酸（90:10，v/v，%）解吸10 min，之后直接在线分析。

KT-MISPE的性能评价：用吸附量Q的值来评价KT-MIP对模板分子KT的吸附容量，Q=(C₀ – C₁) * V/m。其中，Q-吸附量（mg/g）；C₀-上样时标准品溶液的浓度（mg/mL）；C₁-上样后滤液中标准品的浓度（mg/mL）；V-上样溶液体积（mL）；m-聚合物质量（g）。

KT-MISPME的性能评价：吸附量Q =(C₀ – C₁) * V/m。其中，Q-吸附量（mg/g）；C₀-萃取前样品溶液浓度（mg/mL）；C₁-萃取后样品溶液浓度（mg/mL）；V-样品溶液体积（mL）；m-纤维上KT-MIP的质量（g）。用印迹因子α的值来评价KT-MIP对模板分子KT的选择性识别能力，α=Q_MIP /Q_NIP，其中，Q_MIP、Q_NIP分别为分子印迹材料、非分子印迹材料对目标物的吸附量。

所述MISPE装填有250 mg KT-MIP粉末，最大吸附量为0.174 mg/g，模板渗漏现象可避免；所述MISPME纤维表面涂层为KT-MIP，最大吸附量为168 ng，对模板分子的印迹因子为2.90。

将建立的两种方法与液相色谱联用，具体分离检测条件如下：色谱柱为ZORBAX SB-C₈（250 mm×4.6 mm I.D.，5 μm，Agilent），以甲醇-水（60：40，v/v，%）二元体系为流动相，流速为1.0 mL/min，固定紫外波长（λmax）为270 nm处检测。

本发明的具体实施例以MISPME法为例，MIPSPE结果此处不再详述。

选取最佳聚合条件（取17 mg模板分子KT、150 μL甲基丙烯酸，溶于3.6 mL无水乙醇中，室温反应12 h，使其充分混匀，再加入450 μL三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯和34 mg偶氮二异丁腈，超声混匀、通氮除氧后，于60 ℃反应8 h以上，聚合反应完成后即生成 KT-MIP。在同根纤维上重复涂渍5次）下制备的KT-MISPME纤维涂层，用环境扫描电镜分别放大500倍、1000倍及2500倍后观察。结果显示：以KT为模板分子，制备的涂层与纤维粘附情况良好，表面分布有较大不规则的颗粒（图1a和1b），这是由于多次涂渍引起涂层表面不均匀造成的。进一步放大（c）可看出，涂层具有疏松多孔和高度交联的结构，适合萃取具有特定结构的目标物。

选择模板分子KT、结构类似物BA和结构不同的对照物IAA作为分析对象，以正己烷为溶剂，萃取0.1 mg/L的KT、BA和IAA的混合液。研究了KT-MISPME涂层的萃取性能和选择性能（图2）。萃取性能以吸附量（Q）来评价，用印迹因子（α）的值来评价KT-MIP对模板分子KT的选择性识别能力。结果表明，KT-MISPME涂层对KT、BA和IAA的萃取量分别为700 pmol、730 pmol和131 pmol；NISPME涂层对应的萃取量仅为241 pmol、262 pmol、142 pmol。上述两种萃取量相除，得到KT-MISPME涂层对KT、BA和IAA的印迹因子分别为2.90、2.78、0.92，表明KT-MISPME涂层对模板分子KT及其类似物BA具有较高的选择性，而对结构具有明显差异的IAA，其萃取量较小。

最佳萃取条件如下，20 mL正己烷溶液（含一定浓度的待测组分）置于血清瓶中，以400 rpm转速、60 ℃萃取30 min，在SPME接口用15 μL无水乙醇-乙酸（90:10，v/v，%）解吸10 min。固定进样体积均为10 μL，将制得的KT-MISPME及NISPME涂层直接萃取0.1 mg/L KT和BA溶液，与直接进样10 mg/L待测物的色谱图进行比较。从图3B中可以看出，同一浓度下，经KT-MISPME涂层萃取的2种物质的峰高明显大于NISPME涂层的效果，进一步确证KT-MISPME涂层对2种目标物具有更好的萃取效果和选择性。尽管浓度相差100倍，待测物经KT-MISPME涂层萃取的响应值仍与直接进样相当（图3A），说明MISPME富集效果约提高2个数量级。

将建立的MISPME法用于多种样品基质的分析，样品的预处理按以下步骤进行：（1）环境样品：量取10 mL湖水过滤，45 ℃减压蒸馏近干，加入20 mL正己烷用于MIPSPME萃取。（2）植物样品：准确称取2 g白萝卜样品于多用组织搅碎机中搅碎5 min，加入12 mL 80%甲醇提取液4 ℃下浸提12 h，过滤后取滤液，残渣用6 mL上述提取液再次浸提1 h，合并两次滤液，45 ℃减压蒸馏除去大部分有机相，加入20 mL正己烷提取，用于后续分析。实验结果发现：在两种基质中都未测得KT和BA的残留。对比加标样和空白样的萃取色谱图可以看出，环境水样杂峰更少，背景更为简单（图4）；白萝卜样品基质尽管稍显复杂，但杂质峰总体不干扰测定（图5）。因此，所建立的MISPME法能有效消除基质干扰，用于测定实际样品中的细胞分裂素。

在此基础上，建立了KT-MISPME与HPLC联用测定加标实际样品中的细胞分裂素的体系。分析物平均回收率在88.6-109.3%之间，RSD小于13.4%，最低检测限为0.3 μg/L，与直接进样相比，检测限降低了两个数量级。可以说，发展的MISPME法在选择性和灵敏度方面都有了很大提高，是一种操作简单、稳定性好、重现性高、发展前景良好的预处理技术。

以下为本发明的最佳实施例子，进一步描述本发明，但是本发明不仅限于此。

实施例1

MIP制备：A. 取17 mg模板分子KT、150 μL甲基丙烯酸（功能单体），溶于3.6 mL无水乙醇（致孔剂）中，充分摇匀，室温下放置12 h，再加入450 μL三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯（交联剂）和34 mg偶氮二异丁腈（引发剂），得到预聚合溶液，超声5 min后，向聚合溶液中通入氮气10 min。B. 往2.0 mL衍生化小瓶中加入上述预聚合溶液，置于60 ℃烘箱中反应8 h以上，聚合反应完成后即生成 KT-MIP。

实施例2

MISPE柱制备：按实施例1制备KT-MIP，为除去模板分子KT，将固态MIP研磨成粉末，用滤纸包好，放于索氏提取器中，加入150 mL无水乙醇-乙酸（90:10，v/v）洗脱液，在85 ℃下回流来洗脱模板分子，直至HPLC不再检出KT为止。选取数根5 mL注射器针筒，将聚四氟乙烯筛板装填于注射器针筒底部，分别称取250 mg处理过的KT-MIP和NIP粉末于上述针筒中，将填料敲打均匀，再往聚合物上方塞上另一块聚四氟乙烯筛板并压实。最后制得MISPE柱和NISPE柱。

实施例3

MISPME纤维涂层制备：取长约20 cm石英纤维，一端浸于丙酮中5 min，剥去外层的聚酰亚氨涂层，依次用二次水、1.0 mol/L NaOH、二次水、1 mol/L HCl 浸泡、洗净，晾干后将石英纤维放入10%（v/v）γ-MAPS丙酮溶液中硅烷化处理2 h，取出后用甲醇冲洗，氮气吹干。按实施例1步骤A)制备预聚合溶液并转移至2.0 mL衍生小瓶中，插入硅烷化的纤维，于60 ℃烘箱中反应8 h。按相同步骤和聚合方法，反复多次在同一根纤维上共聚涂渍，制得一定厚度的MISPME涂层。涂层制备完成后，用无水乙醇-乙酸（90:10，v/v）洗脱去除模板分子，直至洗脱液中检测不到模板分子为止。

Claims

1.一种6-糠氨基腺嘌呤分子印迹聚合物，其特征在于：往致孔剂中加入模板分子和功能单体，充分混匀后再加入交联剂和引发剂，混溶后经超声脱气、通氮除氧，得到预聚合溶液；将预聚合溶液于60-70 ℃反应8 h以上，得到固态聚合物；上述固态聚合物以乙醇-乙酸溶液脱除模板分子，干燥得到6-糠氨基腺嘌呤分子印迹聚合物；所述致孔剂为无水乙醇，所述模板分子为6-糠氨基腺嘌呤，所述功能单体为甲基丙烯酸，所述交联剂为三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯，所述引发剂为偶氮二异丁腈。

2.根据权利要求1所述的6-糠氨基腺嘌呤分子印迹聚合物，其特征在于：模板分子、功能单体、交联剂、引发剂的摩尔比为2：20：2：5。

3.根据权利要求1所述的6-糠氨基腺嘌呤分子印迹聚合物，其特征在于：所述乙醇-乙酸溶液中乙醇：乙酸体积比为90：10。

4.根据权利要求1所述的6-糠氨基腺嘌呤分子印迹聚合物，其特征在于：将所述分子印迹聚合物用于SPE柱填料或SPME纤维涂层中。

5.一种MISPE柱的制备方法，其特征在于：所述制备方法步骤包括：a. 预聚合溶液的配制：往致孔剂中加入模板分子和功能单体，混匀后再加入交联剂和引发剂，经超声脱气、通氮除氧后，得到预聚合溶液；所述致孔剂为无水乙醇，所述模板分子为6-糠氨基腺嘌呤，所述功能单体为甲基丙烯酸，所述交联剂为三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯，所述引发剂为偶氮二异丁腈；b. 聚合反应：将上述预聚合溶液于60-70 ℃反应8 h以上，得到固态聚合物；c. 洗脱模板分子：将固态聚合物研磨成粉末，以乙醇-乙酸溶液为提取溶液，采用索式提取，脱除模板分子，干燥得到6-糠氨基腺嘌呤分子印迹聚合物；d. MISPE柱制备：取全新的注射器针筒，将聚四氟乙烯筛板装填于针筒底部，将得到的6-糠氨基腺嘌呤分子印迹聚合物粉末均匀填入针筒中，再放置另一块聚四氟乙烯筛板并压实，制备MISPE柱。

6.一种MISPME涂层的制备方法，其特征在于：所述制备方法步骤包括： A. 石英纤维的预处理及硅烷化；B. 往致孔剂中加入模板分子和功能单体，混匀后再加入交联剂和引发剂，经超声脱气、氮吹除氧后，得预聚合溶液，所述致孔剂为无水乙醇，所述模板分子为6-糠氨基腺嘌呤，所述功能单体为甲基丙烯酸，所述交联剂为三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯，所述引发剂为偶氮二异丁腈；C. 将上述预聚合溶液中转入衍生化小瓶中，插入硅烷化后的石英纤维，于60-70 ℃反应8 h以上，再将聚合后的石英纤维拔出，老化；D. 配置新鲜预聚合溶液，重复步骤C在同一根石英纤维上多次涂渍制得涂层；E. 用乙醇-乙酸溶液洗脱除去石英纤维涂层上的模板分子。

7.根据权利要求6所述的分子印迹固相微萃取涂层的制备方法，其特征在于：所述的硅烷化采用硅烷化试剂进行活化处理；所述硅烷化试剂为γ-MAPs和丙酮按体积比1：9混合配制而成；活化处理时间为2 h。

8.根据权利要求6所述的分子印迹固相微萃取涂层的制备方法，其特征在于：老化的条件为60 ℃放置3 h。