CN102667469A - 在食物中发现的酚类化合物的协同相互作用 - Google Patents

在食物中发现的酚类化合物的协同相互作用 Download PDF

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Abstract

多种抗氧化化合物的协同营养添加物，其比率源自自然产生的食物中的比率。

Description

在食物中发现的酚类化合物的协同相互作用
相关申请的交叉引用
要求2009年10月20日提交的美国临时专利申请61/279,368；2010年3月2日提交的美国临时专利申请61/339,244；和2010年7月14日提交的美国临时专利申请61/399,548的权益，在此通过引用将它们并入。
背景技术
植物产生酚类化合物，以起到细胞信号传导分子、抗氧化剂、或侵袭害虫的毒素(Crozier和其他人，2006)的作用。研究已经探讨了水果成分(Robards和其他人，1999；Franke和其他人，2004；Harnly其他人，2006)，主要的重点放在酚类化合物上，这是因为它们的高抗氧化能力。
在水果中发现的浓度下的单个酚类化合物的抗氧化能力和全果的抗氧化能力之间有差异(Miller和Rice-Evans，1997；Zheng和Wang，2003)；全果的抗氧化能力更高。针对该差异的可能的解释可包括水果中未被识别的化合物、以低浓度存在于水果中的很多化合物的总和或酚类化合物之间的协同相互作用。
Lila和Raskin(2005)讨论了植物内可改变其药理学作用的内相互作用(endointeraction)或相互作用、以及外相互作用(exointeraction)方面的相加或协同增强，所述相互作用为不相关的植物成分和/或药物之间的相互作用。通过外相互作用的抗氧化协同作用已经受到了一些关注。Yang和Liu(2009)报告了苹果提取物和槲皮素3-β-D-葡萄糖苷的组合显示了对人乳腺癌细胞的协同抗增殖活性。大豆和苜蓿植物雌激素提取物和针叶樱桃(acerola cherry)提取物的组合协同地起作用，抑制LDL体外氧化(Hwang和其他人，2001)。Liao和Yin(2000)说明了在Fe2+-诱导的脂质氧化系统中与单独的任一化合物相比，α-生育酚和/或抗坏血酸与咖啡酸、儿茶素、表儿茶素、杨梅黄酮、五倍子酸、槲皮素和芸香苷的组合具有更大的抗氧化活性。
目前的兴趣在于开发或发现有效的天然防腐剂(Galal，2006)。方法包括使用提取物(Serra和其他人，2008；Conte和其他人，2009)、酚类化合物(Rodr′iguez Vaquero和Nadra，2008)或作为抗菌剂的化合物的混合物(Oliveira和其他人，2010)。理解潜在抗氧化混合物功能之后的机制对于它们作为防腐剂的潜在开发是重要的。
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发明内容
酚类化合物已知具有抗氧化和抗菌性质。这些性质可用于食物或饮料的保存。食物内酚类化合物的交互抗氧化能力还没有被很好地探究。理解水果抗氧化剂的组合如何一起作用将有助于它们未来在食物和/或饮料保存中的使用。
一个方面为发现抗氧化酚类化合物的协同组合存在于食物中。协同的内相互作用发生在抗氧化剂本身之间的发现是重要的。另一个方面为用于确定抗氧化剂的协同组合的系统，以及发现协同作用部分取决于这些抗氧化化合物存在于混合物中的比率。
另一个方面为使用食物例如水果作为模型，用于确定可能的协同抗氧化组合和比率。与其进行尝试所有存在于食物中的抗氧化剂可能的比率和组合的不切实际地漫长和昂贵的过程，不如组合并以它们存在于食物中的比率试验抗氧化剂。以此方式，将试验更可能具有协同抗氧化能力的组合。
一个方面为制造具有协同抗氧化能力的营养添加物的方法。在食物中，至少两种抗氧化化合物在食物中被识别，并且它们各自的抗氧化能力被确定。另外，食物中它们相互的比率即食物比率被确定。通过确定混合物的抗氧化能力是否大于相加或预期的能力——其为单独来看混合物中化合物抗氧化能力之和，可确定是否在化合物之间在抗氧化能力上存在协同作用。
抗氧化化合物为具有抗氧化能力的化合物。任何合适的系统可被用于测量抗氧化能力。在实施例中，单一化合物和混合物的抗氧化能力通过氧自由基吸收能力(ORAC)分析被确定。当目标之一是表明结果潜在应用于人营养或食物保存时，由于其在学术研究之外常用和熟悉，在抗氧化分析的很多选择中选择氧自由基吸收能力(ORAC)分析。然而，考虑确定抗氧化能力的任何合适的方法。合适的方法包括但不限于；
ORAC-氧自由基吸收能力分析，
NORAC-过亚硝酸盐ORAC分析，
HORAC-羟基ORAC分析，
ORAC-PG-氧自由基吸收能力连苯三酚红分析，
DPPH-2,2-二苯基-1-苦基肼基自由基分析，
FRAP-血浆的三价铁还原能力分析，
TEAC-Trolox等同物抗氧化能力分析，
VCEAC-维生素C等同物抗氧化能力分析，
ABTS-2′-连氮基双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)分析,
CUPRAC-二价铜还原抗氧化能力分析，
TRAP-总自由基捕获抗氧化参数分析，以及
CAA-细胞抗氧化活性分析。
抗氧化混合物中的协同作用通过首先形成以食物比率包括至少两种抗氧化化合物的混合物并确定混合物的抗氧化能力进行确定，该食物比率为食物中化合物彼此的比率。
协同作用通过将混合物的抗氧化能力与预期的或相加的抗氧化能力值比较确定。该相加值为，单独来看或假定每个都独立地起作用，混合物的单个抗氧化化合物中每一个的组合抗氧化能力。该比较可通过从所有抗氧化化合物的混合物所得的抗氧化能力中减去各个化合物抗氧化能力之和进行计算。正结果表明协同作用。负或统计学上小正值或无值表明化合物之间的对抗作用或无相互作用。在进行抗氧化能力的测量中，几个样品的平均将给出统计学上更好的值。
另一个方面为通过形成具有协同抗氧化能力的化合物的混合物制成的营养添加物，其为某些抗氧化化合物的混合物，相互之间的比率已经确定以具有协同抗氧化性质。
已经发现，通过以在具体食物例如水果中发现的浓度比率下的各个酚类抗氧化剂开始，可仅用内相互作用表明所述协同作用。这有助于解释整个食物和单个成分之间的抗氧化能力差异，并且也形成优化的水果源抗氧化防腐剂的开发依据。
食物包括任何种植用于人消费的植物来源的食物，包括已经受到后加工的食物，后加工例如干燥、冷冻、加热(包括巴氏消毒)、与其他成分混合，或任何在被制成可用于人消费前应用于食物的加工。任何包含酚类抗氧化化合物的食物被考虑作为食物，并且可被分析以确定抗氧化化合物的协同组合。例子包括水果(例如以下举例说明的橙子、草莓和蓝莓)、蔬菜、坚果、鸡蛋、植物油、谷物(包括黑米)、大豆、巧克力、肉桂、牛至、发酵酒(红葡萄酒)、茶和咖啡。某些肉包括抗氧化剂，例如家禽和鱼，并且可被考虑为用于确定协同抗氧化剂比率的食物。
附图说明
图1：组合减去组合中各个化合物(等式1至等式3)的氧自由基吸收能力(ORAC)差异。所示出的所有组合都是统计学上显著的(p<0.05，利用Fisher’s最小显著性差异)；统计学上不显著的组合没有示出。C=绿原酸；H=橙皮苷；L=藤黄菌素；M=杨梅黄酮；N=柚配基；P=对香豆酸；Q=槲皮素。HC表示H和C的混合物的ORAC减去H的ORAC和C的ORAC，对于其他组合也同样。每个值都是4次重复的平均值。
图2：在橙子中发现的浓度下的3种酚类化合物组合的氧自由基吸收能力(ORAC)减去2+1 ORAC数据之和(等式4)。以此方式分析数据解释了组合模式(pattern)并使其有可能确定哪种化合物相互作用对ORAC最有影响(见进一步讨论的正文)。所示出的所有组合都是统计学上显著的(p<0.05，利用ANOVA估算)；统计学上不显著的组合未示出。C=绿原酸；H=橙皮苷；L=藤黄菌素；M=杨梅黄酮；N=柚配基；P=对香豆酸；Q=槲皮素。HC+N表示H、C和N的混合物的ORAC减去HC的混合物的ORAC和N的ORAC，对于其他组合也同样。每个值都是4次重复的平均值。
图3：在橙子中发现的浓度下的4种酚类化合物的组合的氧自由基吸收能力(ORAC)减去3+1 ORAC数据之和(等式5)。以此方式分析数据解释了组合模式并使其有可能确定哪种化合物相互作用对ORAC最有影响(见进一步讨论的正文)。所示出的所有组合都是统计学上显著的(p<0.05，利用ANOVA估算)；统计学上不显著的组合未示出。C=绿原酸；H=橙皮苷；L=藤黄菌素；M=杨梅黄酮；N=柚配基；P=对香豆酸；Q=槲皮素。HC+N表示H、C和N的混合物的ORAC减去HC的混合物的ORAC和N的ORAC，对于其他组合也同样。每个值都是4次重复的平均值。
图4：酚类化合物的结构和它们的单电子还原电势。
图5：草莓中抗氧化化合物的结构。
图6：蓝莓中各个化合物的ORAC。
图7：1:1比率的混合物和水果比率混合物与预期结果相比较的ORAC。
发明详述
实施例1
脐橙中发现的酚类化合物的协同和对抗相互作用
针对它们的抗氧化能力分析了脐橙(甜橙)中发现的浓度下的各个酚类化合物(绿原酸、橙皮苷、藤黄菌素、杨梅黄酮、柚配基、对香豆酸和槲皮素)的相互作用，以观察潜在的对抗、相加、或协同相互作用。制备2、3和4种酚类化合物的混合物。氧自由基吸收能力(ORAC)分析用于定量这些组合的抗氧化能力。发现2种化合物的三种不同的组合和3种化合物的5种组合是协同的。也发现2种化合物的一种对抗组合。添加第四种化合物，无另外的协同作用发生。开发了一种模型以解释该结果。还原电势、相对浓度和儿茶酚(邻二羟基苯)基团的存在与缺少是模型中的因子。
材料和方法
化学品
通过Fisher Scientific Inc.(Waltham,Mass.,U.S.A.)购买Trolox((±)-6-羟基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸)(97％纯度，AcrosOrganics)、柚配基(95％,MP Biomedicals Inc.)、槲皮素水合物(95％,Acros Organics)、氢氧化钠(50％溶液)、K2HPO4和KH2PO4(MallinckrodtInc.)。从Sigma-Aldrich(St.Louis,Mo.,U.S.A.)购买绿原酸(95％)、橙皮苷(>80％)、藤黄菌素(99％)、杨梅黄酮(95％)、对香豆酸(98％)和荧光素(Na盐)。从Wako chemicals U.S.A.Inc.(Richmond,Va.,U.S.A.)购买AAPH(2,2’-偶氮二(2-甲基丙基咪)二盐酸)。
化学物质制备
选择橙子中发现的七种最浓的酚类：绿原酸、橙皮苷、藤黄菌素、杨梅黄酮、柚配基、对香豆酸和槲皮素(Proteggente和其他人，2003；Franke和其他人，2004；USDA类黄酮数据库，2007)。除橙皮苷外，每种都在引用的参考文献中作为糖苷配基(aglycone)定量。所有化合物以公布的浓度制备(表1)。
表1
选择的脐橙中发现的酚类化合物和量。
  化合物   Mg/100g新鲜水果
  绿原酸   0.19
  橙皮苷   31
  藤黄菌素   0.7
  杨梅黄酮   0.01
  柚配基   7.1
  对香豆酸   0.02
  槲皮素   0.2
由于橙子的高水含量，不进行密度调整。假定100g在体积上为100mL，制备化合物。除橙皮苷和藤黄菌素以外，所有化合物被称重(表1浓度的10×至1000×，以便于称重)并溶解于甲醇。在室温(RT)下，在甲醇和1N NaOH的8:2(v:v)混合物中制备藤黄菌素和橙皮苷，因为这两种化合物仅在可称重的浓度下，在碱性溶液中完全可溶。在-20℃下以1mL等份保存酚类储液。酚类被拿到RT，涡动搅拌，并稀释于7:3(v:v)丙酮:水中，以匹配表1中的水果浓度。为了适合Trolox标准曲线(见以下的分析描述)，在转移至96孔平板前，化合物被进一步稀释于7:3(v:v)丙酮:水中至以下摩尔浓度：绿原酸，10.7μΜ；橙皮苷，10.2μΜ；藤黄菌素，2.45μΜ；杨梅黄酮，0.786μΜ；柚配基，2.61μΜ；香豆酸，1.95μΜ；和槲皮素，6.62μΜ。在解冻和稀释后检测溶解度。在黑暗条件下进行涉及酚类化合物、荧光素和Trolox的所有工作，以最小化降解。
混合物
2种化合物所有可能的组合在以表1中提供的浓度下制备后，基于相等的体积进行混合，以确保维持相对浓度。混合物随后被进一步稀释，以匹配最低单个化合物摩尔浓度，以便适合Trolox标准曲线。在确定ORAC并完成统计学分析后，2种化合物的头3种统计学上的协同组合与所有可能的第3种化合物相结合并同样进行分析。相同的模式对于4种化合物的组合重复：3种化合物的头3种协同组合与所有可能的第四种化合物相结合。在它们的ORAC分析的同一天制备2、3和4种化合物的组合。
氧自由基吸收能力(ORAC)
根据Davalos和其他人(2004)，做一些修改，进行ORAC分析。简言之，荧光素被稀释在磷酸盐缓冲液中至70.3mM并在-20℃下以25ml等份保存至多一个月。Trolox在丙酮和水的7:3混合物中被稀释至80μΜ，并且在-20℃下以100μL的等份保存至多一个月。在每次ORAC分析前5分钟，AAPH在磷酸盐缓冲液中被稀释至12mM。荧光素和AAPH被加热至37℃并经由(Precision Micropipettor)精密微量移液器(BioTek Instruments Inc.,Winooski,Vt.,U.S.A.)转移至96孔平板的所有孔。所有的Trolox浓度(10μΜ、20μΜ、40μΜ、60μΜ、80μΜ)一式两份被转移至同一排的孔中，以形成标准曲线。根据预先设计平板布局，酚类溶液一式两份被转移至孔中。在添加AAPH和随后的荧光测量前，所有被填充的平板在平板读数器内(设定在37℃)被加热15min。每一镜像一式两份被平均并被看做1个重复样品。所有样品一式四份进行测量(总共8孔)，以获得必要的统计学效力。
所有孔的荧光在BioTekSynergy 2荧光平板读数器(BioTekInstruments Inc.)中，在每分钟485/20nm激发和528/20nm发射下测量120min。ORAC值表示为每升包含脐橙中发现的酚类浓度的溶剂的Trolox等同物(TE/L)。
统计
对于两种的组合，通过从两种化合物组合所得的平均ORAC值中减去单个化合物的平均ORAC值之和(等式1)计算差异：
差异=(组合ab)-(个体a+个体b)。(1)
同样地，3种和4种的组合，通过从组合中减去单独3种或4种化合物的平均值计算差异(等式2和3)。
差异=(组合abc)-(a+b+c)，(2)
差异=(组合abcd)-(a+b+c+d)。(3)
以这种方式显示结果允许利用SAS统计学软件包(SAS InstituteInc.,Cary,N.C.,U.S.A.)中的Fisher’s最小显著性差异(LSD)分析，容易地分辨处于最小相加的那些组合。
另外，对于3种和4种的组合，通过从所有3种或4种化合物组合所得的平均ORAC值中减去2种或3种的组合的平均ORAC值之和加上1个个体，计算差异(等式4和5)
差异=(组合abc)-(组合ab+个体c)(4)
差异=(组合abcd)-(组合abc+d)(5)
SAS用于利用估算统计确定组合的显著性，其考虑当数据被组合时的误差项。上述差异通过ORAC值的个体和组合结果的ANOVA进行比较，并形成差异，作为事后检验，以确定结合单个化合物和组合的效果。
结果和讨论
组合ORAC减去单个酚类ORAC值之和
图1显示了所有统计学上显著的组合的ORAC值，如按照等式1至等式3。组合橙皮苷/杨梅黄酮、橙皮苷/柚配基和橙皮苷/绿原酸在所试验的21种双向组合中具有统计学上协同ORAC值。显示显著差异的3种的组合为橙皮苷/绿原酸/柚配基、橙皮苷/杨梅黄酮/柚配基、橙皮苷/柚配基/藤黄菌素、橙皮苷/柚配基/对香豆酸和橙皮苷/柚配基/槲皮素。当4个个体值被减去后，4种的组合的ORAC值都是显著协同的。
逐步分析
当以逐步方式分析时(等式4)，3种的一些组合的值是显著的(图2)。例如，橙皮苷/绿原酸+柚配基、绿原酸/柚配基+橙皮苷和橙皮苷/柚配基+绿原酸都是显著协同的，所有都符合图1中橙皮苷/绿原酸/柚配基的显著结果。另外，我们发现结合橙皮苷/柚配基或添加任何第3种化合物至橙皮苷/柚配基总是显著正的。换言之，一种其他化合物表现出增加橙皮苷/柚配基的ORAC。
尽管明显正的结果在图1中示出，但与3种的组合相比，4种的组合的分析(等式5)显示4种的组合不具有显著更高的原始ORAC值(比较图1和3)。另外，如果该组合已经包括橙皮苷和柚配基，则添加第四种化合物几乎总是降低ORAC。添加柚配基至任何包含橙皮苷的组合总是显著增加ORAC，如2种和3种的组合中所发现的。在橙皮苷和柚配基已经在一起的情况，添加第四种化合物没有增加ORAC。第四种化合物表现出降低了橙皮苷/柚配基作为抗氧化剂对的性能或者对其没有影响。与相加组合相比(等式1，图1)，具有显著低于单个酚类之和的ORAC值的2+1和3+1组合主要包含杨梅黄酮或对香豆酸。
对抗相互作用
对抗相互作用在几个组合中是明显的。显示显著对抗作用的2种的仅有组合为杨梅黄酮/柚配基。在相加分析(等式2和等式3)中，3种或4种的组合不是显著对抗的。在(等式4和等式5)的逐步分析中，有几个统计学上显著的对抗相互作用(见图2和3)。杨梅黄酮为显示对抗相互作用的所有2+1组合的一部分。将橙皮苷加入杨梅黄酮/柚配基的对抗组合去除了组合中的对抗作用，相反产生了强协同作用。杨梅黄酮也存在于3+1组合对抗相互作用的5种中，尽管在其他四种对抗的3+1组合中没有明显模式。
5种或更多种的组合
总的来说，我们发现，当被结合时，2、3和4种化合物的几种组合显示显著协同作用。基于那些结果和所观察到的相互作用，我们预测与已经在3种的组合中获得的相比，更大的复杂性将不会具有显著更高的抗氧化能力。超过3种化合物水平的组合的复杂性增加没有增加组合的总ORAC(图1)。对于4种的组合，没有发现3种的组合已经没有发生的进一步相互作用。因此，对5种或更多种的组合没有进行进一步分析。
结构分析
尽管不被任何理论所限制，但认为酚类化合物的抗氧化能力由环结构上羟基基团的布置和数目决定，B环中的儿茶酚基团和C环中的2,3双键(见图4)为显示出与抗氧化能力非常相关的2个特征(Rice-Evans2001；Ami′c和其他人，2007)。这2种官能团也预测了还原电势，其将在对抗作用中讨论。藤黄菌素也具有B环中的儿茶酚基团和后者。基于这些官能团，我们制成了以下C环中的2,3双键并显示与从这些结果中的观察类似的结果：杨梅黄酮同时具有儿茶酚基团和杨梅黄酮。在另一方面，该2种化合物显示了其B环中的儿茶酚基团和其C环中的2，3双键。然而，的确是没有不相关结构特性的最强协同作用显示了改善抗氧化能力与抗氧化强度的强关系。柚配基和橙皮苷都不在这些实验中。实际上，显示显著的该化合物具有儿茶酚基团或2,3双键，还有存在于显示协同作用的所有组合中的化合物。此外，橙皮苷为苷，其已经显示进一步阻碍了分子的抗氧化能力(Di Majo和其他人，2005)。柚配基和橙皮苷为这些组合中具有最高浓度和最接近摩尔比率的2种化合物，这可解释它们明显的协同作用(Cuvelier和其他人，2000)。
已经产生了几种假设，以解释抗氧化剂组合的协同和对抗效果。Peyrat-Maillard和其他人(2003)描述了弱抗氧化剂和强抗氧化剂的组合，其中弱抗氧化剂可恢复(regenerate)强抗氧化剂，因此改善了组合的总体自由基抑制能力。在相似的情况下，对抗作用可通过强抗氧化剂恢复弱抗氧化剂，进而抑制自由基进行解释。这将降低组合的总抗氧化强度。在强抗氧化剂和另一个强抗氧化剂的组合中，2种化合物可相互恢复并因此提供总的抗氧化强度。其他给出的解释抗氧化剂相互作用的假设包括抗氧化剂的反应速度、相互作用分子的极性和在氧化位置上抗氧化剂的有效浓度(Frankel和其他人，1994；Koga和Terao，1995，Cuvelier和其他人，2000)。
还原电势
尽管不被任何理论所限制，但预期的相互作用也可通过利用酚类抗氧化剂的单电子还原电势在理论上确定(图4)。还原电势越低，分子越有可能给出其电子。也更有可能给出其电子给具有第二高E值的分子。这给由Peyrat-Maillard和其他人(2003)提供的解释增加了数量依据。基于这些还原电势(Jovanovic和其他人，1994；Foley和其他人，1999；
Figure BDA00001788855200151
和Skibsted，1998)，所使用的7种化合物可如下进行排序：杨梅黄酮>槲皮素>藤黄菌素>绿原酸>对香豆酸>橙皮苷>柚配基。在柚配基后添加由AAPH生成的过氧自由基(E=大约1V；Buettner 1993)。这将提示，在等摩尔浓度下，杨梅黄酮将总是给出其电子给(以再生)槲皮素，随后是藤黄菌素等，直至过氧自由基。然而，在脐橙的情况下，相对浓度具有显著的差异。也发现与分析的其他5种酚类化合物相比，具有最高还原电势的橙皮苷和柚配基处于显著更高的相对浓度。
在理论上，如果2个种类中的一种给出其电子给另一种，允许其更有效地清除由AAPH产生的过氧自由基，则2种的所有组合可为协同的。基于还原电势，给电子的等级顺序也是清楚的。例如，在橙皮苷和柚配基的组合中，橙皮苷将给电子到柚配基，柚配基将给予过氧自由基。然而，这不产生精确的预测。仅一些组合是显著的；而不是所有。
还原电势为单电子转移(SET)的量度，而ORAC分析反应机制基于氢原子转移(HAT)。遗憾地，对于酚类化合物没有可用的HAT的伏特量度。然而，最终结果仍然是相同的(Ou和其他人，2002)。在SET和HAT中，过氧自由基最终变为过氧化物，并且抗氧化剂失去电子，在其结构中产生弱反应的不成对电子。在两种机制中，电子必须被提取。在2种机制之间，酚类反应性的顺序可因此被假定是类似的。做出该假定，以便开发基于数量的模型。
模型
尽管不被任何理论所限制，但通过关注儿茶酚基团(或橙皮苷上的甲氧基儿茶酚基团)的存在或缺少、还原电势和相对浓度，可解释2种的协同(和对抗)组合。具有儿茶酚基团的酚类分子具有较低的还原电势并将更容易地给出它们的电子。如果较低相对浓度的具有儿茶酚基团的分子与不含有儿茶酚基团的分子组合，则电子给予被最小化。这就是杨梅黄酮/柚配基的情况。然而，对于杨梅黄酮/橙皮苷，该给电子却更有效，由于橙皮苷上的甲氧基儿茶酚基团，产生了协同作用(对于橙皮苷/绿原酸同样如此)，与B环上具有一个羟基基团的化合物相比，其更好地再生(recycle)。在橙皮苷/柚配基的情况，即使给电子无效(从儿茶酚至非儿茶酚)，也使浓度过大(橙皮苷以4×柚配基的浓度存在)，并且该组合是显著的。
有几个不适合该模型的组合。杨梅黄酮/槲皮素、藤黄菌素/槲皮素和杨梅黄酮/藤黄菌素都具有简单相加的ORAC，尽管每个都具有能在理论上给予其组合对的儿茶酚基团。结构的类似可使彼此的相互作用和电子给予无效，因为它们可在某种程度上简单地来回给电子，产生仅相加的ORAC。这些组合中的化合物似乎独立或相加地与过氧自由基相互作用，直到它们被破坏(环结构破裂)。
相同的模型也应用到3种的组合中。显著的所有组合包括橙皮苷和柚配基，尽管第3种化合物的添加增加了ORAC差异的幅度(图1)。尽管与橙皮苷或柚配基相比其浓度非常低，但具有较低还原电势的第三种化合物的添加增加了电子转移的效率或它们的保存，足以增加所得的ORAC值的大小。当比较橙皮苷/柚配基+第3种化合物时(图2)，在增加ORAC上，有利的顺序为藤黄菌素>槲皮素=绿原酸=对香豆酸>杨梅黄酮，这类似于浓度(表1)，尽管不是以上讨论的还原电势顺序(杨梅黄酮>槲皮素>藤黄菌素>绿原酸>对香豆酸)。在该情况下，浓度比官能团或电子给予的效率更重要。
对于4种的组合，添加第四种化合物(图3)降低了很多组合的效率，协同作用仅存在于将柚配基加入包含橙皮苷的组合中的那些组合。在橙皮苷和柚配基已经在3种的组中的情况，添加第四种化合物没有作用或为对抗的。它们似乎不适合上述儿茶酚基团/还原电势/浓度模型。与3种、4种、2+1种和3+1种的组合的协同结果数量级相比，显著对抗的结果的数量级都是小的。有可能第四种化合物降低了3种的强基团之间电子转移效率。这将解释所有的对抗组合。
该实施例的结论
发现我们的假设是真的，即在脐橙中发现的浓度和比率下，在酚类化合物之间将发生协同相互作用。在柚配基和橙皮苷之间的相互作用提供了大部分的协同作用，同时第3种化合物的添加增强了那种协同作用。与3种的组合相比，第四种化合物的添加没有显著增加ORAC的数量级。一起分析(1)官能团、(2)还原电势和(3)相对浓度最好地解释了协同和对抗相互作用。这些协同酚类相互作用具有保存食物或饮料的潜在应用。
实施例2
橙子中发现的协同植物化学物质组合
添加物组合基于来源于如实施例1中说明的过程的数据而制备。
在表2中示出了脐橙中发现的植物化学物质的强组合。同样，为了比较，所包括的是目前因为它们的高ORAC值而销售的两种产品。该表是从每克最高ORAC至最低排序的。
表中最有价值的组合为橙皮苷/柚配基/对香豆酸/槲皮素，因为它们一起显示了29％协同作用，并且都是容易低成本获得的，如表3所示。
显示协同作用的组合具有使添加物的质量和抗氧化效力显著改善的潜力。不是随机简单结合单个水果或形成具有未知毒性的浓缩提取物，而是数据说明了水果提供的配给量的效力，同时提供非常有效和安全的剂量。
例如：在添加物中使用1克抗氧化剂混合物将等同大约3000g或6lbs橙子。这对于消费是不现实的并且可能是不安全的。包含大约该量的三分之一的胶囊保守地代表一天能消耗的水果量，确保了这种数量的安全性，同时仍然提供优异的协同抗氧化保护。胶囊也将提供方便性、比能以水果形式合理消耗更多的抗氧化剂、长保质期和使公司立足于该产品。
表2
Figure BDA00001788855200171
Figure BDA00001788855200181
表3
来自化学品供应商Sigma的目前的零售成本：
  化合物   $   数量   每mg
  绿原酸   281.50   5g   0.0563
  橙皮苷   127.50   100g   0.00128
  藤黄菌素   281.50   50mg   5.63
  杨梅黄酮   293.00   100mg   2.93
  柚配基   161.50   25g   0.00646
  对香豆酸   68.5   25g   0.00274
  槲皮素   155   100g   0.00155
实施例3
草莓中发现的酚类化合物的协同和对抗相互作用
利用氧自由基吸收能力(ORAC)分析，测试草莓中发现的相对浓度下的七种酚类化合物大部分糖苷配基的相互作用。发生在更简单的组合中的相互作用在更复杂组合中探讨。开发模型以解释为什么发生相互作用。在两种酚类化合物的三种组合中和三种酚类化合物的五种组合中观察到统计学上显著的协同作用。在两种酚类化合物的两种组合中和三种化合物的一种组合中观察到统计学上显著的对抗作用。包括还原电势、相对浓度和儿茶酚(邻二羟基苯)基团的存在或缺少的模型解释了该结果。该实施例说明了可发生在草莓酚类化合物的结构内的复杂环境中的某些相互作用。对于基于食物的抗氧化剂比率发现的协同作用表明草莓具有优化的自由基保护；这可应用于食物保存。
植物产生酚类化合物以作为细胞信号传导分子、抗氧化剂或侵袭害虫的毒药而起作用(Crazier等，2006)。这些酚类化合物中的很多都存在于水果中，并且它们已经被广泛表征(Robards等，1999；Franke等，2004；Harnly等，2006)。该特征在一定程度上是由于这些化合物的高抗氧化能力而产生。
草莓是酚类化合物的良好来源(Aaby等，2005)，每100g鲜重大约290mg五倍子酸等同物的总酚类含量。它们包含多种酚类化合物，包括花青素和天竺葵色素苷、鞣花酸(包括苷和鞣酸形式)、儿茶酸、原花青素、肉桂酸衍生物和黄酮醇。原始草莓的氧自由基吸收能力(ORAC)为每g鲜重35μmol生育酚等同物(TE)(2007USDA ORAC数据库)，其低于蓝莓和木莓，但高于橙子或香蕉。
假设通过以草莓中发现的浓度制备各个酚类抗氧化剂(在多数情况下利用糖苷配基)，可发现该组合具有在草莓环境内显示的协同作用。通过主要使用糖苷配基，可以考察先前研究的类黄酮的结构元素以开发解释所观察结果的模型。尽管这将限制对真正水果的结果的推断，但其将有助于形成开发优化水果源抗氧化防腐剂的依据，如已经用提取物所探讨的。利用氧自由基吸收能力(ORAC)，分析在草莓中发现的七种酚类化合物之间的复杂相互作用，并且开发模型以解释该结果。
材料和方法
化学品
从Sigma Chemical Co(St.Louis,MO,USA)获得氯化花青素(纯度：95％)、对香豆酸(98％)、(+)-儿茶酸(96％)、槲皮素-3-葡萄糖苷(90％)、莰非醇(96％)、鞣花酸(96％)、氯化天竺葵色素苷(95％)和荧光素二钠盐。从Fischer Scientific(Pittsburg,PA,USA)获得Trolox(6-羟基-2,5,7,8-四甲基-2-羧酸)、氢氧化钠(50％溶液)、K2HPO4和KH2PO4和Corning Costar96孔黑边透明平板，并且从Wako Chemical USA(Richmond,VA,USA)获得2,2’-偶氮二(2-异丁基脒)二盐酸(AAPH)。
化学物质制备
表4显示了如栽培草莓中发现的所研究七种化合物的浓度。图5提供结构。基于草莓中最高平均浓度，选择化合物。所用浓度从先前公布的(2007USDA类黄酮数据库；Zhao，2007)草莓酚类的绝对浓度中选择，假定苷完全水解(尽管不是鞣酸)，以便于以后的模拟。假定1g水果浓汤的体积为1ml，用于样品制备，因为密度调整将不改变被试验的相对浓度。除鞣花酸外，所有化合物被称重，随后溶解于甲醇。鞣花酸被称重并溶解于被加热的甲醇和1M氢氧化钠的4:1混合物，因为其在碱性溶液中仅在可称重的浓度下完全可溶。酚类储液在-20℃下被保存为1ml等份。酚类被拿到RT，涡动搅拌，并稀释于7:3(v:v)丙酮:水中，以匹配表4中的水果浓度。为了适合Trolox标准曲线(见以下的分析描述)，在转移至96孔平板前，化合物被进一步稀释于7:3(v:v)丙酮:水中至以下摩尔浓度：对香豆酸，9.99μΜ；花青素，3.04μΜ；儿茶酸，4.58μΜ；槲皮素-3-葡萄糖苷，2.45μΜ；莰非醇，1.61μΜ；天竺葵色素苷，5.10μΜ；鞣花酸，15.4μΜ。在解冻和稀释后检测溶解度。在黑暗条件下进行涉及酚类化合物、荧光素和Trolox的所有工作，以最小化降解。
表4
所研究的草莓酚类化合物的浓度。
  化合物   mg/100g鲜重a
  对香豆酸   4.10b
  花青素   1.96c
  (+)-儿茶酸   3.32c
  槲皮素-3-葡萄糖苷   1.14d
  莰非醇   0.46c
  天竺葵色素苷   31.3c
  鞣花酸   46.5d
a未进行密度调整；假定100g在体积上为100ml制备化合物，因为ORAC分析仅评估相对比率。b由Zhao(2007)报告的最大量。c2007USDA类黄酮数据库。d由2007USDA类黄酮数据库和Zhao(2007)报告的平均值。
混合物
两种化合物所有可能的组合在以表4中提供的浓度制备后，基于相等的体积混合，以确保维持相对浓度。混合物随后被进一步稀释，以匹配最低单个化合物摩尔浓度，以便适合Trolox标准曲线。在确定ORAC并完成统计学分析后，两种化合物的头三种统计学上的协同组合与所有可能的第3种化合物相结合并同样进行分析。对于四种化合物的组合：三种化合物的头三种协同组合与所有可能的第四种化合物相结合，重复相同的模式。对于四种的组合，在抗氧化能力上没有发现统计学上的显著增加。因此不试验5种或6种的组合，尽管分析了组合中的所有七种化合物。在它们的ORAC分析的同一天制备组合。
氧自由基吸收能力(ORAC)分析
利用BiotekSynergy 2平板读数器(BioTek Instruments,Inc.,Winooski,VT,USA)，根据Davalos等(2004)，做一些修改，进行ORAC分析。反应在75mM磷酸盐缓冲液(pH 7.1)中进行，并且最终的分析混合物(200μL)包含荧光素(120μL，70.3nM终浓度)作为可氧化基质，AAPH(60μL，12mM终浓度)作为氧自由基发生器，并包含抗氧化剂(20μL，Trolox[1-8μΜ，最终浓度]或样品)。分析的参数如下：读数器温度：37℃，循环数，120；循环时间，60秒；振荡模式，在每个循环前3秒轨道式震荡。使用具有485/20nm激发波长和520/20nm发射波长的荧光过滤器。以镜像方式，基于计划好的布局，在96孔平板中制备样品。每一镜像一式两份被平均并被看做一个数据点。所有样品一式四份进行测量(总共八孔)，以获得必要的统计学效力。数据被表示为每升溶液Trolox等同物(TE)的微摩尔量。利用Microsoft Excel2007(Microsoft,Redmond,WA,USA)电子数据表分析数据，以确定曲线下的面积并基于Trolox标准曲线将数据转化为Trolox等同物。
统计
对于两种的组合，通过从两种化合物的组合所得的平均ORAC值减去单个化合物平均ORAC值之和，计算差异(等式6)。
差异=(组合ab)-(个体a+个体b)(6)
同样地，对于三种和四种的组合，通过从组合中减去单独三种或四种化合物的平均值计算差异。以这种方式显示结果允许我们容易利用统计学分析统计学软件包(9.1版,SAS Institute Inc.,Cary,NC,USA)中的混合模型ANOVA估算，分辨组合是大于还是小于其部分之和。
另外，对于三种和四种的组合，通过从所有三种或四种化合物的组合所得的平均ORAC值减去两种或三种的组合的平均ORAC值之和加一个个体，计算差异(等式7和8)。
差异=(组合abc)-(组合ab+个体c)  (7)
差异=(组合abcd)-(组合abc+d)  (8)
SAS用于利用混合模型ANOVA估算确定组合的显著性，其考虑当数据被组合时的误差项。上述差异通过ORAC值的个体和组合结果的ANOVA在SAS中进行比较，并形成差异，作为事后检验，以确定结合单个化合物和组合的效果。
该实施例的结果和讨论
化合物和组合选择
我们选择的七种化合物不代表草莓中所有的酚类化合物，但代表那些最高浓缩的和商业可得的选择。我们选择的量代表多种研究(Aaby等，2005；2007USDA类黄酮数据库；Zhao，2007)和假定苷完全水解的最大数量(尽管在鞣花酸的情况不是鞣酸，并且除槲皮素-3-葡萄糖苷外)。这不必反映消化道中反应的总可用性(Halliwell等，2000)，因为草莓中酚类化合物的大部分将作为苷消耗，酶活性、消化因子和可同时存在的其他食物将影响该相互作用。其代表经过很多季节的草莓中发现的平均分析量并在多个实验室中被探究。草莓来源为被探究的化学提供了结构。
评估在一个时间向组合添加一种化合物允许我们确定何时停止，即，因为四种的3+1组合没有比三种的2+1组合更显著，我们可预测五种的4+1组合也将不再比三种的组合更显著。为了证实该预测，我们一起试验了所有七种化合物的组合(11045±458μmol TE/L)。ORAC值的数量级不大于四种的组合所发现的ORAC值数量级。
相加和逐步分析
两种的统计学上显著组合的ORAC在表5中示出。利用针对两种、三种和四种的所有组合的等式6或其等同式进行统计学方法；仅发现两种的组合的统计学上显著的结果，其被包括在图中。两种、三种或四种的所有其他组合是不显著的并被认为是相加的。在逐步分析中(等式7和8)，除包括在表5中的那些外，三种和四种的所有组合都是相加的。
酚类结构
结构是抗氧化剂潜力的重要决定因素(Rice-Evans等，1996)。B环中的邻二羟基基团(儿茶酚结构)允许针对自由基形式的更大稳定性和参与电子的移位(图5)。C环中结合4氧代的2,3双键以及A和C环中具有4氧代功能的3-和5-OH基团对最大自由基抑制潜力是必要的。羟基化的程度对抗氧化活性也是重要的。
表5
酚类化合物统计学上显著组合的平均ORAC差异a
  组合b   ORAC差异c   标准误差   p-值d
  PcCa   531   205   0.01
  PcQu   521   239   0.03
  PcPe   -883   219   <0.01
  CyQu   513   239   0.03
  CyPe   -868   219   <0.01
  PcCa+Pe   -976.6   282   0.001
  PcPe+Qu   1333   305   <.0001
  CyPe+Qu   1027   305   <.0001
  CyEl+Qu   636.7   305   0.04
  QuEl+Pc   849.4   299   0.01
  QuEl+Cy   747.5   299   0.01
a根据统计学分析的等式6计算两种的组合。根据等式7计算三种的组合。为了简单起见，假定非显著性组合是相加的且不包括在表内。bPc-对香豆酸，Cy-花青素，Ca-(+)-儿茶酸，Qu-槲皮素-3-葡萄糖苷，Ka-莰非醇，Pe-天竺葵色素苷，El-鞣花酸。c利用混合模型ANOVA估算，数值被认为是显著的，p<0.05。d以μmol TE/L为单位报告。
已经形成了几种假设，以解释抗氧化剂组合的协同和对抗效果。Peyrat-Maillard等人(2003)提出，与其他因子一起，组合中的某些抗氧化剂以恢复的方式起作用，较强或较弱的抗氧化剂恢复另一个。如果较弱抗氧化剂正在恢复较强抗氧化剂，则这可具有总体正(协同)作用，或如果相反的情况发生，则这可具有总体负(对抗)作用。其他给出的解释抗氧化剂相互作用的假设包括抗氧化剂的反应速度、相互作用的分子的极性和在氧化位置上抗氧化剂的有效浓度(Frankel等人，1994；Koga和Terao 1995，Cuvelier等人，2000)。
还原电势
预期的相互作用也可通过利用酚类抗氧化剂的单电子还原电势在理论上被确定。还原电势越低，分子越有可能给出其电子。也更有可能给出其电子到具有第二高E值的分子。这将对由Peyrat-Maillard等(2003)提供的解释加入数量依据。基于可用的公布的还原电势(
Figure BDA00001788855200231
& Skibsted，1998；Foley等，1999)，所使用的7种化合物可如下进行排序：花青素>鞣花酸>槲皮素-3-葡萄糖苷(槲皮素为0.29V；芸香苷、二葡萄糖苷为0.4V)>儿茶酸(0.36V)>天竺葵色素苷>莰非醇(0.39V)>对香豆酸(0.59V)。没有发现花青素、鞣花酸或天竺葵色素苷公布的还原电势。它们基于预测还原电势的结构成分进行排序。
在对香豆酸后面添加由AAPH生成的过氧自由基(E=~1V；Buettner，1993)。这将表明，在等摩尔浓度下，花青素将总是给出其电子给(以再生)鞣花酸，随后是槲皮素-3-葡萄糖苷等，直至过氧自由基。然而，利用草莓酚类浓度，相对浓度具有显著的差异。与分析的其他五种酚类化合物相比，发现鞣花酸和天竺葵色素苷处于显著更高的相对浓度。
在理论上，如果2个种类中的一种给出其电子给另一种，则两种的所有组合可为协同的，允许其更有效地清除由AAPH产生的过氧自由基。基于还原电势，给电子的等级顺序也是清楚的。例如，在莰非醇和对香豆酸的组合中，莰非醇将给电子到对香豆酸，对香豆酸将给予过氧自由基。然而，这不产生精确的预测。仅一些组合是显著的；不是所有。
还原电势为单电子转移(SET)的量度，而ORAC分析反应机制基于氢原子转移(HAT)。遗憾地，对于酚类化合物没有可用的HAT的伏特量度。然而，最终结果仍然是相同的(Ou等，2002)。在SET和HAT中，过氧自由基最终变为过氧化物，并且抗氧化剂失去电子，在其结构中产生弱反应的不成对电子。在两种机制中，电子必须被提取。在2种机制之间，酚类反应性的顺序可因此被假定是类似的。做出该假定，以便开发基于数量的模型。
模型
虽然不被任何特定的理论所限制，但认为结合三种因子：相对浓度、还原电势和儿茶酚基团的存在或缺少，开发模型以解释该结果。以以下浓度顺序制备所选的酚类：鞣花酸>天竺葵色素苷>对香豆酸>儿茶酸>花青素>槲皮素-3-葡萄糖苷>莰非醇(见表4)。
单电子还原电势使它们处于该顺序：花青素≥鞣花酸>槲皮素-3-葡萄糖苷>儿茶酸>天竺葵色素苷>莰非醇>对香豆酸。
七种化合物的四种包含儿茶酚基团：鞣花酸、花青素、儿茶酸、槲皮素-3-葡萄糖苷。
对于那些统计学上显著的两种组合而言(表4)，对香豆酸比儿茶酸更浓。具有儿茶酚基团和较低还原电势的儿茶酸是强电子供体并且有助于再生更浓的对香豆酸，产生协同。对香豆酸和槲皮素-3-葡萄糖苷类似地相互作用。花青素和槲皮素-3-葡萄糖苷都包含儿茶酚基团；花青素以相似的浓度存在，并且两者都包含儿茶酚基团，形成了协同结果的环境，类似于花青素重复利用槲皮素-3-葡萄糖苷(基于还原电势)。在对抗方面，与天竺葵色素苷相结合的对香豆酸说明了儿茶酚基团的重要性。没有它，天竺葵色素苷不是有效的对香豆酸再生者(其基于还原电势所预期)，并且具有天竺葵色素苷的大得多的浓度，对香豆酸的存在似乎破坏了天竺葵色素苷的抗氧化活性，或许是通过使电子移开而不是将它们如容易地给予AAPH自由基那样给出它们。这表明天竺葵色素苷的E值可接近于对香豆酸的E值。最后，花青素和天竺葵色素苷也对抗地相互作用。基于花青素的儿茶酚基团和还原电势，协同作用将是预期的。结构的类似或相对浓度差异可解释该对抗作用；该相互作用不适合该模型，但在三种和四种的组合中持续存在。此外，所假定的E值顺序可能不正确。
对于三种的组合，对相加组合没有发现统计学上协同或对抗结果(根据等式6)。然而，当以逐步方式进行分析时(等式7)，显著的结果可通过上述模型进行解释。对于槲皮素-3-葡萄糖苷/鞣花酸+对香豆酸而言，当添加对香豆酸时，具有儿茶酚基团和较低E值的两种化合物变得更加协同。这类似于对香豆酸/(+)-儿茶酸和对香豆酸/槲皮素-3-葡萄糖苷发生的。对于槲皮素-3-葡萄糖苷/鞣花酸+花青素和花青素/鞣花酸+槲皮素-3-葡萄糖苷而言，添加另一个包含儿茶酚基团的低E值化合物增强了组合的协同作用。对于对香豆酸/天竺葵色素苷+槲皮素-3-葡萄糖苷而言，具有儿茶酚基团的较低E-值槲皮素-3-葡萄糖苷显著提高了其他两种化合物的单一羟基基团抗氧化效率。最后，对于花青素/天竺葵色素苷+槲皮素-3-葡萄糖苷而言，使可用的儿茶酚基团(具有相似浓度的槲皮素-3-葡萄糖苷和花青素)几乎加倍对花青素/天竺葵色素苷组合提供了显著的促进。
在对抗方面，一种组合是显著的：对香豆酸/儿茶酸+天竺葵色素苷。在该情况，对于儿茶酸给电子给对香豆酸发现的显著协同作用(见表5)由于天竺葵色素苷的高浓度和其儿茶酚基团的缺少所破坏。这最小化了儿茶酸的有效性并产生对抗作用。
对于四种的组合(数据未示出)，尽管在相加或逐步分析中没有数值是显著的，但该趋势遵照相同的模式并由模型进行解释。例如，对香豆酸/(+)-儿茶酸/槲皮素-3-葡萄糖苷+鞣花酸、对香豆酸/(+)-儿茶酸/天竺葵色素苷+槲皮素-3-葡萄糖苷和花青素/槲皮素-3-葡萄糖苷/莰非醇+鞣花酸都具有正ORAC值，并且都由含儿茶酚和不含儿茶酚的化合物组成，所述化合物按照它们的还原电势可相互给予电子。两种组合具有相对高的对抗ORAC值，对香豆酸/花青素/槲皮素-3-葡萄糖苷+天竺葵色素苷和对香豆酸/槲皮素-3-葡萄糖苷/天竺葵色素苷+花青素。在这些情况，更高相对浓度的儿茶酚缺少的较低还原电势天竺葵色素苷减小了这些组合的抗氧化能力。
其他考虑因素
一种可能的考虑是pH对花色素的影响(Delgado-Vargas等，2000)，包括花色素中的两种，花青素和天竺葵色素苷。花色素在pH为2时最稳定。当pH增加时，花色素更容易与水反应，失去它们的颜色并转化为查耳酮。光增加了降解，并且其他酚类化合物的存在减慢了花色素的降解。在目前的实施例中，化合物被溶解在甲醇中，因此不存在水，在黑暗中进行所有步骤，并且当溶液被添加到水性ORAC混合物中时，反应在一小时内完成。Osmani等(2009)发现在一小时后，在pH 7的缓冲液中，花青素葡萄糖苷保持了它们原始颜色的70％。因此有可能发生花青素和天竺葵色素苷的某些降解，尽管这被尽可能最小化。另一考虑是在酚类化合物之间复杂形成物的可能性(Hidalgo等，2010)。这些相互作用的可能性或它们对目前结果的影响不能不考虑，因为任何可能已经形成的都未被直接测量。无论如何，如果这种复合物真的形成并且有助于协同或对抗结果，则如果该组合被消耗或用作防腐剂，相同的结果可能是预期的，尽管可能由于这些环境中其他化学物质的存在被减小或提高。
在利用正确确定协同作用或对抗作用的统计学分析时，当化合物被加入后标准误差变大，使其越来越难于在取样误差内显示协同作用。这将解释为什么即使是潜在协同的组合(在四种的组合中)在统计学上也是不显著的。在该实施例中，仅评估了七种化合物，并且焦点主要在糖苷配基上。可扩大分析例如至多个所包括化合物的几个苷形式(例如天竺葵色素苷和花青素苷)、其他儿茶酸衍生物(表儿茶酸等)、其他肉桂酸衍生物以及黄酮醇和鞣花单宁。Bravo(1998)推断，苷形式具有显著较小的抗氧化活性。通过主要使用糖苷配基，可检验核心酚结构的结构元素。这使其可能利用类黄酮化学开发模型以解释观察到的结果，而不阻碍用于模型的儿茶酚基团。这将限制对真正水果的结果的推断，尽管其确实建立了开发优化水果源抗氧化防腐剂的依据。
该实施例的结论
我们的结果显示，尽管大多数被分析的相互作用是相加的，但某些显示了显著的协同作用，其他显示显著的对抗作用。考虑还原电势、相对浓度和儿茶酚基团的存在或缺乏的模型解释了几乎所有这些结果。这提高了对可发生在复杂环境中的某些相互作用的理解，对更好理解组合可能的益处例如对于食物保存的益处迈出了重要一步。
实施例4
草莓中发现的协同植物化学物质组合
以下表6显示了草莓中发现的植物化学物质的组合。同样，为了比较，所包括的是各个抗氧化剂和因为它们的高ORAC值而目前销售的四种产品。表6是从最高ORAC至最低排序的。值基于每克。
最有价值的组合为对香豆酸和儿茶酸，因为它们给出了良好结果，并且都是以低成本容易获得的。天竺葵色素苷和槲皮素-3-葡萄糖苷更贵，但可以以显著较低的成本更大量获得。预期与槲皮素-3-葡萄糖苷相比具有类似或更好结果的槲皮素是便宜的。
在此显示协同作用的组合具有使添加物的质量和抗氧化效力显著改善的潜力。不是随机简单结合单个水果或制作具有未知毒性的经浓缩的提取物，同时提供非常有效和安全的剂量。
例如：在添加物中使用总共1克抗氧化剂将相当于大约1000g或2.2lbs草莓。这对于消费是不现实的，但是包含大约该量一半的胶囊代表一天能消耗的水果量，确保了这种数量的安全性。胶囊也将提供方便性、长保质期和使公司立足于该产品。
表6
Figure BDA00001788855200281
表7
来自化学品供应商Sigma的目前的零售成本：
  化合物   $   数量   每mg
  儿茶酸   300   50g   0.006
  槲皮素(糖苷配基)   155   100g   0.00155
  槲皮素-3-葡萄糖苷   98   50mg   1.96
  对香豆酸   68.5   25g   0.00274
  莰非醇   763   500mg   1.526
  花青素   54   1mg   54
  天竺葵色素苷   131   10mg   13.1
  鞣花酸   362   25g   0.01448
实施例5
蓝莓(越橘属青液果亚属(Vaccinium cyanococcus))中发现的水果比率的抗氧化剂的协同潜力
蓝莓是抗氧化剂的丰富来源，其被认为预防癌症并保护心脏。全果(整果，whole fruit)提供可能相互作用的复杂多种的抗氧化剂，但这些相互作用还没有很好地进行研究，特别是在全果中。
利用氧自由基吸收能力(ORAC)分析，发现单个蓝莓酚类化合物和这些化合物组合的抗氧化能力。
该过程类似于分别针对橙子和草莓的实施例1和3中描述的那些。选择蓝莓中发现的四种酚类化合物：绿原酸(C)、槲皮素(Q)、杨梅黄酮(Y)和锦葵色素(M)，并且对四种单个化合物进行ORAC分析(见图6)。在大约1:1比率和水果比率下对四种化合物的组合进行ORAC分析。图7中示出的是与基于每种化合物相加效果所预期的值的结果。较高的值表明了协同作用，较低的值表明了对抗作用。
ORAC分析测量了抗氧化剂或抗氧化剂混合物保护荧光素不被降解。统计学分析估算了组合的平均和标准误差减去单个化合物的抗氧化能力(见图6)。
参考图7，在绿原酸和锦葵色素的组合和杨梅黄酮和槲皮素之间发现潜在的协同作用。进一步分析也包括锦葵色素、儿茶酸、绿原酸、槲皮素和杨梅黄酮的三种和四种的组合，但在此没有示出。然而，在很多这些天然产生的蓝莓抗氧化剂之间发现显著的协同作用。当化合物以1:1比率结合时，没有发现该协同作用。
根据该数据，显示酚类化合物结合的比率对组合是显示协同作用还是对抗作用是重要的。另外，植物有可能已经产生协同比率，以便更有效地与来自代谢和UV暴露的自由基损害对抗。
实施例6
蓝莓中发现的协同植物化学物质组合
利用如实施例1中的基本上相同的过程，在蓝莓中获得化合物组合的ORAC值。
在表8示出的是蓝莓中发现的植物化学物质的最强组合。除非另有说明，数值代表水果中发现的比率。该表从最高百分比协同至最低百分比协同排序。数值基于每mmol的酚类化合物。
最显著的组合是儿茶酸/绿原酸/锦葵色素/杨梅黄酮，尽管锦葵色素目前非常贵。不包含锦葵色素的最协同组合为以1:1比率的绿原酸/杨梅黄酮。在天然蓝莓比率下不包含锦葵色素的最显著的组合是儿茶酸/绿原酸/槲皮素。
我们的研究已经论证的组合显示了协同作用具有显著改善添加物的质量和抗氧化效力的潜力。我们的数据说明水果和水果抗氧化剂提供的效力，但不是随机简单结合单个水果或形成具有未知毒性的浓缩的提取物。
表8
Figure BDA00001788855200301
Figure BDA00001788855200311

Claims (10)

1.一种确定具有协同抗氧化能力的营养添加物的组成的方法，包括：
(a)识别食物中的抗氧化化合物；
(b)测量所述食物中识别的至少两种所述抗氧化化合物的食物比率，所述食物比率为所述至少两种化合物的一个与另一个之间的比率；
(c)测量所述至少两种抗氧化化合物的抗氧化能力；
(d)以它们的食物比率，形成所述至少两种抗氧化化合物的混合物；
(e)测量所述混合物的抗氧化能力；
(f)通过将所述混合物的抗氧化能力与基于所述混合物中所述抗氧化化合物的单独抗氧化能力值之和所预期的抗氧化能力相比较，确定所述混合物是否具有协同抗氧化性质，当所述抗氧化能力大于所述预期的抗氧化能力时显示协同作用。
2.根据权利要求1所述的方法，另外包括：
在所述至少两种抗氧化化合物的至少一种是不同的情况下，对于识别的至少两种抗氧化化合物重复(b)、(c)、(d)、(e)和(f)。
3.根据权利要求1所述的方法，其中四种或更多种抗氧化化合物被识别，并且所述混合物包括至少三种所述抗氧化化合物的组合。
4.根据权利要求2所述的方法，其中至少三种抗氧化化合物被识别，并且对于两种或三种抗氧化化合物的可能组合的另外混合物进行所述重复。
5.根据权利要求4所述的方法，其中对于两种或三种抗氧化化合物的所有可能混合物进行所述重复。
6.一种包括抗氧化化合物的营养添加物，所述抗氧化化合物基本上由两种或三种抗氧化化合物以提供协同抗氧化性质的相互比率组成。
7.根据权利要求6所述的营养添加物，其中所述两种或三种抗氧化化合物为由如下确定的相互比率：
(a)识别食物中的抗氧化化合物；
(b)测量所述食物中识别的至少两种所述抗氧化化合物的食物比率，所述食物比率为所述至少两种化合物的一个与另一个之间的比率；
(c)测量所述至少两种抗氧化化合物的抗氧化能力；
(d)以它们的食物比率，形成所述至少两种抗氧化化合物的混合物；
(e)测量所述混合物的抗氧化能力；
(f)通过将所述混合物的抗氧化能力与基于所述混合物中所述抗氧化化合物的单独抗氧化能力值之和所预期的抗氧化能力相比较，确定所述混合物是否具有协同抗氧化性质，当所述抗氧化能力大于所述预期的抗氧化能力时显示协同作用。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述食物为水果。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述抗氧化能力由以下测量：
氧自由基吸收能力分析(ORAC)、
过亚硝酸盐ORAC分析(NORAC)、
羟基ORAC分析(HORAC)、
氧自由基吸收能力连苯三酚红分析(ORAC-PG)、
2,2-二苯基-1-苦基肼基自由基分析(DPPH)、
血浆的三价铁还原能力分析(FRAP)、
Trolox等同物抗氧化能力分析(TEAC)、
维生素C等同物抗氧化能力分析(VCEAC)、
2’-连氮基双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)分析(ABTS)、
二价铜还原抗氧化能力分析(CUPRAC)、
总自由基捕获抗氧化参数分析(TRAP)或
细胞抗氧化活性分析(CAA)。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述抗氧化能力通过ORAC测量。
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